Name: In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Scopri un approccio genetico avanzato per identificare geni neuroprotettivi in Drosophila melanogaster. Questo metodo utilizza climbing assay e analisi istologica per studiare neurodegenerazione e potenziali terapie.

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Siamo particolarmente grati al Dr. Barry Ganetzky, in chi è stato eseguito il laboratorio dello schermo genetico, permettendo l'identificazione e la caratterizzazione del marmocchio come gene neuroprotettivo. Ringraziamo il Dr. Steven Robinow per aver gentilmente fornito la raccolta di mosche ENU-mutagenized utilizzati nella schermata genetica presentata in questo articolo. Ringraziamo i membri del laboratorio Ganetzky, i dottori Grace Boekhoff-Falk e David Wassarman per le discussioni utili per tutta la durata di questo progetto, Ling Ling Ho e Bob Kreber per l'assistenza tecnica, il Dr. Aki Ikeda per l'uso della sua struttura microtoma presso il Dell'Università del Wisconsin e il Dr. Kim Lackey e lo Optical Analysis Facility presso l'Università dell'Alabama.

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Gli schermi genetici in avanti nella Drosophila sono stati un approccio efficace per identificare i geni coinvolti in diversi processi biologici, tra cui la neuroprotezione dipendente dall'età5,23,24, 25. Utilizzando questa strategia, siamo riusciti a identificare il moccioso come un nuovo gene neuroprotettivo17.
Un passaggio...

I neuroni sono per la maggior parte post-mitotici e incapaci di dividere1,2. Nella maggior parte degli animali, esistono meccanismi neuroprotettivi per mantenere queste cellule per tutta la durata della vita dell'organismo, soprattutto in età avanzata quando i neuroni sono più vulnerabili ai danni. I geni alla base di questi meccanismi possono essere identificati in mutanti che presentano neurodegenerazione, un indicatore fenotipipico per la perdita di neuroprotezione, utilizzando un protocollo genetico in avanti. Gli schermi genetici in avanti che utilizzano mutageni chimici come il metaesonte etilare (EMS) o N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) sono particolarmente utili a causa delle mutazioni casuali che inducono, con conseguente un approccio intrinsecamente imparziale che ha fatto luce numerose funzioni geniche negli organismi del modello eucariotico3,4,5 (al contrario, la mutagenesi a raggi X crea rotture del DNA e può provocare riarrangiamento piuttosto che mutazioni puntiformi6).
Il comune filo della frutta Drosophila melanogaster è un soggetto ideale per questi schermi grazie alla sua alta qualità, sequenza genomica ben annotata, la sua lunga storia come organismo modello con strumenti genetici altamente sviluppati, e più significativamente, la sua comune storia evolutiva con gli esseri umani7,8. Un fattore limitante nell'applicabilità di questo protocollo è la letalità precoce causata dai geni mutati, che impedirebbe i test ai9anni . Tuttavia, per le mutazioni non letali, un saggio di arrampicata, che sfrutta il geotassi negativo, è un metodo semplice, anche se esteso, per quantificare il funzionamento motorio alterato10. Per mostrare una sufficiente reattività locomotoria, le mosche dipendono dalle funzioni neurali per determinare la direzione, percepire la sua posizione e coordinare il movimento. L'incapacità delle mosche di salire sufficientemente in risposta agli stimoli può quindi indicare difetti neurologici11. Una volta identificato un particolare fenotipo dell'arrampicata difettosa, ulteriori test utilizzando uno schermo secondario come l'analisi istologica del tessuto cerebrale, possono essere utilizzati per identificare la neurodegenerazione nelle mosche difettose dell'arrampicata. La successiva mappatura genica può quindi essere utilizzata per rivelare la regione genomica sul cromosoma che porta il gene neuroprotettivo difettoso di interesse. Per restringere la regione cromosomica di interesse, è possibile eseguire la mappatura meiotica utilizzando linee di mosca mutanti che trasportano geni marcatori dominanti con posizioni note sul cromosoma. I geni marcatori fungono da punto di riferimento per la mutazione, poiché la frequenza di ricombinazione tra due loci fornisce una distanza misurabile che può essere utilizzata per mappare la posizione approssimativa di un gene. Infine, l'attraversamento delle linee mutanti con linee che trasportano carenze equilibrate sulla regione cromosomica meioticamente mappata crea un test di complemento in cui il gene di interesse può essere verificato se il suo fenotipo noto è espresso5. Le sequenze di nucleotidi polimorfici nel gene identificato, eventualmente risultanti in sequenze di amminoacidi alterate, possono essere valutate sequenziando il gene e confrontandolo con la sequenza del genoma della Drosophila. La successiva caratterizzazione del gene di interesse può includere test di ulteriori alleli mutanti, esperimenti di salvataggio delle mutazioni e l'esame di fenotipi aggiuntivi.

