Name: Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dellacido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri un protocollo biochimico con etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-acido nucleico in vitro. Questo metodo robusto ed economico garantisce riproducibilità a lungo termine senza attrezzature speciali.

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Ringraziamo P. Jeremy Wang (Università della Pennsylvania) per modifiche e discussioni utili. Ringraziamo anche Sigrid Eckardt per l'editing linguistico. È stato sostenuto dal Programma nazionale di Ricerca e Sviluppo della Cina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) e dalla National Natural Science Foundation of China (31771653). L. Y. è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) e dal Programma Innovativo e Imprenditoriale della Provincia di Jiangsu. J. N. è stato supportato dal progetto di scienza e tecnologia medica di zhejiang (2019KY499). M. L. è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31771588) e del 1000 Youth Talent Plan.

1. Preparazione delle proteine
<ol><li>Costrutti di espressione MEIOB e MOV10<ol><li>Generare costrutti di espressione cDNA codificando mouse MEIOB-A, C ed E (Figura 1A) e MOV10.<ol>
<li>Impostare le reazioni a catena di polimerasi (PCR) per ogni frammento. Mescolare 1 l di cDNA di topo (da C57BL/6 testi topo), 1 "L of dNTP", 2 -L di 10 - L di 10 M in avanti, 2 L di 10 M inverso, 1 l of DNA polymerase, 25 litri di 2x buffer PCR e 18 l di doppio distillato H2O (ddH2O) in un finale volume di 50 l. NOTA: I primer per l'amplificazione dei frammenti di geni Meiob e Mov10 sono elencati nella Tabella 1.
</li>
			<li>Eseguire reazioni PCR utilizzando i seguenti programmi: 95 s per 5 min, 35 cicli di riscaldamento a 95 gradi centigradi per 15 s, annealing a 64 s per 15 s, estensione a 72 s per 20 s (2 min per estendere la lunghezza completa MOV10), e l'estensione finale a 68 s per 7 min. NOTA: utilizzare la coppia di primer MEIOB-E (F1) e MEIOB-E-mut (R1) e MEIOB-E-mut (F2) e MEIOB-E (R2) per amplificare due segmenti che contengono la sequenza mutante all'interno di una sequenza sovrapposta alle estremità 3' e 5 ', rispettivamente, per generare un modello PCR mutante.</li>
		</ol></li>
		<li>Analizzare il DNA PCR amplificato mediante elettroforesi gel, tagliare rapidamente la banda delle dimensioni richieste dal gel sotto una lampada UV e posizionarla in un tubo centrifuga. NOTA: le dimensioni dei prodotti previste visibili sul gel agarose per MEIOB-A sono 536 bp, MEIOB-C è 296 bp, MEIOB-E 312 bp e 229 bp e MOV10 è 3015 bp.</li>
		<li>Purificare il DNA PCR con un kit di estrazione gel seguendo il protocollo del produttore.<ol>
<li>Aggiungere un volume uguale di tampone di dissoluzione nel tubo di centrifuga dal passo 1.1.2 e sciogliere il gel in un bagno d'acqua 50-55 gradi per 5-10 min, assicurando che i pezzi di gel si sciolgano completamente. Centrifuga brevemente per raccogliere eventuali goccioline dalla parete del tubo. NOTA: La concentrazione massa/volume del gel e del buffer di dissoluzione è di 1 mg/L.</li>
			<li>Posizionare la colonna di adsorbimento nel tubo di raccolta, trasferire la soluzione contenente il frammento di gel disciolto nella colonna adsorbiente e centrifugare a 12.000 x g per 2 min.</li>
			<li>Eliminare il filtrato nella parte inferiore dei tubi di raccolta. Aggiungere 600 l buffer di lavaggio alla colonna, centrifugare a 12.000 x g per 1 min, e scartare il filtrato.</li>
			<li>Ripetere il passaggio 1.1.3.3 una volta.</li>
			<li>Posizionare nuovamente la colonna nel tubo di raccolta e centrifugare a 12.000 x g per 2 min per rimuovere tutto il buffer di lavaggio rimanente.</li>
			<li>Posizionare la colonna di adsorbimento in un tubo di centrifuga sterilizzato da 1,5 mL, aggiungere 50 -L di ddH2O al centro della colonna di adsorbimento e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. Misurare la concentrazione di DNA dell'eluato utilizzando lo spettrometro.</li>
		</ol></li>
		<li>Restrizione di digestione di plasmidi<ol>
<li>Vettore pGEX-4T-1 digest con BamHI e NotI. A tale scopo, mescolare 4 g di vettore pGEX-4T-1, 5 luna di 10x buffer digest, 1 L di BamHI e 1 -L di NotI e ddH2O ad un volume di reazione finale di 50. Incubare a 37 gradi centigradi per 2 ore.</li>
			<li>Vettore di pRK5 digest con BamHI e XhoI mescolando 4 g di vettore pRK5, 5 l di 10 volte il buffer del digest, 1 l of BamHI e 1 L di XhoI e ddH2O a un volume di reazione finale di 50.L. Incubare a 37 gradi centigradi per 2 ore.</li>
		</ol></li>
		<li>Analizzare il DNA vettoriale mediante elettroforesi gel, tagliare rapidamente la fascia di dimensioni desiderata dal gel con un bisturi sotto una lampada UV e inserirlo in un tubo di centrifuga.</li>
