Schermi genetici basati su CRISPR in cellule mammaliane

Gli schermi drop-out schermati CRISPR forniscono ai ricercatori un metodo semplice, efficiente ed economico per interrogare la funzione della catena a livello genomico. Il vantaggio di CRISPR è la sua flessibilità di modificare qualsiasi gene semplicemente cambiando la sequenza di guida. Le librerie di guide CRISPR consentono ai ricercatori di interrogare l'intero genoma di qualsiasi organismo in un unico esperimento in modo imparziale e sistematico.

Attualmente, gli schermi CRISPR vengono utilizzati per identificare i geni essenziali in centinaia di tumori umani e per mappare le interazioni genetiche. Gli schermi possono anche profilare in modo completo i farmaci per rivelare i meccanismi d'azione dei farmaci. Le librerie CRISPR qui descritte si rivolgono alle cellule umane.

Tuttavia, le librerie di guide rivolte ad altre specie, come il mouse, sono disponibili e possono essere schermate in modo simile. L'esecuzione di schermi a livello genomico nelle cellule umane può essere scoraggiante nella pratica, in quanto comporta la gestione di decine di milioni di cellule e richiede l'analisi di grandi serie di dati. Prima di avviare uno schermo, assicurarsi che le linee cellulari siano accuratamente caratterizzate.

Ciò include la conoscenza della purezza della linea cellulare, il raddoppio del tempo, l'efficienza di trasduzione del lentivirus e la sensibilità agli agenti di selezione degli antibiotici. Una dimostrazione visiva fornirà un'immagine di come gestire praticamente i milioni di celle richieste in uno schermo e tenere traccia di migliaia di perturbazioni in modo sistematico. A dimostrare la procedura saranno Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh e Ryan Climie, tutti tecnici del mio laboratorio.

Inizia trasformando il plasmide di sgRNA CRISPR già pronto in cellule elettrocompetenti e coltivandoli secondo le indicazioni manoscritte. Quando sei pronto per raccogliere le colonie, aggiungi sette millilitri di LB con carbenicillina ad ogni piatto e raschia le colonie con lo spargitore di cellule. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire le cellule raschiate in un pallone conico sterile da un litro e sciacquare la piastra con cinque millilitri di LB con carbenicillina.

Ancora una volta, trasferire la soluzione di risciacquo nel pallone. Centrifugare le cellule secondo le indicazioni manoscritte, quindi determinare il peso del pellet umido. Purificare il DNA plasmide utilizzando un kit di purificazione plasmide in scala Maxi o Mega.

Preparare le cellule per la trasfezione seminando 293 cellule T e incubandole durante la notte. Il giorno successivo, preparare la miscela di tre plasmidi di trasfezione per piastre di 15 centimetri. Calcola la quantità di plasmide necessaria per una trasfezione e crea un mix di plasmidi per il numero di piastre, più una, da trasfetto.

Successivamente, preparare un reagente di trasfezione a base lipidica per ogni trasfezione e mezzi sieri a riduzione aliquota in singoli tubi microcentrifugo da 1,5 millilitri per il numero di piastre da trasflessire. Aggiungere il reagente di trasfezione, mescolare delicatamente e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere il DNA al reagente di trasfezione con un rapporto tre a uno tra reagente di trasfezione e microgrammi di complesso di DNA.

Mescolare delicatamente la soluzione e lasciare a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere la miscela di trasfezione alle celle di imballaggio e incubarle secondo le indicazioni manoscritte. Il giorno della raccolta virale, controllare le cellule per la morfologia anomala e fusa come indicazione di una buona produzione di virus, e raccogliere il lentivirus raccogliendo il supernatante e trasfererlo in un tubo di centrifuga sterile.

Inizia selezionando la copertura della libreria di RNA della guida CRISPR da mantenere su tutto lo schermo. In base alla copertura della libreria, determinare il numero di cellule necessarie per mantenerlo per RNA guida e il numero di cellule necessarie per l'infezione a MOI 0.3. Successivamente, determinare il numero di piastre necessarie per impostare l'infezione e quindi raccogliere e seminare le cellule su ogni piastra.

Aggiungere il bromuro di esadimetrina a tutte le piastre e aggiungere il volume richiesto di virus per lo screening e il controllo di due piastre. Non aggiungere virus per controllarne uno. Sostituire il volume con un supporto.

