Name: Generazione di fibrille preformate alfa-sinucleina da monomeri e uso in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri come generare fibrille preformate di alfa-sinucleina da monomeri con controllo qualità e sonificazione. Questo metodo standardizzato consente di modellare la sinucleinopatia e studiare la progressione del morbo di Parkinson in modelli in vivo.

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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dalla Fondazione Michael J. Fox, l'Istituto nazionale di disordini neurologici e ictus (NS099416) e il Weston Brain Institute.

<ol><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
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<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li>
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</ol>

Joseph Patterson, Kelvin Luk, e Caryl Sortwell sono attualmente coinvolti in accordi contrattuali con la Fondazione Michael J. Fox per il controllo qualità α-SYN materiale generato da Proteos, Inc. coauthor Nicole POLINSKI, è un impiegato del Michael J. Fox Foundation, che ha contratto la Proteos, Inc., per produrre α-SYN monomero. I coautori Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley e Nicholas Kanaan non hanno nulla da rivelare.

La produzione di PFFs α-SYN in grado di seminare i neuroni e portare a inclusioni simili al corpo di Lewy dipende da molteplici fattori e passaggi. Un fattore critico è che i monomeri utilizzati per la generazione di fibrille devono essere specificamente formulati per la fibrilizzazione4,9,14,15. Se i monomeri non sono formulati per la fibrilizzazione, le fibrille non possono formarsi o le fibrille che si formano non possono produrre una patologia α-SYN. Analogamente, il tampone che i monomeri influenzano anche la fibrilizzazione. Come tale, per i migliori risultati, la concentrazione di sale dovrebbe essere di circa 100 mM di NaCl e pH tra 7,0 e 7,3. Un primo passo che introduce la variabilità è il metodo con cui viene determinato il contenuto proteico iniziale, con la misurazione a A280 che può produrre risultati più accurati e quindi è il metodo preferito. La discrepanza nella concentrazione proteica può diminuire l'efficacia del processo di fibrilizzazione, così come alterare la concentrazione presunta del PFF utilizzata negli esperimenti. Entrambi potrebbero comportare una diminuzione dell'efficienza di semina e delle variazioni di lotto tra gli esperimenti.
Le fasi iniziali di controllo della qualità confermeranno le caratteristiche critiche dei PFFs, in particolare che hanno una conformazione fibrillaria (microscopia elettronica), contengono strutture amiloidi (saggio Tioflavina T) e sono pelletable (saggio di sedimentazione). È importante notare che i risultati del saggio tioflavin T oscilleranno con il tempo e non sono una misura diretta della quantità di strutture amiloidi presenti, piuttosto, il saggio di tioflavina T deve essere usato solo come indicatore della presenza di strutture amiloidi all'interno il campione. Thioflavin T è tipicamente usato in saggi in vitro, come il suddetto saggio per mostrare che le fibrille contengono strutture amiloidi. In alternativa, Tioflavina S è usato nei tessuti per rilevare strutture amiloidi, come mostrato in Figura 7. Per quanto riguarda il saggio di sedimentazione, i risultati mostrano solo che i PFFs si trovano prevalentemente nella frazione pelletable. Mentre i campioni vengono eseguiti in condizioni di denaturazione, una singola banda prominente di circa 14 kDa, la dimensione dei monomeri α-SYN, è presente sui gel. Questo è diverso dalle bande multiple presenti a pesi molecolari più elevati che ci si aspetta con i PFFs se è stato utilizzato un gel nativo o non denaturante. Infine, il superamento di tutte queste fasi iniziali di controllo della qualità non garantisce l'attività di semina dell'inclusione α-SYN. Per questo motivo, esperimenti di coltura cellulare o una piccola coorte di animali iniettati chirurgicamente devono essere utilizzati per testare l'efficacia dei PFFs prima dell'uso in esperimenti più grandi.
Sonicazione è un passo cruciale nel processo e parametri saranno diversi a seconda del modello di sonicatore utilizzato. I parametri di sonicazione devono essere applicati e verificati per mostrare che sono stati prodotti frammenti di PFF corti. Dimensione fibril ha cuscinetto sulla semina, con fibrille più brevi semina più efficiente. Anche se i semi di fibrille più brevi più efficiente, questo altipiani effetto e la lunghezza ottimale pff è di circa 50 Nm4,18. È anche importante non sovra-Sonicare i campioni ed esporre i PFFs a calore eccessivo, in quanto questo può diminuire l'efficienza di semina. Questi PFFs sonicati devono essere testati per l'efficacia nella coltura di piccole cellule o negli esperimenti in vivo prima dell'uso in esperimenti su più grandi dimensioni. Poiché diverse sessioni di sonicazione hanno il potenziale per introdurre la variabilità, i gruppi di trattamento sperimentale dovrebbero essere pianificati di conseguenza.
Quando si consegnano i pffs in vivo, la localizzazione del sito (i) di iniezione e la quantità totale di pffs utilizzati possono influenzare il numero di neuroni che svilupperanno inclusioni, nonché l'entità della neurodegenerazione7,14. Le coordinate del protocollo forniscono un punto di partenza, ma devono essere testate all'interno del laboratorio per garantire che la regione target desiderata sviluppi la patologia α-SYN prima dell'uso in esperimenti su larga scala. Se lo si desidera, il tracciamento delle tinte o delle perle fluorescenti può essere utilizzato come metodo per testare il targeting regionale prima di utilizzare i PFFs. La quantità di pffs utilizzata in vivo varia tra i gruppi, con la maggior parte dei gruppi che utilizzano un totale compreso tra 5 e 20 μg di pffs in uno o diviso tra due siti di iniezione1,2,3,4,5 , 6 il , 7 il , 14. Poiché il numero di siti di iniezione, l'ubicazione dei siti di iniezione e la quantità di pffs iniettate possono influire sui risultati e sulla progressione della sinucleinopatia, i risultati a valle dei parametri utilizzati devono essere caratterizzati prima di utilizzare il modello per testare potenziali interventi o esaminare le caratteristiche temporali del modello.
Quando si seleziona un modello da utilizzare per testare le terapie o studiare la progressione della malattia, il modello utilizzato deve essere selezionato per rispondere meglio alla domanda posta. Non tutti i modelli saranno in possesso di alcune caratteristiche di malattia di PD, o offrire il lasso di tempo necessario per testare i potenziali interventi. Il modello PFF ricapitolizza le caratteristiche principali della PD, come la patologia α-SYN e la neurodegenerazione, e può portare a modeste riduzioni motorie. Il modello offre un corso temporale prevedibile e prolungato, dove le inclusioni si formano mesi prima della neurodegenerazione. Ciò consente ai ricercatori di esaminare e sfruttare le diverse fasi durante la progressione prolungata della sinucleinopatia. L'uso attuale e futuro del modello in generale dovrebbe essere vantaggioso nello studio della progressione della malattia e dello sviluppo di nuove terapie.