		<li>Purificare il DNA vettoriale con un kit di estrazione gel come 1.1.3 seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: la lunghezza dei plasmidi linearizzati: pGEX-4T-1, 4,4 kb; pRK5, 4,7 kb.</li>
		<li>Impostare una reazione di legatura ricombinante standard combinando 0,03 pmol di vettore linearizzato, 0,06 pmol di frammento di cDNA, 2 -L di ligase e 4 - L di 5x buffer di ligase e ddH2O in un volume di reazione finale di 10 . NOTA: clonare MEIOB-A, C ed E in un vettore pGEX-4T-1 e MOV10 in un vettore pRK5.</li>
		<li>Incubare il composto a 37 gradi centigradi per 30 min, quindi raffreddare immediatamente la reazione per 5 min sul ghiaccio. Trasforma i plasmidi ricombinanti MEIOB in batteri BL21 e i plasmidi ricombinanti MOV10 in batteri DH5. NOTA: verificare tutti i costrutti ricombinanti mediante il sequenziamento di Sanger.</li>
		<li>Preparare gli stock di glicerolo di colture batteriche contenenti plasmidi ricombinanti verificati aggiungendo un volume uguale del 50% glicerolo alle colture liquide, e conservare a -80 gradi centigradi. NOTA: Per ogni esperimento successivo, sfilare i batteri dalle scorte di glicerolo su una piastra di agar fresco e utilizzare una singola colonia per l'espansione come descritto nel passaggio 1.2.</li>
	</ol></li>
	<li>Estratti di proteine MEIOB da batteri<ol>
<li>Scegli una colonia di ogni ceppo BL21 trasinfezione dal plasmid e il plasmide vuoto o ricombinante di pGEX-4T-1 verificato dal sequenziamento e inoculare in 3 mL lB contenente 100 ampicillina. Coltivare per una notte a 37 gradi centigradi con agitazione a 220 giri/min.</li>
		<li>Inoculare 300 mL LB contenente 100 g/mL di ampicillina da 3 mL di coltura notturna (dal punto 1.2.1). Coltivare le colture a tremare a 37 gradi centigradi per 2 h fino a quando OD600 raggiunge 0,5-1,0.</li>
		<li>Indurre l'espressione proteica aggiungendo isopropile beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,2 mM. Incubare le colture per ulteriori 3 h con agitazione a 180 giri/min e 18 gradi centigradi.</li>
		<li>Centrifugare la coltura batterica a 3.500 x g e 4 gradi centigradi per 20 min.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 20 mL di tampone salina tampone salina tampone tampone (DPBS) a cubetto del ghiaccio Dulbecco. Sonicare le sospensioni batteriche sul ghiaccio per 25 cicli in brevi raffiche 10 s (potenza di uscita 20%) seguito da 2-3 s appoggiato sul ghiaccio.</li>
		<li>Centrifugare il lisato a 12.000 x g e 4 gradi centigradi per 15 min. Trasferire tutto il supernatante in un tubo fresco.</li>
		<li>Perline pre-lavaggio.<ol>
<li>Aggiungere 300 ll di perline glutatione-sepharose in un tubo fresco da 15 mL e lavare le perline con 10 mL di tampone PBS ghiacciato.</li>
			<li>Centrifuga a 750 x g e 4 gradi centigradi per 1 min per pellet le perline e scartare la soluzione di lavaggio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aggiungere il lisato alle perline lavate e incubare a 4 gradi centigradi per 2 h. Centrifugare a 750 x g e 4 gradi C per 1 min a pellet le perline. Sciacquare le perline in 10 mL di PBS 8x ghiacciato.</li>
		<li>Elutare le perline con 1 mL del tampone di eluizione (10 mm glutathione in 50 mM Tris-HCl a pH 8.0) 6x, incubando a 4 mL per 10 minuti prima di ogni passo di eluizione. Centrifuga a 750 x g e 4 gradi centigradi per 1 min per pellet le perline. Raccogliere e mettere in comune le 6 frazioni.</li>
		<li>Trasferire le proteine eluite in un filtro centrifugo e concentrarsi per centrifugazione a 7.500 x g per ottenere un volume finale di 100-200 l.</li>
	</ol></li>
	<li>Estratti di proteine MOV10 da cellule HEK293T<ol>
<li>Esprimere temporaneamente le proteine MOV10 nelle cellule HEK293T coltivate.<ol>
<li>Preparare il plasmide MOV10-pRK5 ad una concentrazione >500 ng/L.</li>
			<li>Semi HEK293T cellule in piatti 15 cm. Quando la densità cellulare raggiunge il 70%-90%, sostituire il mezzo di coltura cellulare con il fresco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina-streptomiacina.</li>
			<li>Per una trasfezione, diluire 60 g di DNA plasmide MOV10-pRK5 in 3 mL del mezzo siero ridotto, quindi aggiungere 120 L del reagente dell'esaltatore di trasfezione e mescolare bene.</li>
			<li>In un tubo separato diluire 90 - L del reagente di trasfezione con 3 mL di ridotto mezzo di siero (senza penicillina-streptomica) e mescolare bene.</li>
			<li>Aggiungere il DNA diluito ad ogni tubo di reagente diluito della trasparenza. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
			<li>Aggiungere la miscela di trasfezione alla coltura cellulare e le celle di coltura per 36-48 h.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dopo 36-48 h, raccogliere le cellule da ogni piastra in un tubo da 50 mL. Centrifuga a 500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Lavare ogni pellet con 10 mL di PBS ghiacciato e raccogliere le cellule con centrifugazione a 500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 3 mL di buffer di lisi cellulare contenente cocktail completo di acido proteasi senza ehylenediaminetra (EDTA). Incubare per 30 min sul ghiaccio. Centrifugare il lisato a 20.000 x g e 4 gradi centigradi per 20 min.</li>