<table><tbody><tr><td>Attrezzatura principale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cappa aspirante per istologia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Nikon</td><td>Eclipe E100</td><td>L'obiettivo preferito per l'imaging è il software di imaging 20x</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Fotocamera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fly saggio di spinta e arrampicata</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Fiala di Drosophila, stretta</td><td>VWR</td><td>75813-160</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Nastro per etichettatura da laboratorio per uso generico</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr>Tappetino <td></td><td></td><td></td><td>per mouse standard</td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Motic</td><td></td><td>Modello SMZ-168</td></tr><tr><td>Stazione per anestesia CO2 (pistola di soffiaggio, valvola di fondo, Ultimate Flypad)</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104, 59-121, 59-172</td><td> t iinclude Serbatoio CO2</td></tr><tr><td>Pennelli a punta fine</td><td>SOLO HORTON BRUSHES, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Incubatrice</td><td>VWR</td><td>89510-750</td><td></td></tr><tr><td>Mappatura genetica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CantonS</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9517</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>yw&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>6599</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila linea utilizzata per la mappatura di ricombinazione</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>3227</td><td>Genotipo: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3</td></tr><tr><td>CyO/sno[Sco]&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2555</td><td>Linea di bilanciamento Drosophila utilizzata per la mappatura della ricombinazione</td></tr><tr><td>Kit di carenza per cromosoma 2L</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>DK2L</td><td>Cook et al., 2012</td></tr><tr><td>Analisi istologica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, (100%)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Acido Acetico Glaciale</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Provette per microcentrifuga premium: 1,5 mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Agente chiarificante Histochoice 1x</td><td>VWR Life Sciences</td><td>97060-934</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>VWR</td><td>95057-858</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade; &nbsp; Richard-Allan Scientifico&commercio; Mezzo di montaggio</td><td>Thermo Scientific&trade; 4112</td><td>22-110-610</td><td>CyO/sna[Sco]</td></tr><tr><td>Unifrost Poly-L-Lysine vetrini per microscopio, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus</td><td>Azer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Copertura Occhiali: Rettangoli Fisherbrand</td><td></td><td>12-545M</td><td>Dimensioni: 24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>Timer tracciabile</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Warmer</td><td>Barnstead International</td><td></td><td>modello n. 26025</td></tr><tr><td>Vassoio per vetrini e rack</td><td>DWK Life Sciences</td><td></td><td>Rack per contenere 20 vetrini Fisherbrand</td></tr><tr><td>&trade; &nbsp; Pinze extra-lunghe per uso generico</td><td>Fisherbrand</td><td>10-316A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes&trade;</td><td>Kimberly-Clark e commercio; Professionale&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applicatori puritani da 6 pollici Hardwood</td><td>Products Company, Guilford, Maine</td><td>807-12</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Lamette da barba</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Tupperware o contenitori in vetro per liquidi</td><td></td><td></td> istologici <td>16 + 1 per acqua corrente</td></tr><tr><td>Lame per microtomo rivestite ad alto profilo</td><td>VWR</td><td>95057-834</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade; &nbsp; Secchiello per il ghiaccio rotondo con coperchio, 4 L</td><td>Corning&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Becher</td><td></td><td></td><td>O altro contenitore per acqua ghiacciata e cassette</td></tr><tr><td>Bagno tissutale</td><td>Precision Scientific Company</td><td>66630</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analisi molecolare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; SV Gel e PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Ex Taq DNA polimerasi</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>5 U/&mu; l</td></tr><tr><td>Invitrogen&commercio; &nbsp; SYBR&commercio; Sicuro&commercio; Colorazione in gel di DNA&nbsp;</td><td>&nbsp; Invitrogen&commercio;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&commercio; Agarosio</td><td> Invitrogen&commercio;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>&nbsp; Invitrogen&commercio;</td><td></td><td></td></tr><tr>Software <td></td><td></td><td>per l'editor di plasmidi ApE-A</td><td>Disponibile per il download gratuito</td></tr><tr><td>Analisi statistica</pacchetto software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> strong>R<tr><td>Ulteriori analisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>59967</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo avanti schermo genetico per identificare nuovi geni neuroprotettivi in drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