Il morbo di Parkinson (PD) è caratterizzato principalmente da due importanti caratteristiche patologiche: la patologia alfa-sinucleina (α-SYN) diffusa e progressiva e la degenerazione nigrostriatale. Dopo l'iniezione in topi o ratti di tipo wildtype, le fibrille α-SYN preformate (PFFs) inducono un progressivo accumulo di α-SYN patologico, che può comportare una degenerazione prolungata dei neuroni della dopamina di sostanza nigra pars compacta (SNpc) nel corso di molti mesi, così come i deficit sensomotoria1,2,3,4,5,6. I neuroni sono esposti a α-SYN fibrils, sia tramite iniezione intracerebrale diretta o aggiunti ai media dei neuroni coltivati. Quando i pffs sono presi nei neuroni, i pffs agiscono per "seme" la formazione di inclusioni attraverso il templating, e l'accumulo di α-SYN endogeno in inclusioni fosforilate1,7,8, 9. il Inclusioni condividono proprietà simili a corpi di Lewy: contenenti α-SYN fosforilato a serina 129 (pSyn), ubiquitina, e P62; possedere strutture quaternarie amiloidi come mostrato con colorazione Tioflavina positiva; e sono resistenti alla proteinasi K digestione1,3,5,7,8,9,10,11, 12. per la L'esposizione PFF conduce alla formazione di inclusione α-SYN in neuroni primari e alcuni immortalati nella cultura, così come topi, ratti e primati non umani in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. È importante notare che i PFFs non porteranno alla formazione di inclusione α-SYN in tutti i modelli di coltura cellulare e alcuni neuroni coltivati saranno seme meglio di altri.
Un'altra caratteristica importante del modello in vivo α-SYN PFF è la distinta fase patologica sequenziale che emerge nel corso di diversi mesi. Nei roditori, a seguito di iniezione intrastriatale, la formazione di inclusione α-SYN generalmente picchi all'interno del SNpc e molte regioni corticali entro 1-2 mesi. Questo picco di aggregazione è seguito da degenerazione nigrostriatal ≈ 2-4 mesi più tardi1,3,5. Queste distinte fasi patologiche forniscono ai ricercatori la piattaforma con cui studiare e sviluppare strategie che 1) diminuire l'aggregazione α-SYN, 2) chiare inclusioni α-SYN già formate, e/o 3) prevenire la successiva neurodegenerazione. Il modello PFF offre vantaggi e svantaggi distinti rispetto ai modelli iperespressivi α-SYN, transgenici e a vettori virali mediati da neurotossicant, come precedentemente esaminato6. La scelta del modello o dell'approccio da adottare dovrebbe essere determinata dal modello che meglio si adatta alla domanda che gli investigatori chiedono.
Anche se il modello PFF è stato utilizzato con successo da molti laboratori, ci sono ancora gruppi che hanno sperimentato incongruenze con la generazione di fibrille e producendo coerente α-SYN patologia14. Esempi di incongruenze variano da PFFs che producono poca o nessuna patologia α-SYN, batch per l'efficienza di semina batch, e anche il fallimento di fibrille da formare. Pertanto, la standardizzazione della generazione di α-SYN PFF e dell'applicazione in vivo è critica al fine di consentire interpretazioni accurate sull'impatto di nuovi interventi terapeutici. Il seguente protocollo delinea i passi necessari per la generazione di PFFs da monomeri α-SYN, il controllo di qualità in vitro dei PFFs una volta formati, la sonicazione e la misurazione di PFFs prima dell'uso, e suggerimenti per facilitare l'iniezione in vivo di successo di PFFs in ratti o topi.