		<li>Aggiungere 100 lofan di perline magnetiche anti-FLAG per piatto di cellule in un tubo da 1,5 mL.</li>
		<li>Lavare le perline magnetiche 2x con buffer K150 (50 m HePES a pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0.1% NP-40).<ol>
<li>Risospendere le perline magnetiche in 1 mL di tampone K150 ghiacciato.</li>
			<li>Incubare le perline magnetiche per 2 min a 4 gradi centigradi con una leggera rotazione e pellet le perline magnetiche con l'aiuto di un magnete. Rimuovere e scartare il super-natante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aggiungere le perline magnetiche al supernnata di lisate cellulare dal passo 1.3.3 e incubare a 4 gradi centigradi per 2 h.</li>
		<li>Lavare la proteina legata perline magnetiche 3x con tampone K150, quindi 2x con K150 contenente 250 mM NaCl, quindi 3x con buffer K150 come 1.3.5.</li>
		<li>Risospendere le perline in 300 gradi l di tampone di eluizione FLAG (100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl a pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% glicerol), aggiungere il peptide FLAG ad una concentrazione finale di 0,5 g/l, e incubare con talloni su un rotatore a 4 gradi centigradi , quindi pellet le perline magnetiche con l'aiuto di un magnete.</li>
		<li>Raccogliere il supernatante che contiene le proteine MOV10 eluite, determinare la concentrazione e conservare a -80 gradi centigradi per un uso futuro.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione dell'acido nucleico
<ol><li>Acquistare OLIgonucleotidi di DNA e RNA (oligos) con o senza etichette di biotina da una fonte adatta. Diluire ogni oligo in ddH senza RNaseda 2a 20 M e mantenerlo a -80 gradi centigradi per un uso futuro. NOTA: Le sequenze di oligo dei substrati DNA/RNA utilizzate in questo studio sono elencate nella Tabella 2.</li>
	<li>Preparare la seguente miscela per la reazione di annealing dell'RNA a doppio filamento (dsRNA) per il test di attività dell'elipo MOV10: mescolare 60 mM N-2-hydroxyethylpiperazin-N-ethane-sulfonico acido (HEPES) a pH 7,5, 6 mM KCl, 0,2 mM MgCl2 e RNase-free ddH2 O in un volume di reazione finale di 20 l.</li>
	<li>Anneal RNA oligos to forma RNA duplex riscaldando una miscela del filamento superiore con etichettatura biotina (2 m, concentrazione finale) e una 5 volte del suo filamento inferiore complementare senza etichettatura nel buffer di annessione (passaggio 2.2) a 95 gradi centigradi per 5 min, e poi lentamente raffreddarlo in camera temperatura (RT).</li>
</ol>3. Saggi biochimici in vitro
<ol><li>Reazioni EMSA ed enzimatiche<ol>
<li>Per il saggio MEIOB EMSA, mix 50 mM Tris HCl al pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM dithiothreitol (DTT), 0.01% NP-40, 0.8 mM (o altre concentrazioni rilevanti come mostrato nella Figura 2 e Figura 3 ) proteina MEIOB e 10 nM oligonucleotidi etichettati biotina e ddH2O in un volume di reazione finale di 20 l. Incubare a RT per 30 min, e aggiungere 5x stop buffer (125 mM EDTA, 50% glicerolo) per fermare la reazione.</li>
		<li>Impostare le reazioni di attività di nucleato MEIOB come descritto al passaggio 3.1.1, ma senza l'aggiunta di 10 mEdTA.</li>
		<li>Per il test dell'attività della neo-eliata MOV10, mescolare 50 mM Tris-HCl a pH 7.5, 20 mM KoAc, 2 mM MgCl2, 0,01% NP-40, 1 mM DTT, 2 inibitore U/L RNase, 10 nM substrato di RNA con etichetta biotina, 2 mM di triposina di adenosina (ATP), 100 nM RNA trap, e 20 ng di proteine MOV10 e ddH >2O in un volume di reazione finale di 20 .L. Incubare la miscela di reazione a 37 gradi centigradi per 10 min, 30 min e 60 min. Aggiungere il buffer di stop 5x per fermare la reazione. NOTA: Trappola di RNA, un oligo senza etichetta biotina con sequenza, complementarità all'oligo etichettato, che impedisce al dsRNA non avvolto di annealing di nuovo.</li>
	</ol></li>
	<li>Gel di poliacrilammide<ol>
<li>Lavare le piastre di gel (16 cm x 16 cm) e i pettini da 1,5 mm. Assemblare le unità di elettroforesi gel.</li>
		<li>Per preparare un gel di poliacrilammide nativo al 10%, mescolare 14 mL di ddH2O, 1,25 mL di 10x Tris-boric acid-EDTA (TBE), 8,3 mL di 30% acrilammide, 1,25 mL del 50% glicerol, 187,5 : L del 10% di ammonio appena preparato persulfato (APS) e 12,5 l di tetrametileleleneamina (TEMED).</li>
		<li>Per preparare un gel di poliacrilammide nativo del 20%, mescolare 5,5 mL di ddH2O, 1,25 mL di 10x TBE, 1,25 mL del 50% di glicerolo, 16,7 mL del 30% di acrilammide, 187,5 di 10% APS e 12,5 l di TEMED.</li>
		<li>Versare immediatamente la soluzione di acrilammide al gel e inserire il pettine. Lasciare il composto polimerizzare per circa 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Gel in esecuzione<ol>
