Name: In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Scopri la macroscopia di fluorescenza per l'imaging in vivo del trasporto del liquido cerebrospinale attraverso il teschio intatto del topo. Questa tecnica consente misurazioni dinamiche del sistema ginfatico in modo minimamente invasivo.

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Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke e dal National Institute on Aging (US National Institutes of Health; R01NS100366 e RF1AG057575 a MN), il programma Fondation Leducq Transatlantic Networks of Excellence e il programma di ricerca e innovazione EU Horizon 2020 (n. 666881; SVDs-target). Ringraziamo anche Dan Xue per l'assistenza di esperti con illustrazioni grafiche.

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato universitario per le risorse animali (UCAR, Protocollo n. 2011-023) presso l'Università di Rochester ed eseguiti secondo la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Preparazione della cisterna magna cannula, della piastra di testa e del supporto della testa
<ol><li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e le piastre della testa prima dell'intervento chirurgico. NOTA: I traccianti fluorescenti vengono consegnati direttamente in CSF tramite una cannulazione cisterna magna. Per istruzioni dettagliate su questa procedura, fare riferimento a Xavier et al9.</li>
	<li>In breve, utilizzando un driver ad ago, rompere la punta di un ago 30G x 12,7 mm (1/2 pollici), 3/4 della strada verso il basso, e posizionare l'estremità smussata dell'ago in un'estremità del tubo di polietilene 10 (PE10) (circa 45 cm di lunghezza). Assicurarsi che solo lo svelatura sporge dal bordo del tubo PE10.</li>
	<li>Rompere 1/4 dell'estremità smussata di un altro ago 30G e posizionare l'estremità smussata dell'ago rimanente nell'altra estremità del tubo PE10, con la plastica Luer-lock ancora attaccata.</li>
	<li>Riempire una siringa di vetro da 100 -L con un CSF artificiale sterile (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 10 mM di glucosio e 26 mM NaHCO3).</li>
	<li>Fissare la siringa all'estremità della linea e riempirla con aCSF fino a raggiungere la punta dell'ago smussato. È importante che la siringa sia riempita con aCSF e non aria, poiché una colonna d'aria è più soggetta a volumi di infusione variabile.</li>
	<li>Per esperimenti cronici, lasciare la linea riempita con aCSF e saltare il passaggio 1.7.</li>
	<li>Per esperimenti acuti, posizionare la siringa su una pompa di infusione e ritirare circa 5 mm di aria, che impedirà la miscelazione. Successivamente, ritirare il volume totale di traccianti desiderato per l'esperimento (20% in più è raccomandato a causa di perdite di spazio morto). NOTA: Il tubo PE10 deve essere abbastanza lungo in modo che la bolla d'aria non entri nel polsino di plastica della siringa di vetro durante il caricamento del tracciante. Per un esperimento tipico, il protocollo utilizza 10 l di albumina di siero bovino coniugata ad Alexa Fluor 647 (BSA-647) diluito in aCSF allo 0,5%.</li>
	<li>Confermare che la piastra di testa si inserisce nel supporto della testa e che è la dimensione giusta per il mouse utilizzato. Marcatori anatomici per garantire questo sono: il bordo superiore della finestra si allinea con la linea interoperabile e il bordo posteriore cade rostral alla cresta occipitale. NOTA: le piastre di testa in acciaio inossidabile possono essere sterilizzate e riutilizzate. La maggior parte delle miscele di cianoacrilato possono essere rimosse con una soluzione di acetone.</li>
</ol>2. Procedura chirurgica
<ol><li>Pesare e anestesizzare il topo (ad esempio ketamina/xylazina; 100 mg/kg di ketamina, 10 mg/kg di xilarina; i.p.).</li>
	<li>Una volta che il mouse non risponde più a un pizzico di punta, inumidire il collo e la testa con acqua sterile e radere con i clipper. Una volta rasata l'area, pulire nuovamente l'area con un tampone alcolico per rimuovere eventuali capelli residui. NOTA: L'umidità della pelliccia prima del ritaglio riduce drasticamente la quantità di peli nella finestra di imaging dopo l'incisione.</li>
	<li>Posizionare il mouse in una cornice stereotassica sopra un pad a temperatura controllata e applicare unguento oftalmico di petrolio agli occhi del mouse per assicurarsi che non si asciughino.</li>
	<li>Pulire la pelle esposta con un tampone di cloressia. Dopo 2 min, rimuovere la clorhesiadina con una salvietta alcolica. Infine, applicare una soluzione di iodio che può essere lasciata asciugare.</li>
	<li>Iniettare analgesia sottocutanea (0,25% Bupivacaine HCl) nella parte superiore del cranio e del collo.</li>