<table><tbody><tr><td>1x Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-alfa-sinucleina (fosforilata alla serina 129)</td><td>Abcam</td><td>AB184674</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-alfa-sinucleina</td><td>Abcam</td><td>AB15530</td><td></td></tr><tr><td>acido bicinchonic Thermo</td><td>Fisher (Pierce)</td><td>PI23228</td><td></td></tr><tr><td>guaina termoretraibile medica trasparente (diametro interno 0,036")</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0143</td><td></td></tr><tr><td>Tubo termoretraibile medico trasparente (diametro interno 0,044")</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0296</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di rame</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23224</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2231000574</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio riscaldato Eppendorf ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>rivestito in Formvar/carbonio Griglie per microscopia elettronica</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capillare in vetro (diametro esterno 0,53 mm; diametro interno 0,09 mm; lunghezza 54 mm)</td><td>Drummond</td><td>22-326223</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore di aghi in vetro</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>Monomero umano di alfa-sinucleina per generare fibrille preformate</td><td>Proteos</td><td>RP-003</td><td></td></tr><tr><td>Monomero di alfa-sinucleina di topo per generare fibrille preformate</td><td>Proteos</td><td>RP-009</td><td></td></tr><tr><td>Tubo termoretraibile medico arancione (diametro interno 0,021)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0152</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Invitrogen</td><td>25530015</td><td></td></tr><tr><td>Punta</td> <td>Qsonica da 3,2 mmQsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica Q125 sonicatore</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1892</td><td></td></tr><tr><td>Tioflavina T</td><td>EMD Millipore</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>ToxinSensor Kit per il dosaggio dell'endotossina cromogenica LAL</td><td>Genscript Genscript</td><td>L00350C</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>Eletron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di fibrille preformate alfa-sinucleina da monomeri e uso in vivo

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

L'uso del modello in vivo di fibrille alfa-sinucleina preformato (α-SYN PFF) della sinucleinopatia sta guadagnando popolarità tra i ricercatori che mirano a modellare la sinucleinopatia della malattia di Parkinson e la degenerazione nigrostriatale. La standardizzazione della generazione di α-SYN PFF e dell'applicazione in vivo è critica al fine di garantire una patologia α-SYN consistente e robusta. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la generazione di fibrille da monomerica α-SYN, fasi di controllo della qualità post-fibrilization, e parametri suggeriti per l'iniezione neurochirurgica di successo di α-SYN PFFs in ratti o topi. A partire dall'α-SYN monomerica, la fibrilizzazione si verifica in un periodo di incubazione di 7 giorni, scuotendo in condizioni ottimali di buffer, concentrazione e temperatura. Il controllo della qualità post-fibrilizzazione è valutato dalla presenza di fibrille pellettiche attraverso il saggio di sedimentazione, la formazione di conformazione amiloide nelle fibrille con un saggio di tioflavina T, e la visualizzazione microscopica elettronica dei fibrili. Considerando che la convalida corretta utilizzando questi saggi è necessaria per il successo, non sono sufficienti a garantire che i PFFs seminino inclusioni α-SYN nei neuroni, in quanto tale attività di aggregazione di ciascun lotto PFF deve essere testata nella coltura cellulare o in coorti pilota di animali. Prima dell'uso, i PFFs devono essere sonicati in condizioni esattamente standardizzate, seguiti da un esame utilizzando la microscopia elettronica o la dispersione luminosa dinamica per confermare che le lunghezze di fibrille sono all'interno di una gamma di dimensioni ottimali, con una lunghezza media di 50 Nm. I PFFs possono quindi essere aggiunti ai supporti di coltura cellulare o utilizzati negli animali. La patologia rilevabile mediante immunocolorazione per l'α-SYN fosforilato (Psyn; serina 129) è apparente giorni o settimane dopo nei modelli di coltura cellulare e roditore, rispettivamente.