<li>Rimuovere il pettine, riempire i serbatoi con il tampone di funzionamento elettroforesi (0.5x TBE).</li>
		<li>Risciacquare i pozzetti con buffer TBE 0,5x, quindi pre-eseguire il gel a 100 V sul ghiaccio per 30 min. Sostituire il buffer in esecuzione con fresco 0.5x TBE.</li>
		<li>Caricare in ogni pozzo 20-25 campioni.</li>
		<li>Utilizzare un gel acrilamide nativo 10% per il saggio EMSA e un gel acrilammide nativo del 20% per i saggi ezimatici. Eseguire l'elettroforesi a 100 V sul bagno di ghiaccio fino a quando il marcatore blu bromofenolo è migrato al quarto inferiore del gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Smontare le piastre di gel, tagliare il gel rimuovendo i pozzi di carico e le corsie inutilizzate. Posizionare il gel nel buffer TBE 0,5x.</li>
	<li>Tagliare la carta da filtro e la membrana in nylon alle dimensioni del gel. Pre-bagnato la carta da filtro pulita e la membrana in nylon.</li>
	<li>Assemblare lo stack per il trasferimento.<ol>
<li>Posizionare la membrana pre-bagnata sulla carta da filtro pre-bagnato.</li>
		<li>Posizionare il gel sulla membrana.</li>
		<li>Coprire il gel con un altro strato di carta da filtro pre-bagnato.</li>
		<li>Rimuovere tutte le bolle d'aria rotolando una pipetta pulita dal centro al bordo.</li>
	</ol></li>
	<li>Trasferire i campioni dal gel alla membrana in un apparato elettroforetico semi-secco a 90 mA per 20 min.</li>
	<li>Interrompere il trasferimento, quindi asciugare la membrana su una nuova carta da filtro per 1 min.</li>
	<li>Collegare i campioni irradiando la membrana a 120 mJ/cm2 per 45-60 s in un paraspito UV-luce dotato di lampadine da 254 nm (funzione crosslink automatico). Asciugare ad aria la membrana a RT per 30 min.</li>
	<li>Rilevamento della chemiluminescenza<ol>
<li>Protocollo 1: Utilizzare un volume standard di kit di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente commerciale.<ol>
<li>Aggiungere 20 mL di buffer di blocco alla membrana e incubare per 15-30 min con agitazione delicata su un rotatore a 20-25 giri.</li>
			<li>Preparare la soluzione di tampone coniugato/bloccante aggiungendo un coniugato/blocco di tamponamento a 20 mL di buffer di blocco stabilizzato a 20 mL.</li>
			<li>Rimuovere delicatamente il buffer di blocco e sostituirlo con coniugato/buffer di blocco. Incubare per 15 min su un rotatore a 20-25 rpm.</li>
			<li>Lavare la membrana 4x con agitazione a 40-45 giri/m per 5 min ciascuno.</li>
			<li>Aggiungere 30 mL di cuscinetto di equilibratore del substrato alla membrana. Incubare la membrana per 5 min con agitazione a 20-25 rpm.</li>
			<li>Preparare la soluzione di lavoro del substrato aggiungendo 6 mL di soluzione luminol/enhancer a 6 mL di soluzione stabile perossido. Evitare la luce.</li>
			<li>Coprire l'intera superficie della membrana con la soluzione di lavoro del substrato e incubare per 5 min.</li>
			<li>Scansiona la membrana in un sistema di imaging chemiluminescente per 1-3 s.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Protocollo 2: Utilizzare 2 volte il kit di rilevazione dell'acido nucleico nucleico commerciale diluito 2x e seguire i passaggi 3.10.1.1-3.10.1.8.</li>
		<li>Protocollo 3: Utilizzare reagenti self-made6.<ol>
<li>Preparare il buffer di blocco: mix 0.1 M Tris-HCl a pH 7.5, 0.1 M NaCl, 2 mM MgCl2e 3% di album del siero bovino Fraction V. AP 7.5 buffer: mix 0.1 M Tris-HCl a pH 7.5, 0.1 M NaCl e 2 mM MgCl2. Buffer AP 9.5: mix 0,1 M Tris-HCl a pH 9,5, 0,1 M NaCl e 50 mM MgCl2. TE buffer: mix 10 mM Tris-HCl a pH 8.0, 1 mM EDTA a pH 8.0.</li>
			<li>Immergere la membrana nel buffer di blocco a 30 gradi centigradi per 1 h.</li>
			<li>Aggiungete 8,5 l di fosfofosate streptavidina alcalina a 10 mL di Buffer AP 7.5. Agitare delicatamente la membrana in questa soluzione a RT per 10 min. Quindi, lavare la membrana 2x in 15 mL di tampone AP 7.5 per 10 min.</li>
			<li>Lavare la membrana ancora una volta in 20 mL di buffer AP 9.5 per 10 min. Aggiungere 20 mL di buffer TE per arrestare la reazione.</li>
			<li>Aggiungere 7,5 mL di soluzione di sviluppo sulla membrana e scansionare la membrana in un sistema di imaging chemiluminescente per 1-3 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Luo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIOB+exhibits+single-stranded+DNA-binding+and+exonuclease+activities+and+is+essential+for+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination.</a> Nature Communications. 4, 2788(2013).</li>
<li>Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis-specific+proteins+MEIOB+and+SPATA22+cooperatively+associate+with+the+single-stranded+DNA-binding+replication+protein+A+complex+and+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks.</a> Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).</li>
</ol>