	<li>Partendo dalla parte del collo che copre la cresta occipitale, fai un taglio di linea mediana nella pelle sovrastante e continua tristemente verso la linea interorbitale. Incise lateralmente al confine dove il muscolo temporale si inserisce nel cranio. Rimuovere tutta la pelle dell'incisione fusiforme per esporre sia le ossa frontali che le ossa parietali. INFORMATIVA: Il sinus retroorbitale si trova caudale agli occhi e grandi rami della vena facciale posteriore si trovano rostral alla pinna. Fare attenzione quando si effettua l'incisione per risparmiare queste strutture. In questo caso, interrompere il sanguinamento mantenendo l'emostasi con un tampone di cotone sterile per diversi minuti e continuare.</li>
	<li>Irrigare il cranio con sterile salina e pulire la superficie utilizzando tamponi di cotone in modo che sia privo di detriti e capelli dal momento che questi interferiranno con la qualità dell'immagine. La trasparenza del cranio è meglio preservata lasciando intatta la fascia periosteo e la fascia sovrastante. NOTA: Se queste strutture vengono accidentalmente rimosse, il cranio può diventare asciutto e opaco nel tempo. Re-inumidire con aCSF o utilizzare una miscela di olio di paraffina e glicerolo per ridurre la riflettanza del cranio negli esperimenti acuti21.</li>
	<li>Procedere con l'inserimento della cisterna magna cannula - per i dettagli chirurgici di questa procedura, fare riferimento a Xavier et al9.</li>
	<li>Dopo aver inserito la cannula CM, applicare una miscela di cemento dentale con colla cianoacrilata sul lato ventrale della piastra di testa intorno al bordo e posizionarla sul cranio in modo che il bordo anteriore della piastra della testa si allinei con la punta posteriore dell'osso nasale e bordo sterior si allinea con l'aspetto anteriore dell'osso interparietale, assicurandosi che la sutura sagittale (linea mediana) sia centrata e dritta rispetto alla finestra (Figura 1B).</li>
	<li>Fissare la posizione della piastra di testa utilizzando un paio di gocce di acceleratore di colla. Riempire le lacune rimanenti con la miscela di cemento e curarlo con acceleratore. AGGIORNAMENTO: Assicurarsi che il cianoacrylato non entri in contatto con gli occhi del mouse o blocchi la finestra di imaging.</li>
	<li>Incollare la cannula CM alla piastra di testa per assicurarsi che non si stacchino durante il trasporto o quando il mouse si sveglia.</li>
	<li>Per esperimenti acuti, andare al passaggio 2.16.</li>
	<li>Per esperimenti cronici, applicare un sottile strato di colla cianoacrilata trasparente al cranio esposto, facendo attenzione a non creare bolle in quanto queste interferiranno con l'imaging. La colla fornisce protezione per il cranio e non interferisce con l'imaging. Assicurarsi che la colla copra il cranio esposto fino alla pelle al bordo dell'incisione.</li>
	<li>Utilizzare un morsetto emostat per tenere il tubo PE10 riempito con aCSF 2-3 cm dal CM e tagliare la linea con una punta di cautery ad alta temperatura. Una volta separato, appiattire il tubo PE10 fuso per sigillare la cannula. AGGIORNAMENTO: Assicurarsi di non rilasciare il morsetto fino a dopo che la cannula è stata sigillata e confermare che non ci sono perdite nel tubo per evitare una fistola CSF.</li>
	<li>Amministrare il carprofene (5 mg/kg ogni 24 h per 3 giorni; i.p. o s.c.) e riportare il mouse in una gabbia mono-casa controllata a temperatura e lasciarla recuperare per almeno 24 h prima dell'imaging. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non riacquista sufficiente consapevolezza per mantenere la recumbency sternale. Le finestre craniche intatte rimangono stabili per diverse settimane. NOTA: l'esperimento cronico può essere messo in pausa qui. ATTIVITA': Alcune complicazioni postoperatorie sono: cefalohematoma/ematomi subgaleali, fistola CSF e infezione.</li>
	<li>Per esperimenti acuti, posizionare il mouse nel supporto della testa utilizzando la piastra di testa in modo che il cranio si trova in una posizione fissa. Assicurarsi di controllare il livello di anestesia e posizionare un pad di riscaldamento sotto il mouse. Il mouse è ora pronto per essere portato al macroscopio. AVVISO: Trasportare con attenzione il mouse insieme alla pompa di infusione su un carrello. Se la cannulation CM si sposta, causerà un calo della pressione intracranica e qualsiasi perdita di CSF altererà i risultati sperimentali.</li>
</ol>3. Preparazione del mouse per l'imaging
NOTA: il protocollo varia a seconda che l'esperimento di imaging venga eseguito su un mouse acuito (a partire dal passaggio 3.1) o sveglio (a partire dal passaggio 3.2).