C'è molto da capire sull'insorgenza e la progressione delle malattie neurodegenerative, compresi i geni sottostanti responsabili. Lo screening genetico in avanti utilizzando mutageni chimici è una strategia utile per mappare i fenotipi mutanti ai geni tra la Drosophila e altri organismi modello che condividono le vie cellulari conservate con gli esseri umani. Se il gene mutato di interesse non è letale nelle fasi iniziali dello sviluppo delle mosche, è possibile eseguire un'analisi in aumento per esaminare gli indicatori fenotipici del funzionamento del cervello in diminuzione, come i bassi tassi di arrampicata. Successivamente, è possibile eseguire un'analisi istologica secondaria del tessuto cerebrale per verificare la funzione neuroprotettiva del gene segnando fenotipi di neurodegenerazione. Le strategie di mappatura genica includono la mappatura meiotica e di carenza che si basa su questi stessi assegni può essere seguita dal sequenziamento del DNA per identificare possibili cambiamenti nucleotidi nel gene di interesse.

In questo aertico, presentiamo i passi utilizzati per identificare il tumore del cervello genico (brat) come svolgere un ruolo nel mantenimento dell'integrità neuronale (ad esempio, neuroprotezione) nelle mosche adulte17; una metodologia che può essere utilizzata per identificare i geni coinvolti nella neuroprotezione. Abbiamo usato un approccio genetico in avanti (la strategia è delineata nella Figura 1A) per esamina...

Vi presentiamo un protocollo utilizzando un approccio genetico in avanti allo screening per i mutanti che mostrano neurodegenerazione in Drosophila melanogaster. Incorpora un saggio di arrampicata, analisi istologica, mappatura genica e sequenziamento del DNA per identificare in ultima analisi nuovi geni legati al processo di neuroprotezione.