Non vengono dichiarati conflitti di interesse.

Lo studio delle interazioni tra proteine e acidi nucleici è fondamentale per la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di diversi processi biologici. Ad esempio, MEIOB è una proteina specifica per i testicoli essenziale per la meiosi e la fertilità nei mammiferi25,26,27. MEIOB contiene un dominio OB che si lega al DNA a filamento singolo e presenta da 3' a 5' attività esonuclease26, che s...

Le interazioni tra acido proteina-nucleico sono coinvolte in molti processi cellulari essenziali come la riparazione del DNA, la replicazione, la trascrizione, l'elaborazione dell'RNA e la traduzione. Le interazioni proteiche con sequenze specifiche di DNA all'interno della cromatina sono necessarie per uno stretto controllo dell'espressione genica a livello tracscrivionale1. Una precisa regolazione posttrapescrittiva di numerosi RNA codificanti e non codificanti richiede interazioni estese e complicate tra qualsiasi proteina e RNA2. Questi strati del meccanismo regolatore dell'espressione genica comprendono una cascata di eventi intermolecolari dinamici, coordinati da interazioni di trancilazione/fattori epigenetici o proteine che legano l'RNA con i loro bersagli di acido nucleico, nonché interazioni proteina-proteina. Per sezionare se le proteine in vivo sono direttamente o indirettamente associate agli acidi nucleici e come tali associazioni si verificano e culminano, vengono condotte analisi biochimiche in vitro per esaminare l'affinità legante o l'attività enzimatica delle proteine di interesse sussidi progettati di DNA e/o RNA.
Sono state sviluppate molte tecniche per rilevare e caratterizzare i complessi nucleo-acido-proteina, tra cui l'analisi elettroforetica della mobilità (EMSA), chiamata anche analisi del ritardo del gel o analisi dello spostamento della banda3,4,5 . L'EMSA è un metodo biochimico versatile e sensibile che è ampiamente utilizzato per studiare il legame diretto delle proteine con gli acidi nucleici. L'EMSA si basa sullo spostamento elettroforetico del gel nelle bande, che vengono regolarmente visualizzate utilizzando la chemiluminescenza per rilevare le etichette di biotina6,7, la fluorescenza delle etichette fluoroforiche8,9o autoradiografia delle etichette radioattive 32P10,11. Altri scopi degli studi biochimici sono l'identificazione e la caratterizzazione dell'attività di elaborazione dell'acido nucleico delle proteine, come le reazioni basate sulla nuclea per valutare i prodotti di scissione da substrati di acido nucleico12, 13 del sistema , 14 e analisi di rimozione della struttura del DNA/RNA per valutare le attività elicasise15,16,17.
In questi saggi di attività enzimatica, gli acidi nucleici etichettati al radioisotolo o al fluoroforo sono spesso utilizzati come substrati a causa della loro elevata sensibilità. L'analisi delle radiografie delle reazioni enzimatiche che coinvolgono radiotracciatori con etichetta 32P è risultata sensibile e riproducibile18. Tuttavia, in un numero crescente di laboratori nel mondo, l'uso di radioisotopi è limitato o addirittura vietato a causa dei rischi per la salute associati alla potenziale esposizione. Oltre ai problemi di biosicurezza, altri inconvenienti sono l'attrezzatura necessaria per condurre il lavoro con i radioisotopi, la licenza di radioattività richiesta, l'emivita breve di 32P (circa 14 giorni) e il graduale deterioramento della qualità della sonda a causa radiolisi. Pertanto, sono stati sviluppati metodi alternativi non isotopici (cioè, l'etichettatura della sonda con fluorofori consente il rilevamento mediante imaging fluorescente19). Tuttavia, quando si utilizzano sonde con etichetta fluorescente, è necessario un sistema di imaging ad alta risoluzione. La biotina, un'etichetta comunemente usata, si lega prontamente alle macromolecole biologiche come proteine e acidi nucleici. Il sistema Biotin-streptavidin funziona in modo efficiente e migliora la sensibilità di rilevamento senza aumentare lo sfondo non specifico20,21. Oltre all'EMSA, la biotina è ampiamente utilizzata per la purificazione delle proteine e l'RNA pull-down, tra gli altri22,23,24.
Questo protocollo utilizza con successo gli acidi nucleici etichettati con biotina come substrati per analisi biochimiche in vitro che includono EMSA, oltre a reazioni enzimatiche in cui la biotina non è stata comunemente utilizzata. Il dominio MEIOB OB è costruito e due mutanti (troncamento e mutazione puntiforme) sono espressi come proteine di fusione GST25,26,27, così come il topo MOV10 ricombinante proteina di fusione FLAG16. La relazione mette in evidenza l'efficacia di questo protocollo combinato per la purificazione delle proteine e i saggi etichettati con biotina per vari scopi sperimentali.