<ol><li>Topi anestesizzati<ol>
<li>Posizionare il supporto della testa sullo stage del macroscopio, assicurandosi che non ci siano nodi nella linea dalla pompa delle siringhe alla cannula CM e che non sia tesa poiché ciò potrebbe influenzare l'infusione del tracciante.</li>
		<li>Osservare la frequenza respiratoria e la colorazione rosa delle membrane mucose, indicando una buona ossigenazione. Iniettare la solina sottocutanea per garantire il livello di idratazione, se necessario. Verificare che l'animale sia sufficientemente anetizzato e, se necessario, ri-dosaggio.</li>
		<li>Accendere la fotocamera macroscopio e LED e avviare la modalità LIVE.</li>
		<li>Confermare l'ingrandimento del campo di imaging in modo che la sutura nasofrontale nella parte superiore del campo e la sutura lambdoid nella parte inferiore sia chiaramente visualizzata, con la sutura sagittale parallela e centrata al centro dell'immagine (Figura 1C). Una volta in posizione, fissare il supporto della testa allo stadio macroambito con nastro adesivo.</li>
		<li>Concentrare il macroscopio sul cranio esposto. Nonostante i macroscopi abbiano una profondità di campo relativamente grande, la curvatura del cranio del topo consente solo che un'area specifica sia messa a fuoco. I migliori risultati si ottengono quando il piano focale si trova sui lati laterali delle ossa parietali posteriori alle suture coronali. NOTA: Questa è la posizione delle arterie cerebrali centrali (MCA), dove si verifica la maggior parte dell'afflusso di CSF (Figura 1D,E)10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Topo sveglio<ol>
<li>Prima della sessione di imaging, lasciare che gli animali si riprendano per almeno 24 ore dall'intervento chirurgico della piastra della testa. Si raccomandano anche periodi di recupero più lunghi (5-7 giorni). Durante questo periodo, allenare il mouse a essere fissato a testa sul palco nel tubo di ritenuta per 0,5-1 h al giorno per la durata del periodo di recupero. NOTA: L'abitudine consente al mouse di essere attaccato al supporto della testa senza anestesia e riduce lo stress e l'ansia durante l'esperimento vero e proprio. Se questo non è fattibile e l'anestesia non interferisce con l'esperimento, una dose di induzione di un anestetico inalato (ad esempio, isoflurane 2% a 1-2 L/min O2 flow rate) può essere utilizzata per collegare rapidamente il mouse alla fase della testa.</li>
		<li>Una volta che il mouse è fissato al supporto della testa e nel tubo di ritenuta, seguire i passaggi 3.1.1-3.1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Infusione di traccianti CSF fluorescenti
<ol><li>
Canonaminazione acuta di CM
	<ol>
<li>Poiché il tracciante era già stato caricato nella cannula prima di essere collocato nella cisterna magna nel passo 1.6, impostare la pompa di infusione al tasso e al volume desiderati. I paradigmi di infusione utilizzati di routine sono 5-10 L a 1-2 l/min, ma questi parametri possono essere regolati a seconda del particolare esperimento, o delle dimensioni e dell'età dell'animale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Canulazione CM cronica
	<ol>
<li>Prima di iniziare la sessione di imaging, seguire i passaggi 1.2-1.7 per esperimenti acuti per preparare la linea di infusione per fornire i traccianti.</li>