La generazione di fibrille da monomeri α-SYN inizia con la determinazione della concentrazione dei monomeri. Sia il saggio BCA che la misura dell'assorbanza a 280 Nm (A280) possono essere utilizzati per misurare il contenuto proteico; i risultati del saggio BCA, tuttavia, suggerivano una concentrazione più elevata rispetto al metodo A280. I PFFs derivati dal topo α-SYN monomero avevano un valore BCA di 14,05 ± 0,22 e un A280 di 8,05 ± 0,03 μg/μL (Figura 1). Analogamente, anche i PFFs derivati dall'α-SYN monomero umano sembravano essere ad una concentrazione più elevata, con un valore BCA di 12,95 ± 0,38 e un A280 di 7,83 ± 0,05 μg/μL (Figura 1). Le misurazioni A280 sono specifiche per α-SYN in base all'inclusione dei coefficienti di estinzione e questi risultati sono stati utilizzati per diluire i monomeri prima dell'incubazione di 7 giorni.
Prima dell'incubazione, il liquido contenente i monomeri α-SYN era chiaro, ma dovrebbe apparire torbido dopo la formazione di fibrille. L'esame con la microscopia elettronica di trasmissione ha confermato la presenza di fibrille lunghe, misurando 10-20 Nm di larghezza (Figura 4). In confronto, i monomeri α-SYN erano appena visibili senza apparente forma visibile (Figura 4). Con la conferma visiva delle strutture fibrillari, la conviazione amiloide delle fibrille è la successiva caratteristica di PFFs che dovrebbe essere confermata utilizzando un saggio Tioflavina T. Thioflavin T presenta una maggiore fluorescenza quando si legano all'amiloide; Pertanto, un aumento del segnale fluorescente dai campioni indica la presenza di amiloide. Ad esempio, la Tioflavina nei dPBS ha prodotto un segnale di 3.287 ± 580 unità fluorescenti relative (RFU), il topo α-SYN monomero ha prodotto un segnale di 4.174 ± 158 RFU e i PFFs del mouse hanno prodotto un segnale di 59.754 ± 6.224 RFU (Figura 5). In confronto, l'α-SYN monomero umano ha prodotto un segnale simile di 4.158 ± 105 RFU al monomero del topo, e gli PFFs umani hanno prodotto un segnale più alto di 1.235.967 ± 113.747 RFU rispetto ai PFFs del mouse (Figura 5). Per valutare la presenza di fibrille pelletable, è stato eseguito un saggio di sedimentazione. I fibrili si pellet con centrifugazione. Sia nel topo che nel campione umano PFF, la frazione supernatante deve avere più proteine nel pellet rispetto al surnatante (Figura 6). Al contrario, la maggior parte della proteina del topo e dei monomeri umani era presente nel surnatante, con poco presente nel pellet (Figura 6). Con i PFFs visibilmente presenti mediante microscopia elettronica, strutture amiloidi presenti e pelletable in fibrille, i PFFs hanno superato tutte le fasi di controllo della qualità in vitro.
Sia il topo sia i pffs umani sono stati sonicati per produrre pffs di lunghezze appropriate per la semina di inclusioni α-SYN4,18. I PFFs sono stati diluiti alla concentrazione desiderata di 4 μg/μL e sonicato. Immediatamente prima dell'intervento chirurgico, 25 fibrille rappresentative sono stati iminvecchiati da microscopia elettronica e misurato per individuare controllare la dimensione del fibrille. Il mouse sonicato PFFs misurato 48,8 ± 3,1 Nm, mentre i PFFs umani misurato 52,1 ± 4,4 Nm di lunghezza; I PFFs di entrambe le specie erano quindi la lunghezza appropriata (50 Nm o inferiore) per indurre l'attività di semina. L'esame più completo di circa 500 fibrille ha rivelato la lunghezza media e la distribuzione della lunghezza dei fibrili del topo sonicato. La lunghezza media è stata 44,4 ± 0,6 Nm, con il 86,6% dei PFFs che misurano 60 Nm o meno (Figura 4). In confronto, i PFFs umani hanno una media di 55,9 ± 1,1 Nm con il 69,6% dei PFFs di dimensioni pari o inferiori a 60 Nm (Figura 4).
Dopo l'iniezione intrastriatale di pffs di topo sonicato in ratti come descritto in precedenza3,5, una serie di sezioni tissutali sono stati elaborati a 2 mesi dopo l'intervento chirurgico, quando il numero di inclusione contenente i neuroni è noto al picco in SNpc, per la conferma delle inclusioni α-SYN fosforilate5. L'inclusione dei neuroni cuscinetto, come indicato dalla colorazione immunoistochimica per Psyn (anticorpo nella tabella dei materiali) sono presenti all'interno del SNPC (Figura 7), così come altre regioni in tutto il cervello che innervano lo striato (anteriore nucleo olfattiva, motore, cingolare, piriforme, prelimbic, somatosensoriale, entorhinal, e cortices insulari, Amygdala, striatum)1,3,4,5,19. Queste inclusioni condividono proprietà simili con corpi di Lewy, come l'associazione di tioflavina S, e la resistenza del totale α-SYN a proteinasi K (Figura 7), come mostrato dalla colorazione immunoistochimica (anticorpo e