Generazione di fibrille preformate alfa-sinucleina da monomeri e uso in vivo
2 giugno 2019
L'obiettivo di questo articolo è quello di delineare i passi necessari per la generazione di fibrille da alfa-sinucleina monomerica, successivo controllo di qualità, e l'uso dei fibrili preformati in vivo.
Il modello Fibril preformato Alpha-Synuclein viene utilizzato dai laboratori di tutto il mondo per studiare le sinucleinopatie. Sebbene il modello sia stato utilizzato con successo da molti laboratori, alcuni gruppi hanno sperimentato incongruenze generando fibrille e producendo una patologia alfa-sinuleina coerente. Speriamo che questo protocollo, che dettaglia la generazione di fibrille dai monomeri alfa-sinuleina e l'uso di fibrille pre-formate in vivo, possa rispondere alle domande che i ricercatori hanno sull'uso del modello.
Il modello Fibril preformato Alfa-Synuclein riassume le caratteristiche chiave del morbo di Parkinson, come la patologia alfa-sinuchileina e la neurodegenerazione. Ed è stato dimostrato che porta a modeste menomazioni motorie in alcuni modelli animali. La formazione di inclusioni contenenti alfa-sinuleina fosforilata e un lungo corso di tempo verso la neurodegenerazione offre ai ricercatori diverse fasi durante la progressione della sinuleinopatia, per studiare e indirizzare potenziali interventi terapeutici.
A dimostrare la preparazione di aghi di vetro personalizzati, è il nostro tecnico di laboratorio, Christopher Kemp. Per iniziare questa procedura, scongelare i monomeri alfa-sinuleina sul ghiaccio. Riascivolò i monomeri scongelati svolazzando delicatamente sul tubo.
E centrifuga a 15.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, trasferire il supernatante in un tubo di micro centrifuga pulito da 1,5 ml e registrare la quantità trasferita. Diluire i monomeri con 1x dPBS ad una concentrazione finale di 5 mg per mL.
Brevemente vortice da mescolare e centrifugare brevemente per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore del tubo. Quindi, utilizzare pellicola adesiva per fissare il coperchio del tubo della micro centrifuga chiuso. Posizionare il tubo in un termo miscelatore orbitale con un coperchio per sette giorni a 37 gradi Celsius mentre si trema a 1.000 giri/min.
Alla fine di sette giorni, il contenuto del tubo dovrebbe apparire torbido. In primo luogo, indossa tutti i dispositivi di protezione individuale necessari tra cui guanti, un camice da laboratorio e uno scudo facciale. Quindi, in una cappa di coltura cellulare, attaccare una sonda di 3,2 mm di diametro al convertitore.
Impostare l'ampiezza dei sonicatori sul 30% e l'impulso su un secondo e un secondo di riposo e l'ora su un minuto. Scongelare le fibrille a temperatura ambiente e, pur essendo ancora nel cappuccio di coltura, diluire le fibrille con dPBS sterile. Successivamente, inumidire un tessuto da laboratorio con il 70% di etanolo e utilizzarlo per pulire la sonda del sonicatore per pulirlo.
Immergere la punta della sonda in acqua doppia distillata e pulirlo 10 volte per pulire ulteriormente la sonda. Dopo questo, asciugare la sonda con un tessuto da laboratorio. Posizionare la punta della sonda pulita nel tubo delle fibrille diluite e posizionare la punta nella parte inferiore del tubo.
Sonicare le fibrille diluite utilizzando i parametri precedentemente impostati mentre si sposta la sonda su e giù durante ogni impulso per garantire che tutte le fibrille nel liquido siano sonicate. Dopo la sonicazione, centrifugare brevemente per un secondo a 2.000 g per raccogliere tutto il liquido dai lati del tubo. Immergere la punta della sonda in 1%SDS e pulirlo 10 volte per pulire la sonda.