		<li>Una volta che la linea è preparata, utilizzando un morsetto hemostat tagliare l'estremità sigillata della cannula CM cronica. Prendere l'ago dalla linea preparata nel passo 4.2.1 e inserirlo delicatamente nella cannula. Rilasciare il morsetto e utilizzare la pompa della siringa, far avanzare il tracciante CSF alla velocità di infusione desiderata (ad es., 2 gradi centigradi/min) per l'esperimento fino a quando il tracciante non raggiunge l'ago impiantato nel CM. AVVERTEnza: Se l'ago penetra attraverso il tubo quando collega la linea, rimuovere l'ago, tagliare il segmento trafitto e ripetere questo passaggio. Qualsiasi strappo nel tubo PE10 causerà una perdita e influenzare i risultati dell'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Impostazione della sessione di imaging
<ol><li>In base al tracciante fluorescente infuso, determinare la lunghezza d'onda dell'eccitazione e il tempo di esposizione per ogni canale. Scegliere il tempo di esposizione più breve necessario per visualizzare il tracciante al fine di massimizzare la risoluzione temporale dell'imaging time-lapse. Questo tempo di esposizione sarà utilizzato per tutti gli esperimenti successivi che mirano a confrontare il trasporto di CSF tra diversi animali. NOTA: un suggerimento consiste nell'utilizzare il tracciante nella linea CM per regolare il tempo di esposizione. Anche se questo è un primo approccio utile, questo dovrebbe essere ottimizzato nel tempo.</li>
	<li>Scegli la durata dell'esperimento e gli intervalli in cui le immagini verranno acquisite. Gli esperimenti normalmente durano tra 30-60 min a seconda di quale fase del trasporto glimphatico è di interesse. Per la maggior parte degli esperimenti sono sufficienti frequenze di fotogramma di 1 fotogramma/min e velocità.</li>
	<li>Impostare il nome del file e la directory di salvataggio.</li>
	<li>Se l'imaging sarà raccolto in aggiunta all'acquisizione simultanea di altre variabili (ad esempio, elettrocardiogramma, pressione sanguigna arteriosa, elettrofisiologia), il macroscopio e la pompa possono essere programmati per essere attivati con il software di acquisizione dati. Verificare che la funzione di attivazione sul macroscopio sia corretta prima di passare al passaggio successivo.</li>
</ol>6. Esperimento transcranica di imaging ottico
<ol><li>Avviare l'infusione del tracciante e l'imaging allo stesso tempo.</li>
	<li>Controllare regolarmente la cannula CM e il tubo PE10 per eventuali segni di una perdita. Se c'è qualche tracciante che perde al CM, i risultati di questo esperimento devono essere esclusi. NOTA: Se il tracciante inizia ad accumularsi nel cervelletto e non percorre il percorso glimphatico dell'MCA, è probabile che la cannula CM sia stata iniettata nel cervelletto. Questi dati non devono essere inclusi.</li>
	<li>Per gli esperimenti acuti, dopo il completamento dell'esperimento, rimuovere il mouse dal microscopio e verificare che sia ancora adeguatamente anetizzato. Decapitare rapidamente il topo e raccogliere il tessuto cerebrale. Immersione-correggere il cervello in 4% paraformaldeide (PFA) durante la notte a 4 gradi centigradi.<ol>
<li>Per esperimenti cronici, una volta completata l'imaging, rimuovere la linea CM dalla cannula, lavare con aCSF sterile e ricucire la cannula CM con una punta di cautery ad alta temperatura. Togliere il mouse dal supporto della testa e riportarlo alla sua gabbia. Ripetere questo processo fino a quando non sono necessarie ulteriori immagini, quindi seguire il passaggio 6.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Analisi dei dati
NOTA: le analisi basate su Matlab, come il front-tracking CSF, possono estrarre grandi quantità di dati quantitativi dai fronti traccianti in questi set di dati di imaging10,22. Tuttavia, questi tipi di file possono anche essere facilmente importati e analizzati in software di analisi delle immagini open-source come Fiji23.