proteinasi k nella tabella dei materiali) . La conferma della semina all'interno del cervello indica che il controllo di qualità in vivo è stato superato, e le aliquote di PFFs precedentemente congelate e salvate dallo stesso lotto possono essere sonicate sotto parametri identici, con lunghezze convalidate, in esperimenti più grandi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> Figura 1 . Metodi per la generazione di fibrille α-SYN. Schema dei passaggi necessari per produrre fibrille da monomeri α-SYN. I monomeri vengono centrifugati per 10 minuti (15.000 x g, a 4 ° c). Il supernatante viene trasferito in un tubo pulito e la concentrazione proteica è determinata dall'assorbanza a 280 nm o da un saggio BCA. Il grafico mostra le concentrazioni dei monomeri α-SYN umani e del topo. Le colonne indicano il significato del gruppo, le barre di errore rappresentano ± 1 errore standard della media. Dopo aver determinato la concentrazione proteica, i monomeri α-SYN vengono diluiti, brevemente vortexati e incubati per 37 ° c per 7 giorni, mentre scuotono su un mixer orbitale impostato a 1.000 RPM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> Figura 2 . Metodi di colorazione per la microscopia elettronica di trasmissione. Diagramma di colorazione negativa per microscopia elettronica. A) immagini raffiguranti griglie di campioni di microscopia elettronica. La griglia ha un lato opaco o leggero e un lato lucido o scuro. Il lato lucido/scuro è rivestito con un film di supporto Formvar/carbonio. B) illustrazione della procedura di colorazione. La griglia è galleggiata lucido/lato scuro verso il basso sulla prima goccia di ddH2O per 1 min e l'eccesso è malvagio via con carta da filtro. Il processo viene ripetuto con la seconda goccia di DDH2o, pffs diluiti o monomeri, due gocce di acetato di uranile e due gocce aggiuntive di DDH2o. griglie possono essere memorizzate in una scatola di griglia fino a quando non è stato immaturato. Barra di scala = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> Figura 3 . Assemblaggio di siringhe di aghi di vetro personalizzate. Diagramma dei passi necessari per assemblare le siringhe allegate di vetro. I tubi capillari in vetro siliconato vengono tirati e tagliati al centro per produrre aghi di vetro. Il tubo termoretraibile viene utilizzato per preparare l'ago metallico e formare una guarnizione interna quando l'ago di vetro viene scivato sull'ago metallico. Due strati aggiuntivi di tubo termoretraibile che si sovrappongono alla base dell'ago di vetro e l'ago metallico vengono aggiunti consecutivamente e il calore applicato per fissare l'ago di vetro e formare una guarnizione a tenuta d'acqua. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> Figura 4 . Visualizzazione di monomeri α-SYN e fibrille α-SYN tramite microscopia elettronica di trasmissione. Micrografi rappresentativi di monomeri α-SYN e fibrille. Top pannelli: topo e umano α-SYN monomero. Pannelli centrali: mouse a lunghezza intera e PFFs α-SYN umano. pannelli inferiori: mouse e umani α-SYN PFFs dopo sonicazione. Grafico in basso: distribuzione di mouse sonicato e lunghezze di PFF umano α-SYN. Barra di scala = 500 Nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> Figura 5 . Conferma delle strutture amiloidi con il saggio Tioflavina T. Misurazione del segnale fluorescente da topi e campioni umani α-SYN monomeri e PFF. A sinistra: i risultati dei monomeri α-SYN del mouse e dei PFFs α-SYN. A destra: i risultati dei monomeri α-SYN umani e dei PFFs α-SYN. In ogni grafico viene visualizzato un controllo negativo dPBS. Tutte le misurazioni sono espresse come unità fluorescenti relative (RFU). Le colonne indicano il significato del gruppo, le barre di errore rappresentano ± 1 errore standard della media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> Figura 6 . Saggio di sedimentazione per le immagini pelletable α-SYN. di Coomassie colorati. Le bande mostrate sono a circa 14 kDa in base alla scala proteica. A sinistra: topo monomero e PFFs. A destra: monomeri umani e PFFs. Per tutti i campioni di monomero e PFF, vengono mostrati il pellet (P) e il surnatante (S) risospesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> Figura 7 . Caratteristiche delle inclusioni nel modello del ratto che confermano la patologia α-SYN. Micrografi rappresentativi della sostanza nigra pars compacta a 2 mesi dopo l'iniezione. A sinistra: neuroni contenenti Psyn e controcolorati con violetto cresolo Violet. Medio: i neuroni positivi di thioflavin S. A destra: inclusioni α-SYN-contenenti resistenti alla proteinasi K. barra di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>

