Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido
17 luglio 2019
Qui sono presentati protocolli per saggi biochimici in vitro utilizzando etichette di biotina che possono essere ampiamente applicabili per studiare le interazioni proteina-nucleiche dell'acido.
Questo protocollo offre una piattaforma con etichetta biotina per lo studio delle interazioni proteina-acido nucleico che si rivela robusta, affidabile, efficiente e conveniente. Lo stesso lotto degli acidi nucleici etichettati con biotina può essere utilizzato per un lungo periodo di tempo, mantenendo la riproducibilità degli esperimenti. Infine, tutti i saggi con etichetta biotina descritti qui possono essere eseguiti entro un giorno e non richiedono attrezzature speciali.
A dimostrare la procedura sarà Lina Yu, una post-laurea del nostro laboratorio. Preparare i costrutti MEIOB e MOV10 e trasformarli nei batteri appropriati. Per estrarre MEIOB, pelletare le cellule tramite centrifugazione e rimostrarle in 20 millilitri di saline tamponate al fosfato di Dulbecco ghiacciate, o tamponamento DPBS.
Sonicare la sospensione batterica sul ghiaccio. Quindi, centrifuga il lisato a 12.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti e trasferisci il supernatante in un tubo fresco. Pre-lavare le perline di glutatione-sefarose e incubarle con il lisato a quattro gradi Celsius per due ore.
Centrifugare la miscela a 750 volte g e quattro gradi Celsius per un minuto per pelletare le perline. Risciacquare le perline con 10 millilitri di PBS ghiacciato otto volte. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di eluizione, incubare le perline a quattro gradi Celsius per 10 minuti ed eludere le perline tramite centrifugazione.
Ripetere l'eluizione sei volte e mettere insieme le sei frazioni. Trasferire le proteine eluite in un filtro centrifugo e concentrarsi per centrifugazione a 7.500 volte g per un volume finale da 100 a 200 microlitri. Per estrarre MOV10, esprimere la proteina nelle cellule HEK293T e pelletare le cellule secondo le indicazioni del manoscritto.
Rimescolare il pellet in tre millilitri di tampone di lisi cellulare con cocktail completo di inibitore della proteasi senza EDTA e incubare per 30 minuti sul ghiaccio. Quindi, centrifuga il lisato a quattro gradi Celsius. Preparare perline magnetiche anti-FLAG lavandole due volte con tampone K150.
Dopo il lavaggio, rimorsi le perline in un millilitro di tampone K150 ghiacciato e incubarle per due minuti a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata. Raccogliere le perline su un magnete e rimuovere il supernatante. Aggiungere le perline al lisato cellulare e incubare a quattro gradi Celsius per due ore.
Lavare le perline con tampone K150 secondo le indicazioni del manoscritto e rimpiorsi le perline in 300 microlitri di tampone di eluizione FLAG. Posizionare le perline su un magnete, raccogliere il supernatante con le proteine MOV10 e determinare la concentrazione proteica. Preparare gli oligonucleotidi dell'RNA diluendo ogni oligo a 20 micromolari e ricotturandoli per formare duplex RNA secondo le indicazioni del manoscritto.
Per il saggio di spostamento elettroforetico di mobilità MEIOB, o EMSA, mescolare i reagenti in base alle direzioni del manoscritto. Aggiungere acqua per un volume di reazione finale di 20 microlitri. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi aggiungere tampone di arresto 5x.
Per il saggio di attività dell'elicase MOV10, mescolare i reagenti secondo le indicazioni del manoscritto e aggiungere acqua per un volume di reazione finale di 20 microlitri. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti, 30 minuti e 60 minuti, quindi aggiungere un buffer di arresto 5x per interrompere la reazione. Quindi, preparare un gel di poliacrilammide nativo al 20% e caricare da 20 a 25 microlitri di ogni campione in ogni pozzo.
Eseguire il gel a 100 volt su un bagno di ghiaccio fino a quando il marcatore blu bromofenolo non è migrato verso il quarto inferiore del gel. L'acrilammide è dannosa e tossica. È importante gestirlo con adeguati dispositivi di protezione individuale.
Smontare le piastre di gel e tagliare il gel rimuovendo i pozzi di carico e le corsie inutilizzate. Posizionare il gel in un buffer TBE 0,5x. Tagliare la carta da filtro e la membrana di nylon alle dimensioni del gel, pre-bagnare la carta e la membrana e assemblare la pila per il trasferimento.