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Germania</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging chemiluminescente</td><td>Tanon, Cina</td><td>5200</td><td></td></tr><tr><td>Digital sonifer</td><td>Branson, USA</td><td>BBV12081048A</td><td>450 Watt; 50/60 HZ</td></tr><tr><td>Assorbente elettroforetico semi-secco</td><td>Hoefer, USA</td><td>TE77XP</td><td></td></tr><tr><td>Revolver a tubo&nbsp;</td><td>Crystal, USA</td><td>3406051</td><td></td></tr><tr><td>reticolante a luce UVP</td><td>UVP, USA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro centrifugo Amicon Ultra-4&nbsp;</td><td>Milipore, USA</td><td>UFC801096</td> Membrana in nylon <td>da 4 ml/10 K</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>TG263940A</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura trattata</td><td>con TC Corning, USA</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Piatto di coltura trattato TC</td><td>Corning, USA</td><td>430597</td><td>150 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Microprovette</td><td>AXYGEN, USA</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Provette</td><td>Corning, USA</td><td>430791</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Reagenti&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>SunShine Bio, Cina</td><td>8h288h28</td><td></td></tr><tr><td>Perle magnetiche M2 anti-FLAG</td><td>Sigma, USA</td><td>M8823</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>591136</td> Kit di sviluppo del colore della fosfatasi alcalina BCIP <td></td></tr><tr><td>/ NBT</td><td>Beyotime, Cina</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>CelLyticTM M Lisi cellulare Reagente&nbsp;</td><td>Sigma, USA</td><td>107M4071V</td><td></td></tr><tr><td>Kit di clonazione in un solo passaggio ClonExpress II&nbsp;</td><td>Vazyme, Cina</td> Kit di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente <td>C112</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>T1269950</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, USA</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>tampone DPBS</td><td>Gibco, USA</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9260G</td><td>0,5 M</td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche, USA</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di plasmidi maxi EndoFree&nbsp;</td><td>Vazyme, Cina</td><td> DC202</td><td></td></tr><tr><td>FastPure Gel DNA Estrazione Mini Kit</td><td>Vazyme, Cina</td><td>DC301-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, USA</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FLAG peptide</td><td>Sigma, USA</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma, USA</td><td>SHBK3676</td><td></td></tr><tr><td>GST Bulk Kit</td><td>GE Healthcare, USA</td><td>27-4570-01</td><td></td></tr><tr><td>Tampone HEPES</td><td>Sigma, Stati Uniti</td><td>SLBZ2837</td><td>1 M&nbsp;</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>KoAc</td><td>Sangon Biotech, Cina</td><td>127-08-02</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 Reagente di trasfezione</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9530G</td><td>1 M</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td>5 M&nbsp;</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, USA</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco, USA</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, USA</td><td>10010023</td><td>PH 7.4</td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Promega, USA</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina fosfatasi alcalina</td><td>Promega, USA</td><td>V5591</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>Tampone Tris-HCI&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15567027</td><td>1 M, tampone PH 7.4</td></tr><tr><td>Tris-HCI&nbsp;</td><td>Invitrogen, Stati Uniti</td><td>15568025</td><td>1 M, PH 8.0</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, Cina</td><td>A600560</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi biochimiche in vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Le interazioni tra acido proteina-nucleico svolgono un ruolo importante nei processi biologici come la trascrizione, la ricombinazione e il metabolismo dell'RNA. I metodi sperimentali per studiare le interazioni tra proteine-nucleici con acido richiedono l'uso di tag fluorescenti, isotopi radioattivi o altre etichette per rilevare e analizzare molecole bersaglio specifiche. La biotina, un'etichetta di acido nucleico non radioattivo, è comunemente usata nei saggi di mobilità elettroforici (EMSA), ma non è stata regolarmente impiegata per monitorare l'attività delle proteine durante i processi dell'acido nucleico. Questo protocollo illustra l'utilità dell'etichettatura della biotina durante le reazioni enzimatiche in vitro, dimostrando che questa etichetta funziona bene con una serie di diversi saggi biochimici. In particolare, in linea con i precedenti risultati ottenuti utilizzando substrati con etichetta a radioisotopi 32P, è confermato tramite EMSA con etichetta biotina che IL MEIOB (una proteina specificamente coinvolta nella ricombinazione meiotica) è una proteina legante al DNA, che MOV10 (un RNA helicase) risolve le strutture in base al polpa di RNA etichettate con biotina, e quel MEIOB fende il DNA a filamento singolo etichettato con biotina. Questo studio dimostra che la biotina è in grado di sostituendo 32P in vari saggi biochimici correlati all'acido nucleico in vitro.