L'obiettivo di questo articolo è quello di delineare i passi necessari per la generazione di fibrille da alfa-sinucleina monomerica, successivo controllo di qualità, e l'uso dei fibrili preformati in vivo.

Generazione di fibrille preformate alfa-sinucleina da monomeri e uso in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Il modello Fibril preformato Alpha-Synuclein viene utilizzato dai laboratori di tutto il mondo per studiare le sinucleinopatie. Sebbene il modello sia stato utilizzato con successo da molti laboratori, alcuni gruppi hanno sperimentato incongruenze generando fibrille e producendo una patologia alfa-sinuleina coerente. Speriamo che questo protocollo, che dettaglia la generazione di fibrille dai monomeri alfa-sinuleina e l'uso di fibrille pre-formate in vivo, possa rispondere alle domande che i ricercatori hanno sull'uso del modello.Il modello Fibril preformato Alfa-Synuclein riassume le caratteristiche chiave del morbo di Parkinson, come la patologia alfa-sinuchileina e la neurodegenerazione. Ed è stato dimostrato che porta a modeste menomazioni motorie in alcuni modelli animali. La formazione di inclusioni contenenti alfa-sinuleina fosforilata e un lungo corso di tempo verso la neurodegenerazione offre ai ricercatori diverse fasi durante la progressione della sinuleinopatia, per studiare e indirizzare potenziali interventi terapeutici.A dimostrare la preparazione di aghi di vetro personalizzati, è il nostro tecnico di laboratorio, Christopher Kemp. Per iniziare questa procedura, scongelare i monomeri alfa-sinuleina sul ghiaccio. Riascivolò i monomeri scongelati svolazzando delicatamente sul tubo.E centrifuga a 15.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, trasferire il supernatante in un tubo di micro centrifuga pulito da 1,5 ml e registrare la quantità trasferita. Diluire i monomeri con 1x dPBS ad una concentrazione finale di 5 mg per mL.Brevemente vortice da mescolare e centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore del tubo. Quindi, utilizzare pellicola adesiva per fissare il coperchio del tubo della micro centrifuga chiuso. Posizionare il tubo in un termo miscelatore orbitale con un coperchio per sette giorni a 37 gradi Celsius mentre si trema a 1.000 giri/min.Alla fine di sette giorni, il contenuto del tubo dovrebbe apparire torbido. In primo luogo, indossa tutti i dispositivi di protezione individuale necessari tra cui guanti, un camice da laboratorio e uno scudo facciale. Quindi, in una cappa di coltura cellulare, attaccare una sonda di 3,2 mm di diametro al convertitore.Impostare l'ampiezza dei sonicatori sul 30% e l'impulso su un secondo e un secondo di riposo e l'ora su un minuto. Scongelare le fibrille a temperatura ambiente e, pur essendo ancora nel cappuccio di coltura, diluire le fibrille con dPBS sterile. Successivamente, inumidire un tessuto da laboratorio con il 70% di etanolo e utilizzarlo per pulire la sonda del sonicatore per pulirlo.Immergere la punta della sonda in acqua doppia distillata e pulirlo 10 volte per pulire ulteriormente la sonda. Dopo questo, asciugare la sonda con un tessuto da laboratorio. Posizionare la punta della sonda pulita nel tubo delle fibrille diluite e posizionare la punta nella parte inferiore del tubo.Sonicare le fibrille diluite utilizzando i parametri precedentemente impostati mentre si sposta la sonda su e giù durante ogni impulso per garantire che tutte le fibrille nel liquido siano sonicate. Dopo la sonicazione, centrifugare brevemente per un secondo a 2.000 g per raccogliere tutto il liquido dai lati del tubo. Immergere la punta della sonda in 1%SDS e pulirlo 10 volte per pulire la sonda.Quindi, rimuovere la punta dall'SDS e immergerla in acqua distillata doppia e pulsare 10 volte. Pulire la sonda con un tessuto da laboratorio inumidito con il 70% di etanolo e asciugarla con un tessuto da laboratorio asciutto. Staccare la sonda dal convertitore e conservare.Successivamente, pulire tutte le superfici della cappa con 1%SDS seguito dal 70% di etanolo. Per iniziare, posizionare un tubo capillare in vetro siliconizzato in un estrattore di ago di vetro. Accendere l'elemento riscaldante e consentire ai pesi attaccati di allungare il tubo capillare in vetro riscaldato.Successivamente, utilizzare le forbici per tagliare il tubo capillare in