Trasferire i campioni dal gel alla membrana in un apparecchio elettroforetico semi-secco a 90 milliampere per 20 minuti. Quindi, incrociare i campioni irradiando la membrana a 120 millijoule per centimetro squadrato per 45-60 secondi. Per il rilevamento della chemiluminescenza, iniziare aggiungendo 20 millilitri di tampone di blocco alla membrana e incubandolo per 15-30 minuti mentre si trema delicatamente.
Rimuovere con cura il buffer di blocco e sostituirlo con un buffer coniugato/bloccante. Incubare nuovamente la membrana per 15 minuti. Lavare la membrana quattro volte mentre si trema per cinque minuti per lavaggio.
Quindi, aggiungere 30 millilitri di tampone di equilibrazione del substrato alla membrana e incubarlo per cinque minuti mentre si trema a 20-25 giri/min. Coprire l'intera superficie della membrana con la soluzione di lavoro del substrato e incubare per cinque minuti. Dopo l'incubazione, scansionare la membrana in un sistema di imaging chemiluminescente per uno o tre secondi.
La purificazione delle proteine MEIOB A, C ed E può essere verificata con colorazione blu Coomassie e analisi western blot. Le frecce rosse indicano le posizioni delle proteine MEIOB purificate. Le interazioni tra MEIOB e DNA a singolo filamento possono essere visualizzate utilizzando l'EMSA.
Si osservano legatura e scissione dipendenti dalla concentrazione. Come previsto, solo il MEIOB-A di tipo selvaggio interagisce con il DNA mentre i mutanti MEIOB-E e MEIOB-C no. Si possono anche osservare interazioni di MEIOB e RNA a singolo filamento.
Il MEIOB di tipo selvaggio mostra l'attività di legame e esonucleasi dipendente dalla concentrazione sull'RNA a singolo filamento. Tuttavia, il confronto quantitativo mostra che il MEIOB lega il DNA con un'efficienza superiore rispetto all'RNA. La purificazione del MOV10 è stata verificata con la colorazione blu coomassie e l'attività elicase della proteina è stata misurata su un duplex RNA con uno sbalzo a cinque primi.
Con l'aumentare del tempo di reazione, MOV10 srotola progressivamente l'RNA a doppio filamento. Per ridurre il costo del saggio, il rilevamento della chemiluminescenza può essere eseguito con una diluizione duplice dei reagenti del kit di rilevamento o con reagenti autoprodetti. Il protocollo qui descritto utilizzava con successo acidi nucleici etichettati con biotina come substrati per saggi biochimici in vitro come l'EMSA e per reazioni enzimatiche in cui la biotina non è stata comunemente utilizzata.
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Panoramica
Questo protocollo offre una piattaforma marcata con biotina per lo studio delle interazioni proteina-acido nucleico, che si rivela robusta, affidabile, efficiente ed economica. Lo stesso lotto di acidi nucleici marcati con biotina può essere utilizzato per un lungo periodo di tempo, mantenendo la riproducibilità degli esperimenti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia molecolare
- Biologia molecolare
- Interazioni proteina-acidi nucleici
Sfondo
- I marcatori biotinilici sono ampiamente utilizzati nei saggi biochimici.
- Le interazioni proteina-acido nucleico sono fondamentali per diversi processi biologici.
- Protocolli affidabili migliorano la riproducibilità negli esperimenti.
- Metodi efficienti consentono di risparmiare tempo e risorse nella ricerca.
Scopo dello studio
- Fornire protocolli per saggi biochimici in vitro.
- Facilitare lo studio delle interazioni proteina-acidi nucleici.
- Garantire l'usabilità a lungo termine degli acidi nucleici marcati con biotina.
Metodi Utilizzati
- Preparazione dei costrutti MEIOB e MOV10.
- Trasformazione in batteri appropriati.
- Centrifugazione per estrarre MEIOB.
- Risospensione in soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco (DPBS) fredda di ghiaccio.
Risultati principali
- I protocolli possono essere eseguiti nell'arco di un giorno.
- Non è richiesta attrezzatura speciale per i saggi.
- Riproducibilità mantenuta nel tempo con lo stesso lotto di acidi nucleici.
- Dimostrazione della procedura da parte di un ricercatore postdottorato.
Conclusioni
- I saggi con biotina marcata sono efficaci per lo studio delle interazioni proteina-acidi nucleici.
- I protocolli sono accessibili e pratici per i ricercatori.