<ol><li>Importate le pile di immagini in Figi utilizzando lo strumento di importazione Bioformati. Questa funzione manterrà i metadati del file che includono il tempo e la risoluzione dei pixel. Salvare la pila di immagini come file .tiff.</li>
	<li>Disegnare manualmente una regione di interesse (ROI) intorno al cranio o all'area di interesse utilizzando lo strumento di selezione poligono. Ad esempio, nella Figura 1G un ROI è stato disegnato separatamente per l'ipsilaterale e per l'emisfero contralaterale dopo una lesione cerebrale traumatica. Assicurarsi di aggiungere il ROI in Gestione ROI (Analizza>Strumenti>Gestione ROI) e salvarlo. NOTA: il trasporto CSF può essere quantificato in due modi principali: 1) intensità media di fluorescenza nel tempo o 2) area di afflusso espressa come percentuale del ROI o dell'area totale (mm2) dopo aver applicato una soglia. Quest'ultimo metodo (Figura 1H) verrà descritto nei passaggi successivi.</li>
	<li>Impostare la soglia sul fotogramma con fluorescenza massima (Seleziona immagine>Regola>Soglia...). I metodi di soglia automatizzati come Otsu sono normalmente bravi a rilevare il tracciante CSF. Applicare la soglia.</li>
	<li>Prima di andare avanti, assicurarsi che in Analizza>Imposta misurazioni siano selezionate le opzioni Area e Frazione area. Quindi, in Gestione ROI selezionare Altro>Multi Misura.</li>
	<li>Convertire il valore %Area in mm2 utilizzando il valore Area del ROI dell'output. I valori %Area riflettono la percentuale della superficie corticale dorsale con il tracciante CSF.</li>
	<li>Stampa l'afflusso del tracciante CSF in mm2 in funzione del tempo.</li>
</ol>

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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hit+%26+Run%27+model+of+closed-skull+traumatic+brain+injury+%28TBI%29+reveals+complex+patterns+of+post-traumatic+AQP4+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).</li>
<li>Plog, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+traumatic+injury+are+transported+from+brain+to+blood+via+the+glymphatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).</li>
<li>Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outflow+of+cerebrospinal+fluid+is+predominantly+through+lymphatic+vessels+and+is+reduced+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 1434(2017).</li>
<li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+amelioration+of+inflammation+and+cell+death+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury.</a> Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).</li>
<li>Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
<li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+lymphatic+efflux+limits+cerebrospinal+fluid+flow+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain.</a> Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).</li>
<li>Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+skull+chronic+windows+for+mesoscopic+wide-field+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo descritto un protocollo dettagliato per l'esecuzione di imaging TRANScranico CSF in topi vivi utilizzando macroscopi fluorescenti e traccianti fluorescenti disponibili in commercio. Questa tecnica è semplice e minimamente invasiva, ma quantitativa. L'imaging in vivo è ben correlato con metodi sensibili come il conteggio della scintillazione liquida di traccianti con etichetta radio, tra cui 3H-dextran e 14C-inulin dopo la consegna CM, e con la quantificazione della sezione coronale ex vivo<s...

Il liquido cerebrospinale (CSF) bagna il cervello e il midollo spinale ed è coinvolto nel mantenimento dell'omeostasi, nella fornitura di nutrienti e nella regolazione della pressione intracranica1. CSF nello spazio subaracnoideo entra nel cervello attraverso una rete di spazi perivascolari (PVS) che circondano le arterie corticali piali e poi scorre lungo arteriole penetranti2. Una volta nel parenchyma, CSF si scambia con il fluido interstiziale (ISF), trasportando metaboliti nocivi come l'amiloide-z (A) e gli aggregati proteici tau fuori dal cervello attraverso tratti di materia bianca a bassa resistenza e spazi perivenous2,3 . Questa via dipende dai canali astrogliali di acquaporina-4 (AQP4) ed è stata quindi definita il sistema gliale-linfatico (glimphatico)4. I prodotti di scarto del neuropil vengono infine eliminati dal CSF-ISF attraverso vasi linfatici vicino ai nervi cranici e nelle meningi verso i linfonodi cervicali5. Il fallimento di questo sistema è stato implicato in diverse malattie neurologiche come il morbo di Alzheimer6,7, lesioni cerebrali traumatiche3, e ictus ischemico ed emorragico8.