In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di utilizzare il potere della genetica in avanti per identificare i geni che quando disregolati portano alla neurodegenerazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un approccio imparziale e diretto per l'identificazione di geni neuroprotettivi che potrebbero essere più difficili da eseguire nei modelli di mammiferi. Questa tecnica può essere utilizzata per identificare nuovi geni implicati nel processo di neurodegenerazione che è associato a molte condizioni di malattia come l'Alzheimer e il morbo di Parkinson.Oltre a identificare i geni neuroprotettivi, l'approccio genetico in avanti può essere utilizzato per scoprire geni coinvolti in altri processi biologici come la funzione neuronale e la trasmissione. Per iniziare, raccogliere mosche omozigote da linee appartenenti alla collezione mutagenizzata ENU di mutanti Drosophila mappati al secondo cromosoma. Capovolgere le mosche di età compresa tra 10 e 12 giorni in una camera di prova senza anestesia una linea alla volta e consentire loro di recuperare per cinque minuti.Con la linea di cinque centimetri che segna il lato verso il basso, toccare forzatamente la camera tre volte su un tappetino del mouse posizionato su una superficie solida in modo che tutte le mosche inizino il saggio nella parte inferiore. Osserva la locomozione della mosca per un periodo di 10 secondi. Registra il numero di mosche che raggiungono o superano la linea dei cinque centimetri entro questo periodo, nonché il numero totale di mosche testate.Attendere un minuto prima di iniziare una seconda prova. Ripetere almeno tre repliche di prova per riga. Dopo aver anestetizzato le mosche su un tampone di anidride carbonica, premere teste di mosca con una lama chirurgica e utilizzare un pennello per posizionarle delicatamente in un millilitro del fissatore di Carnoy in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri.Quindi conservare il tubo a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, assicurarsi che le teste siano affondate nella soluzione fissante. Sotto una cappa aspirante, utilizzare una pipetta P1000 per sostituire la soluzione fissante con un millilitro di etanolo al 70% e mantenere i campioni a quattro gradi Celsius per analisi future.Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire le testine fisse in cassette microbiopsia e chiudere le cassette. Inviare le cassette a una struttura istologia per la lavorazione o posizionarle in una macchina automatizzata per la lavorazione dei tessuti, se disponibile in loco. Esegui il programma per disidratare, cancellare e infiltrarsi nelle teste con la paraffina.Quindi trasferire le cassette in una stazione di incorporamento di paraffina con paraffina riscaldata a 60 gradi Celsius e posizionare stampi di base metallici che si adattano alle cassette sulla stazione riscaldata. Utilizzare forcep fini per orientare le teste in modo che si affacciano sulla parte superiore dello stampo di base. Un corretto orientamento della testa è fondamentale per l'analisi istologico.Dopo l'indurimento, tagliare ogni blocco di paraffina per ridurre al minimo la superficie che verrà sesata. Tagliare cinque sezioni di micrometro di ogni blocco sul microtomo. Quindi, posizionare i nastri di paraffina sesati in un bagno d'acqua riscaldato a 35 gradi Celsius per un massimo di cinque minuti.Immergere uno scivolo rivestito di polilisina nel bagno d'acqua riscaldato e utilizzare un applicatore in legno per posizionare i nastri sezionati sullo scivolo. Lasciare asciugare l'aria degli scivoli durante la notte a temperatura ambiente. Il giorno successivo, utilizzare uno scaldascivole per riscaldare le diapositive per 15 minuti a 63 gradi Celsius.Sotto una cappa aspirante, posizionare gli scivoli su un rack di colorazione scorrevole e posizionare il rack in HistoChoice per cinque minuti due volte seguito da diversi trattamenti di etanolo e bagno d'acqua distillati secondo il manoscritto. Trasferire il rack in un contenitore pieno di Hematoxylin Harris per due o cinque minuti per macchiare. Quindi estraere il rack dalla soluzione di ematossilina e posizionarlo sotto l'acqua corrente del rubinetto per 10 minuti prima dei seguenti passaggi di colorazione.Dopo la colorazione, utilizzando le forcep, eseguire le diapositive dalla soluzione HistoChoice o Xylene. Gocciolare un sottile strato di mezzo di montaggio permanente sul campione e posizionare delicatamente un coverslip sulla parte superiore. Evitare la formazione di bolle.Dopo che il mezzo di montaggio è stato indurito, posizionare lo scivolo al microscopio leggero per ottenere immagini di sezioni cerebrali rappresentative a circa il midbrain. In primo luogo, preparare un alimento contenente fiala per generare mosche femminili eterozigoti. Dopo l'anestesia di