- L'uso prolungato di acidi nucleici marcati con biotina migliora l'affidabilità sperimentale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Direttiva
I saggi con acidi nucleici marcati con biotina forniscono un'alternativa economica e riproducibile al marcaggio radioattivo per lo studio delle interazioni proteina-acidi nucleici nella fase iniziale della scoperta. Questo metodo supporta la validazione del bersaglio e la riduzione del rischio meccanicistico, consentendo una valutazione quantitativa del legame al DNA, dello svolgimento dell'RNA e dell'attività nucleasica senza l'impiego di attrezzature specializzate. Ciò aumenta la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti promettenti e nel triage preclinico, riducendo la dipendenza da isotopi pericolosi e mantenendo al contempo la coerenza del saggio tra diversi lotti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Conferma l'attività di legame al DNA di proteine come MEIOB mediante EMSA con etichettatura biotinilata, supportando l'analisi dell'ipotesi sui bersagli.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di enzimi che processano acidi nucleici, come l'elicasi MOV10 e l'esonucleasi MEIOB, utilizzando substrati biotinilati standardizzati.
- Valore scientifico: Facilita l'analisi comparativa dell'efficienza di legame tra substrati DNA e RNA per individuare priorità tra bersagli con rilevanza meccanicistica maggiore.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Fornisce una piattaforma robusta per la preparazione di acidi nucleici marcati con biotina validati, che mantengono la riproducibilità per periodi prolungati di conservazione.
- Valore operativo: Permette l'esecuzione del saggio entro un singolo giorno utilizzando apparecchiature di laboratorio standard, aumentando la produttività e riducendo la complessità di allestimento.
- Valore scientifico: Supporta la rivelazione chemiluminescente con diluizione flessibile dei reagenti, consentendo un screening economico senza compromettere il rilevamento del segnale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra letture funzionali dirette (legame, svolgimento, scissione) allineate agli esiti fenotipici nei percorsi di ricombinazione meiotica e di metabolismo dell'RNA.
- Valore operativo: Permette una continuità dal processo di purificazione della proteina ricombinante alla valutazione dell'attività, in un flusso di lavoro semplificato adatto alla validazione preclinica del bersaglio.
- Valore scientifico: Favorisce un avanzamento basato sulla valutazione del rischio confermando il meccanismo del bersaglio mediante una validazione biochimica ortogonale e indipendente dall'etichettatura.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La piattaforma saggio con etichetta biotinica si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto attivo, supportando la riduzione del rischio meccanicistica prima dello screening dei composti.
- Biologia della Scoperta: Permette la verifica di ipotesi sulle interazioni proteina-acido nucleico mediante saggi quantitativi di EMSA e di attività, chiarificando la funzione del bersaglio e il coinvolgimento nelle vie metaboliche.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili, adatti alla standardizzazione dei saggi e alla valutazione dell'effetto di composti nello screening secondario.
- Analisi: Genera dati dipendenti dal tempo e dalla concentrazione (legame, svolgimento, scissione) che consentono confronti statistici tra diverse condizioni e mutanti.
- Ricerca Translazionale: Collega l'attività enzimatica in vitro al significato biologico nel metabolismo degli acidi nucleici, favorendo la selezione di bersagli allineati a biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce un lotto di reagenti riutilizzabile e stabile a lungo termine, che riduce la variabilità e supporta la standardizzazione tra progetti in biologia della scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva sostituendo i marcatori radioattivi con etichette di biotina sicure e rilevabili, mantenendo al contempo la sensibilità del saggio.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e riduce la variabilità tra lotti grazie alla conservazione stabile a lungo termine di acidi nucleici marcati con biotina.
- Valore strategico: Riduce i costi operativi e il rischio per la sicurezza eliminando la necessità di manipolare 32P, schermature e smaltimento dei rifiuti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione del progetto mediante una riduzione del rischio del bersaglio affidabile e basata su meccanismi, prima dell'investimento nell'ottimizzazione del composto leader.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nell'espressione e purificazione di proteine ricombinanti da sistemi batterici e mammiferi.
- Si basa su apparecchiature standard per elettroforesi e trasferimento per EMSA e rilevamento chemiluminescente.
- Necessita di un'ottimizzazione delle condizioni di legame e di reazione (tempo, temperatura, concentrazione) per ogni coppia bersaglio-acido nucleico.
- Richiede una manipolazione accurata dei gel di acrilamide con idonei dispositivi di protezione individuale (DPI) a causa della tossicità.
- Presuppone l'accesso a sistemi di imaging chemiluminescente; metodi di rilevamento alternativi potrebbero richiedere validazione.
