Name: A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Impara a preparare colture di fette libere da tessuto cerebrale umano adulto per studiare neurodegenerazione. Questo metodo semplificato consente saggi biochimici e immunistochimici su campioni chirurgici.

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Questo lavoro è supportato da FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Post-Doctoral fellowship PNPD/INCT-HSM to A.F. and Pre-Doctoral fellowship to N.D.M.) e FAEPA. G.M.A. ha conseguito una borsa di studio faPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. ha conseguito una borsa di studio CNPq Research. Ringraziamo i pazienti e le loro famiglie per aver donato i tessuti resezionati per questo studio. Vorremmo riconoscere il supporto dei residenti, delle infermiere, dei tecnici e del team CIREP, dell'Ospedale Clinico della Scuola Medica Ribeiro Preto, dell'Università di San Paolo, che ha contribuito in varie fasi del processo.

Tessuti cerebrali adulti vivi sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a neurochirurgia resective per il trattamento dell'epilessia del lobo temporale farmacoresistente (Figura 1A). Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale Clinico della Scuola Medica Ribeiro Preto (17578/2015) e i pazienti (o la loro persona responsabile legale) hanno concordato e firmato i termini di consenso informato. La raccolta del tessuto è stata effettuata dal team di neurochirurgia presso il Centro di Chirurgia dell'Epilessia (CIREP - Clinica Ospedale presso la Ribeiro Preto Medical School, Università di San Paolo, Brasile).
1. Sterilizzazione dei materiali
NOTA: tutti i materiali e le soluzioni devono essere sterilizzati prima dell'uso.
<ol><li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e il materiale di affettatura vibratoma (portacoltelli, disco campione, vassoio tampone) in un forno sterilizzante secco per 4 h a 180 gradi centigradi.</li>
	<li>Sterilizzare materiale o apparecchiature sensibili alla temperatura mediante irradiazione UV o gamma.</li>
	<li>Sterilizzare i supporti e le soluzioni per autoclavazione o filtrazione attraverso membrane di pori 0,22 m.</li>
</ol>2. Preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparare 15-20 mL di soluzione di trasporto: 50% v/v Hanks' balanceed salt solution (HBSS) pH 7.4, 50% v/v basal basal medium for maintenance of post-natal and adult brain neurons (Table of Materials), integrato con 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1- acido piperazinethanesulfonico (Epes), 3 glucosio mg/mL e 33 gentamicina. NOTA: la soluzione di trasporto deve essere refrigerata e ossigenata (bollente con gas carbogeno) per almeno 20 minuti prima della raccolta del campione.</li>
	<li>Preparare 300 mL di soluzione di taglio (HBSS integrata con 10 m HEPES e 3 mg/mL di glucosio) e raffreddarlo in un congelatore fino al punto di formazione iniziale del cristallo.</li>
	<li>Preparare 20 mL di mezzo di coltura medio: mezzo basale per la manutenzione dei neuroni cerebrali post-natale e adulti (Tabella dei materiali) integrato con 1% L-glutamine derivata ( Tabella deimateriali), supplemento del 2% per la coltura neurale (Tabella di Materiali, 1% penicillina/streptomicina, e 0,25 g/mL amphotericinB.</li>
</ol>3. Impostazione dell'apparato di affettatura
NOTA: Questo protocollo viene eseguito idealmente con l'assistenza di un collega grazie alla logistica della raccolta dei campioni in sala chirurgica.
<ol><li>In un secchio di ghiaccio aggiunto, lasciate riposare la soluzione di affettatura sotto la spumeggiante della miscela di carbogeni (95% O2, 5% CO2) per almeno 20 minuti prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare un blocco di 3% agarose (circa 2 cm x 2 cm x 2 cm) e superincollarlo sul disco del provino vibratoma per creare ulteriore supporto meccanico al campione di tessuto durante la sezionamento (Figura 1E).</li>
	<li>Impostare il vibratome per il taglio: spessore della sezione di 200 m, frequenza di vibrazione di 100 Hz e velocità di taglio compresa tra 0,5 e 1,0 mm/s.</li>
	<li>Bloccare il vassoio del vibratome tampone alla base del vibratoma e aggiungere ghiaccio per conservarlo in frigorifero prima di ricevere la soluzione di affettatura e il campione e per tutta la procedura di taglio.</li>
</ol>4. Raccolta di campioni
NOTA: In questo protocollo, il tessuto neocorticale umano è stato raccolto in sala chirurgica e trasportato in laboratorio.