La struttura proteica di MEIOB e i costrutti di espressione utilizzati in questo studio sono illustrati nella Figura 1A. Le pieghe OB in MEIOB sono strutture compatte simili a botte in grado di riconoscere e interagire con gli acidi nucleici a filamento singolo. Uno dei domini OB (aa 136-307, costrutto A) lega il DNA a singolo filamento (ssDNA), la proteina troncata (troncamento aa 136-178, costrutto C) e la forma mutante a punti (R235A, costrutto E) di MEIOB non hanno attiv...

Qui sono presentati protocolli per saggi biochimici in vitro utilizzando etichette di biotina che possono essere ampiamente applicabili per studiare le interazioni proteina-nucleiche dell'acido.

Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

Questo protocollo offre una piattaforma con etichetta biotina per lo studio delle interazioni proteina-acido nucleico che si rivela robusta, affidabile, efficiente e conveniente. Lo stesso lotto degli acidi nucleici etichettati con biotina può essere utilizzato per un lungo periodo di tempo, mantenendo la riproducibilità degli esperimenti. Infine, tutti i saggi con etichetta biotina descritti qui possono essere eseguiti entro un giorno e non richiedono attrezzature speciali.A dimostrare la procedura sarà Lina Yu, una post-laurea del nostro laboratorio. Preparare i costrutti MEIOB e MOV10 e trasformarli nei batteri appropriati. Per estrarre MEIOB, pelletare le cellule tramite centrifugazione e rimostrarle in 20 millilitri di saline tamponate al fosfato di Dulbecco ghiacciate, o tamponamento DPBS.Sonicare la sospensione batterica sul ghiaccio. Quindi, centrifuga il lisato a 12.000 volte g e quattro gradi Celsius per 15 minuti e trasferisci il supernatante in un tubo fresco. Pre-lavare le perline di glutatione-sefarose e incubarle con il lisato a quattro gradi Celsius per due ore.Centrifugare la miscela a 750 volte g e quattro gradi Celsius per un minuto per pelletare le perline. Risciacquare le perline con 10 millilitri di PBS ghiacciato otto volte. Quindi, aggiungere un millilitro di tampone di eluizione, incubare le perline a quattro gradi Celsius per 10 minuti ed eludere le perline tramite centrifugazione.Ripetere l'eluizione sei volte e mettere insieme le sei frazioni. Trasferire le proteine eluite in un filtro centrifugo e concentrarsi per centrifugazione a 7.500 volte g per un volume finale da 100 a 200 microlitri. Per estrarre MOV10, esprimere la proteina nelle cellule HEK293T e pelletare le cellule secondo le indicazioni del manoscritto.Rimescolare il pellet in tre millilitri di tampone di lisi cellulare con cocktail completo di inibitore della proteasi senza EDTA e incubare per 30 minuti sul ghiaccio. Quindi, centrifuga il lisato a quattro gradi Celsius. Preparare perline magnetiche anti-FLAG lavandole due volte con tampone K150.Dopo il lavaggio, rimorsi le perline in un millilitro di tampone K150 ghiacciato e incubarle per due minuti a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata. Raccogliere le perline su un magnete e rimuovere il supernatante. Aggiungere le perline al lisato cellulare e incubare a quattro gradi Celsius per due ore.Lavare le perline con tampone K150 secondo le indicazioni del manoscritto e rimpiorsi le perline in 300 microlitri di tampone di eluizione FLAG. Posizionare le perline su un magnete, raccogliere il supernatante con le proteine MOV10 e determinare la concentrazione proteica. Preparare gli oligonucleotidi dell'RNA diluendo ogni oligo a 20 micromolari e ricotturandoli per formare duplex RNA secondo le indicazioni del manoscritto.Per il saggio di spostamento elettroforetico di mobilità MEIOB, o EMSA, mescolare i reagenti in base alle direzioni del manoscritto. Aggiungere acqua per un volume di reazione finale di 20 microlitri. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi aggiungere tampone di arresto 5x.Per il saggio di attività dell'elicase MOV10, mescolare i reagenti secondo le indicazioni del manoscritto e aggiungere acqua per un volume di reazione finale di 20 microlitri. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti, 30 minuti e 60 minuti, quindi aggiungere un buffer di arresto 5x per interrompere la reazione. Quindi, preparare un gel di poliacrilammide nativo al 20% e caricare da 20 a 25 microlitri di ogni campione in ogni pozzo.Eseguire il gel a 100 volt su un bagno di ghiaccio fino a quando il marcatore blu bromofenolo non è migrato verso il quarto inferiore del gel. L'acrilammide è dannosa e tossica. È importante gestirlo con adeguati dispositivi di protezione individuale.Smontare le piastre di gel e tagliare il gel rimuovendo i pozzi di carico e le corsie inutilizzate. Posizionare il gel in un buffer TBE 0,5x. Tagliare la carta da filtro e la membrana di nylon alle dimensioni del gel, pre-bagnare la carta e la membrana e assemblare la pila per il trasferimento.Trasferire i campioni dal gel alla membrana in un apparecchio elettroforetico semi-secco a 90 milliampere per 20 minuti. Quindi, incrociare i campioni irradiando la membrana a 120 millijoule per centimetro squadrato per 45-60 secondi. Per il rilevamento della chemiluminescenza, iniziare aggiungendo 20 millilitri di tampone di blocco alla membrana e incubandolo per 15-30 minuti mentre si trema delicatamente.Rimuovere con cura il buffer di blocco e sostituirlo con un buffer coniugato/bloccante. Incubare nuovamente la membrana per 15 minuti. Lavare la membrana quattro volte mentre si trema per cinque minuti per lavaggio.Quindi, aggiungere 30 millilitri di tampone di equilibrazione del substrato alla membrana e incubarlo per cinque minuti mentre si trema a 20-25 giri/min. Coprire l'intera superficie della membrana con la soluzione di lavoro del substrato e incubare per cinque minuti. Dopo l'incubazione, scansionare la membrana in un sistema di imaging chemiluminescente per uno o tre secondi.La purificazione delle proteine MEIOB A, C ed E può essere verificata con colorazione blu Coomassie e analisi western blot. Le frecce rosse indicano le posizioni delle proteine MEIOB purificate. Le interazioni tra MEIOB e DNA a singolo filamento possono essere visualizzate utilizzando l'EMSA.Si osservano legatura e scissione dipendenti dalla concentrazione. Come previsto, solo il MEIOB-A di tipo selvaggio interagisce con il DNA mentre i mutanti MEIOB-E e MEIOB-C no. Si possono anche osservare interazioni di MEIOB e RNA a singolo filamento.Il MEIOB di tipo selvaggio mostra l'attività di legame e esonucleasi dipendente dalla concentrazione sull'RNA a singolo filamento. Tuttavia, il confronto quantitativo mostra che il MEIOB lega il DNA con un'efficienza superiore rispetto all'RNA. La purificazione del MOV10 è stata verificata con la colorazione blu coomassie e l'attività elicase della proteina è stata misurata su un duplex RNA con uno sbalzo a cinque primi.Con l'aumentare del tempo di reazione, MOV10 srotola progressivamente l'RNA a doppio filamento. Per ridurre il costo del saggio, il rilevamento della chemiluminescenza può essere eseguito con una diluizione duplice dei reagenti del kit di rilevamento o con reagenti autoprodetti. Il protocollo qui descritto utilizzava con successo acidi nucleici etichettati con biotina come substrati per saggi biochimici in vitro come l'EMSA e per reazioni enzimatiche in cui la biotina non è stata comunemente utilizzata.