anidride carbonica, usa un pennello per trasferire cinque maschi della linea mutante e 10 femmine vergini del lobo sternopleurale inceppato e pin sulla linea Curly O nel flaconcino per fare una croce.Posizionare il flaconcino a 25 gradi Celsius. Dopo 10-12 giorni, raccogliere almeno 15 progenie femminile vergine che trasporta il cromosoma mutato e il cromosoma marcatore. Attraversali a cinque maschi da una linea equilibrata che porta un altro marcatore dominante visibile Curly O su scutoide o equivalente.Dopo 10-12 giorni, raccogliere la progenie maschile eterozigote che trasporta scutoide o Riccio O e il cromosoma potenzialmente ricombinato dalla croce. Accoppiali individualmente alle femmine vergini dello stock che trasportano il cromosoma mutato. Da dieci a 12 giorni dopo, raccogli la progenie dall'ultima croce in nuovo cibo contenente fiale e invecchia le mosche a 29 gradi Celsius a 10-14 giorni.Esegui l'istologia sulle teste di mosca e ripeti per la progenie di ogni singola croce. Con queste informazioni, eseguire la mappatura della carenza sulla regione ristretta del cromosoma per perfezionare la posizione della mutazione recessiva. Ogni linea di carenza ha una cancellazione di diverse regioni dei cromosomi permettendo loro di essere utilizzate per i test di completamento.Successivamente, le linee trasversali dal kit di carenza di Drosophila per il secondo cromosoma e cercano la non complementazione del fenotipo dell'interesse. Per ottenere un riferimento per l'analisi della sequenza del DNA, scaricare un file in formato FASTA contenente la sequenza di consenso genomico del gene BRAT da FlyBase o utilizzare un file contenente i risultati per la sequenza BRAT di un controllo genetico dello sfondo, ad esempio la linea Drosophila originariamente mutagenizzata. Aprire i file di sequenziamento nell'editor plasmide A.Passare a Modifica e fare clic su Allinea sequenze. Utilizzando il mouse del computer, selezionare tutte le sequenze da confrontare. Nel menu a discesa indicare la sequenza di riferimento per questo allineamento.Ispezionare la regione sequenziata alla ricerca di cambiamenti nucleotidici rispetto alla sequenza di riferimento. Se lo si desidera, salvare l'allineamento su un computer in formato RTF facendo clic su Testo e quindi su Salva. Esegui l'esperimento di salvataggio raccogliendo la progenie di F1 da ogni croce.Selezionare con cura i bilanciatori contrassegnati. Invecchia le mosche sul mezzo alimentare Drosophila a 29 gradi Celsius ed esegui analisi istologico sul cervello per cercare la neurodegenerazione come in precedenza. Per eseguire analisi di neurodegenerazione dipendenti dall'età in 867 mutanti, invecchiare le mosche a cinque, 15 e 25 giorni ed eseguire successive analisi istomiche.Questo protocollo presenta un approccio genetico in avanti allo schermo attraverso una collezione di mosche chimicamente mutagene usando un saggio di arrampicata. Tra le 235 linee omozigote, circa il 37% delle linee testate presentava una velocità di passaggio di arrampicata inferiore al 50% se testata all'età di 10-12 giorni. Il successivo schermo istologico su 51 delle linee che mostrano il più basso tasso di passaggio di arrampicata ha rivelato che 29 di queste linee hanno mostrato un aspetto visibile di buchi nel neuropilo cerebrale che vanno da lievi a gravi indicativi di neurodegenerazione.Il fenotipo di neurodegenerazione in 867 mosche è recessivo perché il cervello delle mosche eterozigoti 867 che sono state superate a un ceppo di tipo selvaggio erano paragonabili a quelle dei controlli. La linea di carenza Df24116 non completa il fenotipo mutante 867 basato sul saggio di arrampicata. La verifica istologica mostra che la linea di carenza Df24116 non completa il fenotipo di neurodegenerazione 867 mentre Df9296 lo fa.Esaminando il fenotipo cerebrale di 867 mutanti incrociati con ulteriori linee di carenza ha confermato che la mutazione è contenuta nella regione del genoma che include il gene BRAT. È importante ricordare durante questa procedura di lavorare nel modo più rigoroso e preciso possibile in quanto questo protocollo combina diversi passaggi che se eseguiti in modo improprio possono influenzare l'identificazione dei mutanti con la neurodegenerazione nei geni candidati. A seconda dei geni identificati, l'analisi successiva può includere il test di ovuli aggiuntivi del gene di interesse o interazioni con geni che svolgono un ruolo in percorsi noti di neurodegenerazione.Durante la procedura istologico, ricorda di gestire la soluzione fissante del Carnoy con cautela poiché contiene cloroformio. Indossare guanti e utilizzare con un'adeguata ventilazione idealmente sotto il cofano dei fumi. Allo stesso modo, eseguire tutta la colorazione istologia sotto la cappa dei fumi.

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