Mescolare accuratamente le piastre inclinando e posizionare le piastre in un'incubatrice, assicurandosi che siano livellate. Raccogli cellule infette secondo le indicazioni manoscritte e raccogli tre repliche di pellet cellulari dalle cellule raggruppate per l'estrazione genomica del DNA. Centrifugare le cellule a 500 volte g per cinque minuti e lavarle con PBS.

Etichettare i tubi e congelare i pellet cellulari a meno 80 gradi Celsius. Dividere il pool di celle infette in tre gruppi di replica, assicurandosi di mantenere la copertura della libreria all'interno di ogni replica. Seminare le cellule a una densità che normalmente viene utilizzata durante l'espansione.

Utilizzare lo stesso numero di celle per ogni replica e lo stesso numero totale di celle tra repliche. Continuare a passare le cellule e raccogliere tre repliche di pellet cellulari da ogni replica di cellule infette raggruppate per un massimo di 15-20 raddoppi cellulari. Ad ogni passaggio, raccogliere le cellule da tutte le piastre in ciascuna replica tra loro.

Etichettare ogni pellet con il tempo e replicare la designazione. Impostare PCR1 secondo le indicazioni manoscritte con un totale di 100 microgrammi di DNA genomico a 3,5 microgrammi di DNA genomico per reazione di 50 microliter e impostare reazioni identiche a 50 microliter per ottenere la copertura desiderata. Impostare una reazione del tubo PCR in base alle indicazioni manoscritte.

Utilizzare cinque microlitri del prodotto PCR1 in pool come modello e utilizzare combinazioni univoche di primer di indice per ogni singolo campione per consentire il pooling degli esempi di libreria di sequenziamento. Dopo aver completato il PCR, eseguire il prodotto del tubo PCR su un gel di agarosio al 2% a bassa tensione per una o 1 ora e mezza. Visualizza il prodotto su un transilluminatore a luce blu e asporta la banda di coppia di 200 basi.

Purificare il DNA e misurarne la quantità e la qualità sia con uno spettrofotometro che con un fluorometro. Una libreria di RNA guida ideale dovrebbe avere ogni singolo RNA guida rappresentato a quantità simili. Il sequenziamento di nuova generazione può essere utilizzato per confermare che la libreria ha una stretta distribuzione di RNA guida.

L'analisi del richiamo di precisione può essere utilizzata per valutare le prestazioni dello schermo. Uno schermo ad alte prestazioni dovrebbe recuperare un gran numero di geni essenziali a un fattore di base maggiore di sei e un tasso di scoperta falso inferiore al 5%La curva di richiamo della precisione dovrebbe avere un gomito affilato e una linea retta fino al punto terminale. Il fattore Bayes rappresenta una misura di confidenza che il knockout genico si traduce in un difetto di forma fisica.

Punteggi elevati indicano una maggiore fiducia, mentre punteggi bassi suggeriscono che il knockout genico fornisce vantaggi di crescita. Le piscine knockout a livello genomico possono essere coltivate in presenza di agente farmaceutico in eccesso per cercare geni di resistenza al soppressore. Per eseguire una schermata di selezione positiva per il soppressore del blocco di timmidina, i conteggi di lettura normalizzati per tutti gli RNA guida a T0 vengono tracciati rispetto ai conteggi di lettura normalizzati mediamente per i campioni trattati con timmidina.

Un dettaglio chiave per eseguire con successo gli schermi CRISPR è mantenere una buona distribuzione di ogni RNA guida, a partire dalla trasfezione del plasmide alla trasduzione delle cellule. Ciò ridurrà al minimo la possibilità di effetti casuali che possono distorcere la rappresentazione dell'RNA guida e portare a risultati falsi positivi o negativi. Dopo una convalida dello schermo, gli esperimenti devono essere eseguiti per confermare i riscontri perché la schermata primaria identifica solo potenziali riscontri.

A seconda della biologia dei colpi, possono essere utilizzati vari metodi. L'editing CRISPR, combinato con il sequenziamento di nuova generazione, ha permesso la perdita su scala genomica degli schermi funzione in diversi sistemi di modelli umani. Grazie alla semplicità della CRISPR, questi tipi di schermi sono ora ampiamente accessibili a tutti i ricercatori, consentendo a più scienziati di utilizzare metodi genetici funzionali per studiare processi biologici e malattie.