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Test interazione proteina-proteina è indispensabile per la dissezione di funzionalità delle proteine. Qui, introdurre...

Proteine ​​di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine ​​solubili e insolubili In vitro</em

Questo video mostra una tecnica che utilizza peptidi biotinilati che penetrano nelle cellule per rilevare le interazioni intracellulari proteina-proteina. I peptidi che penetrano nelle cellule facilitano l'ingresso del peptide coniugato in una cellula e si legano specificamente alle sue proteine interagenti. La biotina, dopo essersi legata all'avidina, permette la purificazione del complesso proteico interagente da un lisato cellulare.

Sonda peptidica biotinilata a penetrazione cellulare per rilevare le interazioni proteina-proteina

In questo video, dimostriamo la procedura per determinare l'attività dell'elicasi di una proteina bersaglio per svolgere il substrato di dsRNA marcato con biotina. L'attività dell'enzima è stata identificata analizzando lo spostamento della mobilità elettroforetica, seguito da un saggio di chemiluminescenza utilizzando streptavidina coniugata con enzimi chemiluminescenti.

Misurazione dell'attività dell'elicasi di una proteina bersaglio utilizzando duplex di RNA marcati con biotina

Abbiamo sviluppato un DNA-binding, dosaggio quantitativo basato su ELISA per misurare le interazioni tra fattori di trascrizione con il DNA. Alta specificità per la proteina RUNX2 è stato raggiunto con un consenso DNA riconoscimento oligonucleotide e anticorpo monoclonale specifico. Rilevamento colorimetrico con una reazione substrato anticorpo enzimatico accoppiato stata monitorata in tempo reale.

Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell&#39;espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali

I protocolli che seguono descrivono saggi cinetici di interazioni proteina-proteina con Bio-strato Interferometria. F-tipo ATP sintasi, che è coinvolto nel metabolismo energetico cellulare, può essere inibita dalla sua subunità ε nei batteri. Abbiamo adattato Bio-strato interferometria per studiare le interazioni del complesso catalitico con il dominio C-terminale inibitorio di ε.

Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura

Due metodi basati sulla biotinilazione, progettati per determinare l'espressione della superficie cellulare e la percentuale endocitica di proteine ​​espressi alla membrana plasmatica, sono presentati in questa relazione.

Determinazione dell&#39;espressione della superficie cellulare e della velocità endocitica delle proteine ​​nelle colture primarie di astrociti usando la biotinilazione

Si tratta di un protocollo per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare basate sul sistema avidina-biotina menu a tendina con la novità di combinare sequenze cellula-penetrante. Il vantaggio principale è che la sequenza di destinazione viene incubata con le cellule viventi invece di lisati cellulari e pertanto si verificherà le interazioni all'interno del contesto cellulare.

Biotinylated Cell-penetrating peptidi per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare

Qui, presentiamo un metodo in vitro ottimizzato per scoprire, quantificare e convalidare gli interattori proteici di specifiche sequenze di RNA, utilizzando estratto proteico totale da cellule umane, perle di streptavidina rivestite con RNA biotinilato e analisi di spettrometria di massa.

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Questo articolo descrive un protocollo per lo studio delle interazioni DNA-proteina utilizzando un sistema di interferometria a biostrato (BLI) basato su streptavidina. Delinea i passaggi e le considerazioni essenziali per l'utilizzo della cinetica di legame di base o avanzata per determinare l'affinità di legame all'equilibrio (KD) dell'interazione.

Analisi delle interazioni DNA-proteina con l'interferometria a biostrato basata su streptavidina

Il protocollo presenta un metodo per l'attaccamento covalente in vivo della biotina alle proteine in base alla loro vicinanza a una biotina ligasi fusa a una proteina di interesse. Questa modifica consente un arricchimento selettivo delle proteine utilizzando perle di streptavidina come necessario negli studi di interazione proteica.

In vivo Biotinilazione di prossimità per studi di interazione proteica in Paramecium tetraurelia

Scopri un protocollo biochimico con etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-acido nucleico in vitro. Questo metodo robusto ed economico garantisce riproducibilità a lungo termine senza attrezzature speciali.

Analisi biochimiche in Vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-nucleica dell'acido

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