Il trasporto CSF può essere visualizzato infondendo traccianti nella cisterna magna (CM)9,10 e studi glimphatici in passato hanno utilizzato principalmente la microscopia a due fotoni4,11,12, 13, risonanza magnetica (RM)14,15,16,17ed ex vivo imaging3,6,11, 18 per valutare la cinetica tracciante. La microscopia a due fotoni è un metodo adatto per l'imaging dettagliato dei traccianti CSF nei PVS e del parenchyma a causa della sua alta risoluzione spaziale, tuttavia, ha un campo visivo stretto e richiede una finestra cranica invasiva o un assottigliamento del cranio. L'imaging ex vivo, in combinazione con l'immunohistochimica, consente analisi multilivello che vanno da singole cellule fino all'intero cervello19. Tuttavia, il processo di perfusione-fissazione che è necessario per osservare il tessuto post-mortem produce profondi cambiamenti nella direzione del flusso CSF e collassa il PVS, alterando significativamente la distribuzione e la posizione dei traccianti12. Infine, mentre la risonanza magnetica può tracciare il flusso di CSF in tutto il murino e il cervello umano, manca di risoluzione spaziale e temporale del flusso perivascolare.
Una nuova tecnica, l'imaging macroscopico transcranico, risolve alcuni di questi limiti consentendo l'imaging ad ampio campo del trasporto di CSF perivascolare nell'intera corteccia dorsale dei topi viventi. Questo tipo di imaging viene eseguito con un macroscopio epifluorescente utilizzando un cubo di filtro multibanda, una sorgente luminosa a LED regolabile e una fotocamera CMOS ad alta efficienza10. Questi set-up sono in grado di risolvere PVS fino a 1-2 mm sotto la superficie del cranio e in grado di rilevare fluorofori fino a 5-6 mm sotto la superficie corticale, lasciando il cranio completamente intatto10. Filtri multibanda e LED in grado di ottimizzare rapidamente la lunghezza d'onda dell'eccitazione consentono l'uso di più fluorofori che consentono alla CSF di essere etichettati con traccianti di diversi pesi molecolari e proprietà chimiche nello stesso esperimento.
Questa procedura richiede un intervento chirurgico semplice e minimamente invasivo per esporre il cranio e posizionare una piastra della testa leggera per stabilizzare la testa durante la sessione di imaging. I traccianti possono essere consegnati nel CM senza perforare nel cranio o penetrare nel tessuto corticale con pipette o cannulas9,20. Sia le cannule CM che le piastre della testa rimangono stabili da diversi giorni a settimane e facilitano progetti sperimentali più complessi rispetto alla classica visualizzazione del punto finale. Questo protocollo descrive come l'imaging macroscopico transcranico viene utilizzato per studiare la funzione del sistema glimphatico a seguito di iniezione acuta o cronica di tracciante CSF fluorescente nel CM di topi anestetizzati/dormienti o svegli.

<table><tbody><tr><td>0,25% Bupivacaina HCl</td><td></td><td></td><td>Università di Rochester Vivarium</td></tr><tr><td>100 &; L Siringa a tenuta di gas Modello 1710 TLL, PTFE Luer Lock</td><td>Hamilton Company</td><td>81020</td><td></td></tr><tr><td>A-M Systems Polvere di cemento dentale</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9991371</td><td></td></tr><tr><td>Carprofene</td><td></td><td></td><td>Università di Rochester Vivarium</td></tr><tr><td>Clorexidina</td><td>Prevantics</td><td>B10800</td><td></td></tr><tr><td>CMOS Camera</td><td>Hammamatsu</td><td>ORCA Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di testa</td><td>Università di Rochester</td><td>Nessun catalogo #</td><td>Su misura presso l'officina meccanica dell'Università di Rochester</td></tr><tr><td>Cautery ad alta temperatura</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>Insta-set Accelerator</td><td>Bob Smith Industries</td><td>BSI-151</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano - Fluriso</td><td>Vet One</td><td>502017</td><td>Università di Rochester Vivarium</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td></td><td></td><td>Strong Memorial Hospital Pharmacy</td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td>Elmer's Products, Inc</td><td>Nessun catalogo #, vedi link nei commenti</td><td>https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG</td></tr><tr><td>Nastro chirurgico Micropore</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027-761</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PE10 - Polietilene .011" x .024" per ft., 100 continua</td><td>Braintree Scientific</td><td>PE10 100 FT</td><td></td></tr><tr><td>Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td>PURALUBE VET UNGUENTO</td><td>Dechra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puritan PurSwab Bastoncini per la pulizia con punta in cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-553</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio macro zoom per la ricerca</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Piastra portatesta semplice (per topi)</td><td>Narishige International USA Inc</td><td>MAG-1</td><td></td></tr><tr><td>Aghi monouso, BD Medical</td><td>VWR</td><td>BD305106</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi sterili per la preparazione dell'alcol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>LED sintonizzabile</td><td>PRIOR Lumen 1600-LED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td></td><td></td><td>Università di Rochester Vivarium</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Il flusso del liquido cerebrospinale (CSF) nei roditori è stato ampiamente studiato utilizzando la quantificazione ex vivo dei traccianti. Tecniche come la microscopia a due fotoni e la risonanza magnetica (MRI) hanno permesso la quantificazione in vivo del flusso CSF, ma sono limitate rispettivamente dalla riduzione dei volumi di imaging e dalla bassa risoluzione spaziale. Recenti lavori hanno scoperto che il CSF entra nel parenchyma cerebrale attraverso una rete di spazi perivascolari che circondano il pial e le arterie penetranti della corteccia dei roditori. Questa entrata pericolare di CSF è un fattore principale del sistema glimphatico, una via implicata nella clearance dei soluti metabolici tossici (ad es. amiloide-z). Qui, illustriamo una nuova tecnica di imaging macroscopico che permette l'imaging mesoscopico in tempo reale dei traccianti CSF fluorescenti attraverso il cranio intatto dei topi vivi. Questo metodo minimamente invasivo facilita una moltitudine di progetti sperimentali e consente test singoli o ripetuti delle dinamiche CSF. I Macroscopi hanno un'alta risoluzione spaziale e temporale e la loro grande distanza di gantry e lavoro consentono l'imaging durante l'esecuzione di attività sui dispositivi comportamentali. Questo approccio di imaging è stato convalidato utilizzando misurazioni di imaging a due fotoni e fluorescenza ottenute da questa tecnica fortemente correlate alla fluorescenza ex vivo e alla quantificazione dei traccianti con etichetta radio. In questo protocollo, descriviamo come l'imaging macroscopico transcranico può essere utilizzato per valutare il trasporto glimphatico nei topi vivi, offrendo un'alternativa accessibile a modalità di imaging più costose.

L'afflusso di CSF è rappresentato su un macroscopio epifluorescente (Figura 1A), che consente l'imaging mesoscopico del trasporto tracciante CSF nella corteccia murina. La piastra della testa integrale permette la visualizzazione delle ossa nasali rostrali, sia ossa frontali che parietali al centro, e la porzione rostrale dell'osso interparietale caudally (Figura 1B). Durante l'imaging, le suture nasofrontale, sagittale, coronale e lambdoid possono essere facilm...

L'imaging ottico transcranico consente l'imaging ad ampio campo del trasporto di fluidi cerebrospinali nella corteccia di topi vivi attraverso un cranio intatto.

In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Questa nuova tecnica per l'imaging mesoscopico in tempo reale di tracce florescenti di CSF attraverso il cranio intatto di topi vivi può essere utilizzata per valutare il trasporto linfomanico. Il vantaggio principale è che questa tecnica consente misurazioni dinamiche di traccianti intracisternali in vivo a una frazione del costo di altre modalità di imaging. Le procedure necessarie per posizionare la piastra della testa sulla cisterna magna cannula sono semplici e minimamente invasive ma richiedono una pratica corretta.La dimostrazione visiva dei passaggi critici di questo metodo è necessaria per massimizzare la qualità dell'immagine e consentire confronti riproducibili tra topi diversi e gruppi sperimentali. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi bagnato il collo e la testa con acqua sterile e radere la pelliccia inumidita. Pulire la pelle esposta con un tampone alcolico per rimuovere eventuali capelli residui e posizionare il mouse in un telaio stereotattico sopra un tampone a temperatura controllata.Applicare un unguento sugli occhi degli animali e pulire la pelle esposta con un tampone di clorexidina. Dopo 2 minuti rimuovere la clorexidina con una salvietta alcolica e applicare una soluzione di iodone. Quando lo iodone ha essiccato iniettare analgesia sottocutanea nella parte superiore del cranio e del collo.Partendo dalla parte del collo che copre la crosta occipitale, fare un taglio a metà linea nella pelle sovrastante proseguendo rostralmente verso la linea intraorbitale. Estendere l'incisione lateralmente al bordo dove il muscolo temporale si inserisce nel cranio e rimuovere tutta la pelle dell'incisione fusiforme