vetro tirato nel punto più sottile del mezzo e rimuovere l'ago di vetro dall'estrattore dell'ago di vetro. Quindi, utilizzare le forbici per tagliare una lunghezza di tubi di involucro termoretraibile a circa 40 mm. Far scorrere l'involucro termoretraibile sull'ago metallico di una siringa smussata da 10 microliter.Utilizzare una fiamma aperta per riscaldare e aderire all'involucro termoretraibile all'ago, assicurandosi di ruotare l'ago per applicare il calore in modo uniforme. Far scorrere con attenzione l'estremità più grande dell'ago di vetro tirato sopra l'ago metallico della siringa. Successivamente, tagliare una lunghezza di tubi avvolgenti termoretraibile a circa 40 mm e farla scorrere con cura sopra l'ago di vetro per sovrapporre la base dell'ago di vetro e l'ago metallico della siringa.Utilizzare una fiamma aperta per riscaldare l'involucro termoretraibile per fissare l'ago di vetro all'ago metallico. Per fissare ulteriormente l'ago e prevenire potenziali perdite, tagliare una lunghezza aggiuntiva di tubi di avvolgimento termoretraibile a circa 40 mm e far scorrere con cura sull'ago di vetro per sovrapporre la base dell'ago di vetro e l'ago metallico della siringa. Utilizzare una fiamma aperta per riscaldare l'involucro termoretraibile per fissare l'ago di vetro all'ago metallico.Quindi, utilizzare le forbici per tagliare l'ago di vetro in modo che la punta sia lunga circa 8 mm. Per testare l'ago, riempire una siringa da 1 ml con un ago da 26 gauge attaccato con acqua distillata. Rimuovere lo stantuffo metallico dalla siringa personalizzata dell'ago di vetro e inserire l'ago della siringa riempita d'acqua nella base della siringa personalizzata.Ispezionare l'interfaccia dell'ago di vetro e dell'ago metallico alla ricerca di perdite e confermare un flusso costante di acqua. Quindi, riempire un tubo di micro centrifuga con acqua distillata. Utilizzare la siringa personalizzata per l'ago di vetro per disegnare nell'acqua distillata.Ispezionare l'ago per confermare che il liquido viene preso nella siringa e che non ci sono bolle. Se ci sono bolle o se l'acqua non viene prelevata nell'ago, tagliare l'ago può aiutare ad alleviare la pressione. Successivamente, conservare attentamente la siringa con gli aghi di vetro attaccati, nelle scatole della siringa fino a quando necessario per gli interventi chirurgici.L'esame con microscopia elettronica a trasmissione conferma la presenza di fibrille lunghe. In confronto, i monomeri alfa-sinuleina sono visibili all'orzo e non hanno una forma distinguibile. La conferma analoide delle fibrille viene quindi confermata utilizzando un saggio Thioflavin T.Un saggio rappresentativo mostra che i monomeri dPBS e mouse producono un segnale inferiore nelle unità di flouresent relative rispetto ai PFF del topo. Il monomero umano alfa-sinuleina produce un segnale simile al monomero del mouse. Mentre i PFF umani producono anche un segnale più alto dei monomeri.Per valutare la presenza di fibrille pelitibili, viene eseguito un saggio di sedimentazione. Sia nei campioni di PFF del topo che in quelli umani, l'infrazione supernata dovrebbe avere più proteine nel pellet rispetto al supernatante. Al contrario, la maggior parte della proteina del topo e dei monomeri umani è presente nel supernatante con poco presente nel pellet.Sia i PFF topo che umani sono sonicati per produrre PFF di lunghezza appropriata per la semina di inclusioni alfa sinuleina. Un esame completo di circa 500 fibrille rivela che la lunghezza media delle fibrille di topo è di circa 44 nanometri. Con l'86,6% dei PFF che misurano 60 nanometri o meno.I PFF umani, tuttavia, hanno una lunghezza media di circa 55,9 nanometri con il 69,6% dei PFF che misurano 60 nanometri o meno. L'esame in vivo dell'efficacia del PFF è confermato utilizzando l'immunoistochimica. Le inclusioni formate nella substantia nigra, condividono proprietà simili ai corpi di Lewy in quanto contengono sinuleina alfa fosforilata, contengono strutture aminloyed e macchie con tioflavina S e sono resistenti alla digestione proteinasi K.La sonicazione può esporre l'individuo sonicante a fibrille preformate aerosolizzate. Come tale, dovrebbe essere indossato un abbigliamento di sicurezza adeguato e la sonicazione eseguita in una cappa per ridurre al minimo il rischio di esposizione.