AVVISO: quando si tratta di campioni umani, seguire i protocolli di sicurezza appropriati stabiliti dall'Istituzione.
<ol><li>Impostare l'apparato di trasporto (Figura 1C) che consiste di: una bombola di gas portatile con miscela di carbogen collegata a una valvola di pressione/flusso che controlla l'uscita di gas collegata a un tubo di silicio che collega l'uscita di gas al trasporto nave; una nave da trasporto, di solito un tubo di centrifuga conicala da 50 mL con coperchio perforato per l'ingresso di gas, contenente la soluzione di trasporto; ghiaccio per il raffreddamento del campione durante il trasporto.</li>
	<li>Raccogliere e trasportare immediatamente il campione (Figura 1B) al laboratorio. Sommerse il campione in soluzione di trasporto a freddo (costantemente bollato con miscela di carbonte).</li>
</ol>5. Affettare
<ol><li>Trasferire il campione in un piatto Petri (100 mm x 20 mm) contenente soluzione di affettatura e, con strumenti chirurgici fini, rimuovere con cura il più possibile le meningi rimanenti nel campione (Figura 1D).</li>
	<li>Scegliere l'orientamento migliore per la produzione di fette con le particolari caratteristiche del progetto sperimentale, e con una lama di bisturi n. 24, tagliare una superficie piatta per essere la base incollata al disco del campione.</li>
	<li>Utilizzando un cucchiaio di plastica usa e getta e delicati pennelli, raccogliere il frammento dalla parabola Petri e asciugare la soluzione in eccesso utilizzando carta da filtro (asciugare per capillarità ed evitare di toccare il frammento di tessuto con la carta).</li>
	<li>Utilizzando la supercolla, collegare il tessuto al disco del provino vibratoma fino a quando non è saldamente aderente al disco e a contatto con il blocco di agarose (Figura 1E).</li>
	<li>Posizionare il disco del provino vibratoma (con tessuto correttamente collegato) nel vassoio del tampone del vibratome riempito con soluzione di affettatura che deve essere gorgogliante durante l'intero processo.</li>
	<li>Bloccare il supporto del coltello in posizione con la lama del rasoio saldamente fissata.</li>
	<li>La soluzione di affettatura deve coprire sia il campione che la lama, solo allora iniziare a affettare (Figura 1F).</li>
	<li>Tagliare l'esemplare a fette di 200 m. NOTA: Anche se alcuni vibratomi tagliano automaticamente i campioni, l'osservazione ravvicinata e le piccole regolazioni della velocità di taglio durante il processo possono aiutare a produrre fette migliori. Eliminare le fetta irregolari iniziali.</li>
	<li>Trasferire le fette dal vassoio tampone a una piastra Petri con soluzione di affettatura e tagliare i bordi sciolti e il mater bianco in eccesso ad una proporzione di circa il 70% di corteccia/30% materia bianca.</li>
</ol>6. Cultura
NOTA: eseguire questo passaggio in un armadio a flusso laminare in ambiente sterile.