Quindi, rimuovere la punta dall'SDS e immergerla in acqua distillata doppia e pulsare 10 volte. Pulire la sonda con un tessuto da laboratorio inumidito con il 70% di etanolo e asciugarla con un tessuto da laboratorio asciutto. Staccare la sonda dal convertitore e conservare.
Successivamente, pulire tutte le superfici della cappa con 1%SDS seguito dal 70% di etanolo. Per iniziare, posizionare un tubo capillare in vetro siliconizzato in un estrattore di ago di vetro. Accendere l'elemento riscaldante e consentire ai pesi attaccati di allungare il tubo capillare in vetro riscaldato.
Successivamente, utilizzare le forbici per tagliare il tubo capillare in vetro tirato nel punto più sottile del mezzo e rimuovere l'ago di vetro dall'estrattore dell'ago di vetro. Quindi, utilizzare le forbici per tagliare una lunghezza di tubi di involucro termoretraibile a circa 40 mm. Far scorrere l'involucro termoretraibile sull'ago metallico di una siringa smussata da 10 microliter.
Utilizzare una fiamma aperta per riscaldare e aderire all'involucro termoretraibile all'ago, assicurandosi di ruotare l'ago per applicare il calore in modo uniforme. Far scorrere con attenzione l'estremità più grande dell'ago di vetro tirato sopra l'ago metallico della siringa. Successivamente, tagliare una lunghezza di tubi avvolgenti termoretraibile a circa 40 mm e farla scorrere con cura sopra l'ago di vetro per sovrapporre la base dell'ago di vetro e l'ago metallico della siringa.
Utilizzare una fiamma aperta per riscaldare l'involucro termoretraibile per fissare l'ago di vetro all'ago metallico. Per fissare ulteriormente l'ago e prevenire potenziali perdite, tagliare una lunghezza aggiuntiva di tubi di avvolgimento termoretraibile a circa 40 mm e far scorrere con cura sull'ago di vetro per sovrapporre la base dell'ago di vetro e l'ago metallico della siringa. Utilizzare una fiamma aperta per riscaldare l'involucro termoretraibile per fissare l'ago di vetro all'ago metallico.
Quindi, utilizzare le forbici per tagliare l'ago di vetro in modo che la punta sia lunga circa 8 mm. Per testare l'ago, riempire una siringa da 1 ml con un ago da 26 gauge attaccato con acqua distillata. Rimuovere lo stantuffo metallico dalla siringa personalizzata dell'ago di vetro e inserire l'ago della siringa riempita d'acqua nella base della siringa personalizzata.
Ispezionare l'interfaccia dell'ago di vetro e dell'ago metallico alla ricerca di perdite e confermare un flusso costante di acqua. Quindi, riempire un tubo di micro centrifuga con acqua distillata. Utilizzare la siringa personalizzata per l'ago di vetro per disegnare nell'acqua distillata.
Ispezionare l'ago per confermare che il liquido viene preso nella siringa e che non ci sono bolle. Se ci sono bolle o se l'acqua non viene prelevata nell'ago, tagliare l'ago può aiutare ad alleviare la pressione. Successivamente, conservare attentamente la siringa con gli aghi di vetro attaccati, nelle scatole della siringa fino a quando necessario per gli interventi chirurgici.
L'esame con microscopia elettronica a trasmissione conferma la presenza di fibrille lunghe. In confronto, i monomeri alfa-sinuleina sono visibili all'orzo e non hanno una forma distinguibile. La conferma analoide delle fibrille viene quindi confermata utilizzando un saggio Thioflavin T.
Un saggio rappresentativo mostra che i monomeri dPBS e mouse producono un segnale inferiore nelle unità di flouresent relative rispetto ai PFF del topo. Il monomero umano alfa-sinuleina produce un segnale simile al monomero del mouse. Mentre i PFF umani producono anche un segnale più alto dei monomeri.