per esporre sia le ossa frontali che parietali. Irrigare il cranio con soluzione salina sterile e utilizzare tamponi di cotone per pulire la superficie fino a quando non è priva di detriti e capelli.Dopo aver inserito la cisterna magna cannula applicare una miscela di cemento dentale e colla cianoacrilato sul lato ventrale della piastra della testa intorno al bordo. Posizionare la piastra della testa sul cranio in modo che il bordo anteriore della piastra si allinei con la punta posteriore dell'osso nasale e il bordo posteriore si allinei con l'aspetto anteriore dell'osso interparietale assicurandosi che la sutura sagittale sia centrata e dritta rispetto alla finestra. È importante assicurarsi che la piastra della testa sia fissata e che non ostruisca il campo visivo della cannula cisterna magna.Utilizzare un paio di gocce di acceleratore di colla per fissare la posizione della piastra della testa e riempire eventuali spazi rimanenti con la miscela di cemento. Incollare la cisterna magna cannula sulla piastra della testa e utilizzare la piastra della testa per posizionare il mouse nel supporto della testa in posizione fissa. Posizionare con cura il mouse e la pompa di infusione attaccati alla cannula su un carrello per il trasporto al macroscopio e posizionare il supporto della testa sul palco del macroscopio.Assicurarsi che la linea dalla pompa della siringa alla cisterna magna cannula non sia tesa e che non abbia nodi. Osservare la frequenza respiratoria e la colorazione rosa delle membrane del muco per confermare una buona ossigenazione. Accendi la fotocamera del macroscopio e il diodo che emette luce e avvia la modalità live.Regolare l'ingrandimento del campo di imaging in modo che la sutura nasofrontale nella parte superiore del campo e la sutura lambdoide nella parte inferiore possano essere chiaramente visualizzate. Una volta in posizione nastro il supporto della testa allo stadio macroscopio e mettere a fuoco il macroscopio sul cranio esposto fino a quando il piano focale non si trova sui lati laterali delle ossa parietali posteriori alle suture coronali. Per l'infusione di tracciante CSF impostare la pompa per infusione alla velocità e al volume appropriati e impostare la lunghezza d'onda di eccitazione e il tempo di esposizione appropriati per il tracciante per ciascun canale.Quindi verificare che la funzione di attivazione sul macroscopio sia corretta prima di avviare contemporaneamente l'infusione di tracciante e l'imaging. Durante l'imaging le suture naso frontali, sagittali, coronali e lambdoidi possono essere facilmente identificate. Una volta che il tracciante CSF è stato infuso nella cisterna magna, la fluorescenza del tracciante viene osservata per la prima volta in grandi pozze di CSF subaracnoide alla cisterna olfattofrontale e alla cisterna quadrigeminale vicino alla rientranza pineale e infine circondando le arterie cerebrali centrali.I traccianti CSF entrano quindi nel loro cervello lungo gli spazi vascolari peri dei rami pettorale corticali dell'arteria cerebrale centrale. L'imaging di trasporto CSF dopo una lesione cerebrale traumatica rivela tracciante inizialmente alla cisterna olfattofrontale, ma l'afflusso linfomanico lungo gli spazi perivascolari corticali è completamente abolito sul lato della lesione. L'analisi quantitativa nelle immagini in vivo dimostra che l'area di afflusso ipsilaterale è diminuita di quasi un terzo rispetto all'emisfero contralaterale.Per evitare artefatti di movimento e i cambiamenti nel piano focale ricordarsi di fissare correttamente la piastra della testa e il supporto della piastra della testa e controllare il livello di anestesia dell'animale. Dopo l'esperimento i risultati dell'imaging in vivo possono essere ulteriormente convalidati quantificando la penetrazione del tracciante utilizzando l'attuale Questa tecnica consente lo studio del sistema glimphatico in modo fisiologico e minimamente invasivo e può aiutare ad affrontare le domande future sull'idrodinamica del CSF in salute e malattia.

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Fonte: Sweeney, A. M., et al. Imaging in vivo del trasporto del liquido cerebrospinale attraverso il cranio di topo intatto mediante macroscopia a fluorescenza. (2019)Questo video dimostra il processo di visualizzazione del flusso del liquido cerebrospinale (CSF) nel cervello di un topo utilizzando l'imaging a fluorescenza. Un tracciante fluorescente viene iniettato nella cisterna magna (CM), consentendo di tracciare il suo movimento con il liquido cerebrospinale attraverso gli spazi...

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In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza (Video) | JoVE Journal

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