<ol><li>Aggiungere 600 l di mezzo di coltura per pozzo (in un pozzo 24) e incubare per almeno 20 minuti a 36 e 5% di CO2 prima di placcare le fette.</li>
	<li>Piattare una fetta per bene utilizzando un pennello (Figura 1G).</li>
	<li>Se ci sono pozzi inutilizzati nel piatto, riempirli con 400 gradi di acqua sterile.</li>
	<li>Incubare la piastra a 36 gradi centigradi, 5% CO2. NOTA: La prima sostituzione media deve essere eseguita tra 8-16 h dopo la placcatura a seconda delle dimensioni della fetta.</li>
	<li>Supplemento 10 mL del mezzo di coltura precedentemente preparato con 50 ng/mL cervello derivato fattore neurotrofico (BDNF). NOTA: Durante le prime 8-16 h, le fette vengono incubate a 600 gradi di mezzo per evitare la privazione e l'acidificazione dei nutrienti, poiché il consumo medio in questa fase è accelerato. Dalla fase successiva, il volume del mezzo per pozzo viene regolato a 400 gradi l.</li>
	<li>Togliere 333 l' del mezzo condizionato da ogni pozzo e aggiungere 133 lofde di mezzo fresco integrato BDNF.</li>
	<li>Ripetere il processo di sostituzione media ogni 24 h sostituendo un terzo del mezzo condizionato con un mezzo fresco integrato BDNF.</li>
</ol>7. Valutazione della salute, della morfologia e della funzione nelle sezioni coltivate
NOTA: Per indurre la morte cellulare ai fini dell'illustrazione nei risultati rappresentativi, alcune fette sono state sottoposte a un trattamento di 24 ore con l'induttore di stress ossidativo H2O2. I passaggi 7.1.2 e 7.1.3 descrivono l'uso di H2O2 per indurre la morte cellulare.
<ol><li>Vitalità cellulare NOTA: Un metodo semplice e diretto per valutare il neurotossico/neuroprotezione nelle colture di fette sfidate è il test 3-(4,5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) , che misura la percentuale di cellule metaboliche attive in condizioni normali rispetto ai campioni trattati.<ol>
<li>Nell'armadio di flusso laminare, sostituire un terzo del mezzo con un mezzo fresco.</li>
		<li>Da una soluzione di magazzino 30% H2O2, aggiungere un volume di H2O2 per pozzo per raggiungere la concentrazione finale prevista (30 mM o 300 mM). NOTA: H2O2 è stato aggiunto dopo il cambio quotidiano del mezzo per garantire il corretto apporto di nutrienti freschi prima della sfida.</li>
		<li>Incubare la piastra per 24 h a 36 gradi centigradi, 5% CO2. NOTA: Dopo il trattamento H2O2 (o altri stimoli tossici di interesse), i seguenti passi descrivono la determinazione della vitalità cellulare da parte del saggio MTT.</li>
		<li>Aggiungere 40 l di soluzione MTT ad una concentrazione finale di 0,5 mg/mL in ogni pozzo nella piastra.</li>
		<li>Incubare la piastra a 36 gradi centigradi, 5% CO2 per 3 h.</li>
		<li>Lavare le fette con la salina (PBS) con buffer fosfato e trasferirle in un microtubo.</li>
		<li>Rimuovere con cautela qualsiasi soluzione rimanente pipettando.</li>
		<li>Pesare i microtubi contenenti le fette per determinare la massa di ogni fetta (questa è la chiave per normalizzare le letture di assorbimento ottenute). NOTA: se necessario, i campioni possono essere congelati (-20 gradi centigradi) in questa fase per un'elaborazione successiva.</li>
		<li>Omogeneizzare le fette in 200 gradi l di isopropanol/HCl utilizzando un pestello motorizzato.</li>
		<li>Centrifuga a temperatura ambiente (RT) per 2 min a 2600 x g.</li>
		<li>Raccogliere il supernatante e misurare l'assorbimento a 540 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Depolarizzazione neuronale indotta da KCl NOTA: Il fosforolalazione della proteina mitogena attivata chinasi (MAPK) segnalando la proteina a cascata ERK, seguita da gonfiore occidentale, può essere utilizzata per la quantificazione della risposta neuronale alla depolarizzazione indotta da KCl37 .<ol>
<li>Nell'armadietto di flusso, sostituire il mezzo di coltura di 300 gradi l di HBSS precedentemente equilitale a 36 gradi centigradi.</li>
		<li>Sostituire l'HBSS con 300 l di HBSS fresco precedentemente equilibrato a 36 gradi centigradi.</li>