Per valutare la presenza di fibrille pelitibili, viene eseguito un saggio di sedimentazione. Sia nei campioni di PFF del topo che in quelli umani, l'infrazione supernata dovrebbe avere più proteine nel pellet rispetto al supernatante. Al contrario, la maggior parte della proteina del topo e dei monomeri umani è presente nel supernatante con poco presente nel pellet.
Sia i PFF topo che umani sono sonicati per produrre PFF di lunghezza appropriata per la semina di inclusioni alfa sinuleina. Un esame completo di circa 500 fibrille rivela che la lunghezza media delle fibrille di topo è di circa 44 nanometri. Con l'86,6% dei PFF che misurano 60 nanometri o meno.
I PFF umani, tuttavia, hanno una lunghezza media di circa 55,9 nanometri con il 69,6% dei PFF che misurano 60 nanometri o meno. L'esame in vivo dell'efficacia del PFF è confermato utilizzando l'immunoistochimica. Le inclusioni formate nella substantia nigra, condividono proprietà simili ai corpi di Lewy in quanto contengono sinuleina alfa fosforilata, contengono strutture aminloyed e macchie con tioflavina S e sono resistenti alla digestione proteinasi K.
La sonicazione può esporre l'individuo sonicante a fibrille preformate aerosolizzate. Come tale, dovrebbe essere indossato un abbigliamento di sicurezza adeguato e la sonicazione eseguita in una cappa per ridurre al minimo il rischio di esposizione.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo completo per la generazione e la validazione di fibrille precostituite di alfa-sinucleina (α-syn PFFs) da utilizzare in modelli in vivo di sinucleinopatia, in particolare della malattia di Parkinson. Il protocollo descrive ogni passaggio, dalla preparazione del monomero al controllo di qualità e all'iniezione neurochirurgica, con l'obiettivo di standardizzare il processo e garantire una patologia dell'α-sin riproducibile nei modelli rodentici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Neurodegenerazione
- Modellizzazione della malattia di Parkinson
Sfondo
- I modelli basati sui fibrilli di α-sinucleina (α-syn PFF) sono ampiamente utilizzati per lo studio delle sinucleinopatie e della malattia di Parkinson.
- La generazione e l'applicazione costante degli α-syn PFF sono fondamentali per ottenere una patologia riproducibile.
- Gli α-syn PFF inducono le caratteristiche distintive della malattia di Parkinson, inclusi gli aggregati di α-sinucleina fosforilata e la neurodegenerazione.
- Protocolli standardizzati contribuiscono a risolvere le incoerenze osservate tra diversi laboratori.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato e standardizzato per la generazione di fibrille di α-sin da monomeri.
- Illustrare le fasi di controllo qualità per garantire l'integrità delle fibrille e la loro capacità di innesto.
- Descrivere la preparazione e l'uso di aghi di vetro personalizzati per iniezioni neurochirurgiche precise.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di monomeri di α-sinucleina e diluizione a 5 mg/mL in dPBS.
- Fibrillizzazione mediante agitazione a 37°C per 7 giorni a 1.000 giri al minuto.
- Controllo di qualità post-fibrillizzazione: saggio di sedimentazione, saggio con tioflavina T e microscopia elettronica a trasmissione.
- Sonicazione delle fibrille per ottenere una lunghezza ottimale (media ~50 nm), con procedure di pulizia e sicurezza.
- Assemblaggio e validazione di aghi in vetro personalizzati per iniezione stereotassica.
- Immunohistochimica per confermare la patologia in vivo (inclusioni di α-sinucleina fosforilata).
Risultati principali
- Generati con successo PFF di α-sinucleina murina e umana con lunghezze medie rispettivamente di 44 nm e 55,9 nm.
- Saggi di controllo qualità hanno confermato la conformazione amiloide e la presenza di fibrille pellettabili nei campioni di PFF.
- L'iniezione in vivo di PFF ha indotto la formazione di inclusioni nella sostanza nera, simili ai corpi di Lewy.
- L'immunostaining ha rilevato α-sinucleina fosforilata e strutture amiloidi resistenti alla digestione con Proteinasi K.