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Questo video dimostra l'iniezione di fibrille di alfa-sinucleina in un topo per indurre la neuroinfiammazione. Le fibrille vengono iniettate per via intraperitoneale in un topo transgenico che esprime proteine alfa-sinucleina mutate. Una volta raggiunto il sistema nervoso centrale, le fibrille entrano nei neuroni e inducono l'aggregazione delle proteine mutate. Gli aggregati si diffondono ai neuroni vicini, alle microglia e agli astrociti. Il riconoscimento degli aggregati innesca la microglia...

Induzione della neuroinfiammazione nei topi tramite iniezione di fibrille di alfa-sinucleina

Questo video dimostra il processo di quantificazione dell'accumulo di alfa-sinucleina nei neuroni dopaminergici embrionali di topo pre-trattati con fibrille preformate di alfa-sinucleina. Descrive i passaggi per fissare, colorare e quantificare i neuroni dopaminergici contenenti aggregati di alfa-sinucleina utilizzando l'immunofluorescenza.

Studio dell'accumulo di alfa-sinucleina nei neuroni della dopamina embrionale primaria di topo

Le proteine possono adottare una struttura nativa o ripiegarsi erroneamente in amiloide insolubile. Le condizioni che favoriscono la via del ripiegamento errato portano alla formazione di diversi tipi di fibrille amiloidi. I metodi qui descritti consentono una rapida conversione di proteine native in amiloide in vitro.

Generazione rapida di amiloide da proteine native in vitro

Viene descritta un'ELISA che offre un approccio quantitativo innovativo. Rileva specificamente l'α-sinucleina associata alla malattia (αSD) in un modello di topo transgenico (M83) di sinucleinopatia utilizzando diversi anticorpi contro la forma αS fosforilata nella Ser129 o la parte C-terminale della proteina.

Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento di alfa-sinucleina (α-syn) sempre più insolubile/aggregata da tessuto cerebrale umano post-mortem. Attraverso l'utilizzo di tamponi con forza detergente crescente e tecniche di ultracentrifugazione ad alta velocità, è possibile esaminare le proprietà variabili dell'aggregazione α-syn in tessuti malati e non malati.

Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

Iniezione periferica di fibrille alfasinucleina nel peritoneo o linguetta di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che esprimono umana alfasinucleina con la mutazione A53T familiare e luciferasi di lucciola, può indurre neuropatologia, compreso neuroinflammation , nel loro sistema nervoso centrale.

Bioluminescenza Imaging di Neuroinflammation in topi transgenici Dopo periferica inoculazione di alfa-sinucleina fibrille

L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un sistema basato su cellule che replica la formazione dell'alfa-synuclein aggrega in vivo. Le inclusioni intracellulari dell'alfa-synuclein sono seminate in neuroni primari di interiorizzazione e propagazione di esogeno somministrato del microsomi nativo con alfa-synuclein aggregati isolati da topi transgenici malato dell'alfa-synuclein.

Somministrazione esogena di microsomi-collegato dell'alfa-synuclein aggregati di neuroni primari come un modello potente delle cellule di formazione di fibrille

Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per studiare l'accumulo neuronale di sinucleina nei neuroni primari della dopamina del topo. Gli aggregati di sibbonucleina fosfolati nei neuroni sono indotti con fibrille pre-formate e sinucleina. L'imaging automatizzato di cellule etichettate immunofluorescentmente e l'analisi imparziale dell'immagine rendono questo protocollo robusto adatto per lo screening della produttività medio-alta di farmaci che inibiscono l'accumulo di sinucleina.

Studio pre-formato Fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale Midbrain Dopamine Neuroni

È necessario un modello fisiologico in vivo di α-sinucleina per studiare e comprendere la patogenesi della malattia di Parkinson. Descriviamo un metodo per monitorare la citotossicità e la formazione di aggregati di α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato.

Un metodo per studiare la tossicità e l'aggregazione della α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato

Il presente protocollo descrive un metodo per la somministrazione intranasale di aggregati di α-sinucleina. Questo metodo fornisce informazioni sulla propagazione della α-sinucleina dalla mucosa olfattiva al bulbo olfattivo nella malattia di Parkinson.

Tecnica per la somministrazione intranasale di aggregati di α-sinucleina

Scopri come generare fibrille preformate di alfa-sinucleina da monomeri con controllo qualità e sonificazione. Questo metodo standardizzato consente di modellare la sinucleinopatia e studiare la progressione del morbo di Parkinson in modelli in vivo.

Generazione di fibrille preformate alfa-sinucleina da monomeri e uso in vivo

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