		<li>Incubare la piastra a 36 gradi centigradi, 5% CO2 per 15 min.</li>
		<li>Sostituire l'HBSS con l'HBSS fresco o con 80 mM KCl soluzione depolarizzazione (entrambi a 36 gradi centigradi) e incubare a 36 gradi centigradi, 5% CO2 per 15 min.</li>
		<li>Trasferire le fette dalla piastra ai microtubi. In questa fase, le sezioni possono essere conservate a -20 gradi centigradi per un'elaborazione successiva.</li>
		<li>Preparare estratti di tessuto in un buffer di 150 ol di analisi radioimmunoprecipitazione (RIPA) (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% di surfactant non ionico; 0,1% solfato di dodecyl di sodio; pH 7,5). Centrifuga estrae a 4 gradi centigradi per 10 min a 16000 x g, raccogliere supernatali e determinare la concentrazione totale di proteine utilizzando il metodo Bradford.</li>
		<li>Caricare 30 g di proteine totali su un 12% di solfato di solfato poliacrita elettroforesi gel (SDS-PAGE).</li>
		<li>Dopo l'elettroforesi, trasferire il contenuto di gel su una membrana di nitrocellulosa.</li>
		<li>Dopo aver bloccato la membrana con il 5% di latte secco non grasso in TBS più 0,1% Tween, incuba recitare con il topo anti-pERK (1:1,000) per 16 h a 4 gradi centigradi. Dopo il lavaggio, incubare per 2 h a RT con coniglio anti-ERK1/2 (1:1,000).</li>
		<li>Incubare con l'anticorpo secondario coniugato HRP appropriato a RT per 1 h.</li>
		<li>Rivelare con il substrato HRP preferito.</li>
	</ol></li>
	<li>Valutazione morfologica NOTA: Oltre alla sopravvivenza cellulare e alle valutazioni funzionali, è importante analizzare la morfologia dei tessuti. Essere consapevoli del fatto che la resezione della fetta coltivata è un passo importante per produrre quanto più materiale di alta qualità possibile per l'analisi morfologica.<ol>
<li>Fissaggio, crioprotezione e resezione delle fette<ol>
<li>Trasferire le fette dai pozzi con mezzo di coltura a un nuovo 24 piastra ben contenere PBS.</li>
			<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 1 mL di 4% paraformaldeide (PFA). È importante che le fette siano mantenute piatte prima di aggiungere PFA. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.</li>
			<li>Rimuovere con attenzione la soluzione PFA e aggiungere 1 mL di 30% soluzione di saccarosio. Incubare per 48 h a 4 gradi centigradi.</li>
			<li>Impostare il microtoma di congelamento su -40 gradi centigradi.</li>
			<li>Preparare una base di saccarosio sullo stadio del microtoma in cui devono essere posizionate le fette (Figura 2A). Lasciare congelare completamente e tagliare con cura parte del saccarosio congelato per produrre una superficie piana su cui verrà posizionata la fetta.</li>
			<li>Posizionare ogni fetta su una pellicola di plastica allungata e utilizzare un pennello per appiattire il tessuto.</li>
			<li>Trasferire la fetta tesa alla base di saccarosio congelata in un'unica mossa. NOTA: Non è possibile spostare la fetta una volta sopra la base di saccarosio congelata. Eseguire questo passaggio di trasferimento con attenzione.</li>
			<li>Lasciare riposare la fetta per 5-10 min per un corretto congelamento.</li>
			<li>Tagliare la fetta in sezioni di 30 m.</li>
			<li>Trasferire le sezioni da 30 m in una piastra Petri contenente PBS.</li>
			<li>Procedere al protocollo di istologia più adeguato alla progettazione sperimentale. NOTA: Le 30 sezioni possono essere facilmente utilizzate per l'immunoistochimica a fluttuazione libera, montate su diapositive di microscopia per un'ulteriore istologia o conservate in soluzione antigelo a -20 gradi centigradi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Immunohistochemistry NOTA: I protocolli standard di immunoistochimica e immunofluorescenza variano da laboratorio a i laboratorio. Per una versione dettagliata del protocollo qui utilizzato, fare riferimento a Horta et al.38. Gli anticorpi primari utilizzati per le immunostainings presentati nella Figura 2 includono nuclei neuronali (NeuN), marcatore neurone maturo sano, proteine acidiche fibrillari gliali (GFAP), marcatore di atorciti, adattatore legante di calcio ionizzato (Iba-1) e microglia pennarello.<ol>