Conclusioni
- Il protocollo consente la generazione e la validazione affidabili di PFF α-sin per la modellizzazione delle sinucleinopatie.
- Una preparazione standardizzata e un controllo qualità accurato sono essenziali per ottenere risultati riproducibili tra diversi studi.
- Questo approccio facilita lo studio della progressione della malattia e degli interventi terapeutici nei modelli di malattia di Parkinson.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La generazione standardizzata e la validazione di fibrille precostituite di alfa-sinucleina (PFFs) sono fondamentali per modellare le sinucleinopatie e consentire ricerche riproducibili sul morbo di Parkinson. Questo protocollo affronta le principali sfide della fase di scoperta garantendo una qualità costante delle fibrille, sostenendo una patologia in vivo solida e facilitando il confronto tra laboratori. Una produzione affidabile di PFFs costituisce la base per la fiducia predittiva nei modelli preclinici di neurodegenerazione e orienta la verifica delle ipotesi terapeutiche in diversi portafogli di ricerca e sviluppo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Permette l'analisi dei meccanismi di aggregazione dell'alpha-sinucleina rilevanti per la patologia del morbo di Parkinson.
- Consente la riduzione del rischio biologico fornendo un sistema riproducibile per la validazione funzionale degli obiettivi.
- Facilita una previsione affidabile nell'associare la patologia molecolare ai fenotipi della malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara PFFs validati per l'uso in flussi di lavoro di screening basati su cellule e in vivo.
- Standardizza gli input del saggio attraverso un rigoroso controllo di qualità e la conferma delle dimensioni.
- Consente una valutazione riproducibile e quantitativa degli effetti dei composti sulla patologia dell'alfa-sinucleina.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli preclinici a biomarcatori pertinenti alla malattia, come l'alfa-sinucleina fosforilata.
- Supporta la continuità dalla scoperta meccanicistica alla validazione in vivo di interventi terapeutici.
- Fornisce una piattaforma per l'avanzamento di programmi sulla neurodegenerazione con valutazione del rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo integra le fasi iniziali della scoperta fino alla validazione preclinica, sostenendo la verifica delle ipotesi, lo sviluppo di saggi e la ricerca traslazionale nei percorsi di neurodegenerazione.
- Biologia della Scoperta: Consente test robusti dell'ipotesi nulla riguardo all'aggregazione e alla patologia dell'alfa-sinucleina.
- Screening: Fornisce PFF standardizzati e riproducibili per saggi di screening quantitativi.
- Analisi: Fornisce letture di sedimentazione, Thioflavin T e microscopia elettronica per la convalida dei lotti e il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca Translazionale: Collega la patologia in vitro e in vivo a endpoint rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro convalidato e riutilizzabile per la modellizzazione delle sinucleinopatie in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli di neurodegenerazione.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità nella produzione e applicazione di PFF.
- Valore strategico: Migliora la qualità delle decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza nell'uso del capitale nei portafogli di neurodegenerazione nelle fasi iniziali.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di candidati terapeutici pertinenti alla malattia, adeguati al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specialistiche in biochimica delle proteine, tecnica neurochirurgica e validazione analitica.
- Richiede l'accesso a strumentazione per la sonificazione, la microscopia elettronica e i saggi di fluorescenza.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione interdisciplinare delle fasi di controllo qualità e di validazione dei lotti.
- L'adattamento tra specie e sistemi modello potrebbe richiedere l'ottimizzazione del protocollo e una validazione pilota.
- I protocolli di sicurezza sono essenziali durante la sonificazione per ridurre al minimo i rischi di esposizione, come indicato nel protocollo.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:13
Formation of α-synuclein Preformed Fibrils from Monomers
2:20
Sonication of α-synuclein Preformed Fibrils
4:37
Preparation of Custom Glass Needle Syringes for Stereotactic Injections
7:18
Results: Analysis of the Generated Alpha-Synuclein Preformed Fibrils
9:22
Conclusion