<li>Incubare le fette in soluzione di blocco (ad esempio, 2% siero d'asino normale in PBS) per 40 min.</li>
			<li>Incubare durante la notte con anticorpo primario in fase di lieve agitazione a 4 gradi centigradi.</li>
			<li>Dopo il lavaggio con PBS, incubare per 120 min con anticorpi secondari biotinylati in lieve agitazione a RT.</li>
			<li>Dopo il lavaggio con PBS, incubare a RT per 120 min con coniugato avidin-perossidasi (Tavolo dei materiali).</li>
			<li>Svelare con DAB - 0.04% di ammonio al nichel.</li>
			<li>Montare le sezioni colorate su vetrini di microscopia rivestiti di gelatina e lasciarli asciugare all'aria. Disidratare in etanolo, diaficare in xilene, finire con supporto di montaggio (Tavolo dei materiali), coprire con una copertina e immagine.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo per la produzione di colture di fette a breve termine e galleggianti è un metodo alternativo per coltivare fette neocorticali umane adulte. Tale protocollo per le colture di fette può essere suscettibile di studi su (ma non limitato a) optogenetica1,44,45, elettrofisiologia2,3,4,5 , p...

L'uso di campioni umani nella ricerca è inequivocabilmente una grande opzione per studiare le patologie cerebrali umane, e le tecniche moderne hanno aperto nuovi modi per la sperimentazione robusta ed etica utilizzando tessuti derivati dal paziente. Metodi come le colture organotipiche/fette preparate dal cervello umano adulto sono stati sempre più utilizzati in paradigmi come l'optogenetica1, l'elettrofisiologia2,3,4,5, plasticità 6,7,8,9,neurotossicità/neuroprotezione10,11,12,13, terapia cellulare14, screening farmacologico15,16,17, genetica e genetica editing12,18,19,20, tra gli altri, come strategia per la migliore neurologiche durante l'età adulta.
La comprensione dei meccanismi alla base delle patologie cerebrali umane dipende da strategie sperimentali che richiedono un gran numero di soggetti. Al contrario, nel caso delle colture di fette, anche se l'accesso a campioni umani è ancora difficile, la possibilità di generare fino a 50 fette da un singolo campione corticale elude parzialmente la necessità di reclutare più volontari aumentando la numero di repliche ed esegue saggi per tessuto raccolto21.
Sono stati descritti diversi protocolli per le colture organotipiche/fette cerebrali, che vanno dalle classiche bozze oculo22,23 al tubo a rulli24,25,26, membrane semipermeabili l'interfaccia27,28,29,30e le sezioni free-floating31,32. A seconda delle particolarità di un progetto sperimentale, ogni tecnica ha i suoi vantaggi e svantaggi. Le colture di fette a breve termine e fluttuanti da cervelli umani adulti sono in alcuni casi vantaggiose rispetto al metodo utilizzato da Stoppini et al.27, se si considera il fatto che sebbene la sopravvivenza cellulare a lungo termine in vitro sia di solito una delle principali preoccupazioni quando si valuta un metodo di coltura, in molti esperimenti sono necessari solo brevi periodi di tempo nella coltura12,31,32,33,34,35. In queste condizioni, l'uso di colture a flottante presenta il vantaggio di essere più semplice e più conveniente, oltre a assomigliare in modo più accurato alla condizione originale del tessuto umano rispetto alle fette mantenute in coltura per 2-3 settimane.
Nonostante il potenziale delle colture di fette alle neuroscienze, gli studi sull'uso del tessuto nervoso adulto per preparare tali colture sono ancora scarse, in particolare da soggetti umani. Questo articolo descrive un protocollo per utilizzare il tessuto cerebrale raccolto da donatori umani viventi sottoposti a chirurgia cerebrale resective per preparare colture di fette galleggianti libere. Le procedure per mantenere ed eseguire saggi biochimici e di biologia cellulare utilizzando queste culture sono dettagliate. Questo protocollo si è dimostrato prezioso per analizzare la vitalità e la funzione neuronale nelle indagini sui meccanismi delle neuropatologie legate all'età adulta.

<table><tbody><tr><td>2-propanolo</td><td>Merck</td><td>1096341000</td><td></td></tr><tr><td>acrilammide/bis-acrilammide, soluzione al 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3449&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ERK 2 (coniglio)</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-154</td><td>Diluizione 1:1.000 in BSA 2,5%</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-pERK (topo)</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-7383</td><td>Diluizione 1:1.000 in BSA 2,5%</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3014</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 1x reagente colorante</td><td>BioRad</td><td>500-0205</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Utilizzato nel tampone RIPA</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sali bilanciati di Hank</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1387-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno (H2O2)</td><td>Vetec</td><td>194</td><td></td></tr><tr><td>IgG di topo, Ab intero legato a HRP (anti-topo)</td><td>GE</td><td>NA931-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1064041000</td><td>Utilizzato nel tampone RIPA</td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Latte in polvere scremato (Molico)</td><td>Nestl&eacute;</td><td></td><td>Utilizzato per il blocco della membrana</td></tr><tr><td>PBS Tampone pH 7,2</td><td>Laborclin</td><td>590338</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Streptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>Prime Western Blotting Reagente</td><td>di rilevamento GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>IgG di coniglio, Ab intero legato a HRP (anti-coniglio)</td><td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L5750</td><td>Utilizzato nel tampone RIPA TEMED</td></tr><tr><td></td><td>GE</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>Tiazoile Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T-1378</td><td>Utilizzato nel tampone RIPA</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Utilizzato nel tampone RIPA</td></tr><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Millipore</td><td></td><td>Acqua sterile, derivata dal sistema di purificazione dell'acqua MiliQ</td></tr><tr><td>Attrezzature e materiali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>CL S3526</td><td>Fondo piatto con coperchio</td></tr><tr><td>Amersham Potran Premium (membrana in nitrocellulosa)&nbsp;</td><td>Miscela di</td> carbogeni GE <td>29047575</td><td></td></tr><tr><td></td><td>White Martins</td><td>95% O2, 5% CO2</td>Incubatore <td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>CO-24</td><td>Incubazione di fette 5% CO2, 36&ordm; C</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td> Dispositivi <td></td><td></td><td>molecolari</td></tr><tr><td>Microtubi</td><td>Greiner</td><td>001608</td><td>1,5mL microtubo</td></tr><tr><td>Pestello motorizzato</td><td>Kimble Chase</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cucchiaio</td><td></td><td></td><td>di plastica Dimensioni di un cucchiaio da dessert</td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Bic</td><td></td><td>Chrome Platinum, utilizzato nell'affettatura con vibratomo</td></tr><tr><td>Lama</td> <td>di bisturiBecton Dickinson (BD)</td><td>Numero 24</td><td>Utilizzato per l'affettatura di tessuti; si consiglia una Supercolla della stessa dimensione o più piccola</td></tr><tr><td>(Loctite Super Bonder)</td><td>Henkel</td><td></td><td>Composizione: Etilcianoacrilato; acido 2-propenoico; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-cresolo; omopolimero</td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp;</td><td>Leica</td><td>14047235612 - VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Nome del materiale/ Attrezzatura per immunoistochimica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-NeuN (topo)</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>MAB377</td><td>Diluizione 1:1.000 in tampone fosfato</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFAP (topo)</td><td>Merck</td><td>MAB360</td><td>Diluizione 1:1.000 in tampone fosfato</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Iba1 (coniglio)</td><td>Abcam</td><td>EPR16588 - ab178846</td><td>Diluizione 1:2.000 in tampone fosfato</td></tr><tr><td>Anticorpo IgG biotinilato anti-topo (H+L)</td><td>Vettore</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-9015</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>Sintetizzatore di gelatina</td><td></td><td>00G1002.02.AE</td><td>Utilizzato per il rivestimento di vetrini</td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td>Dotato di tavolino di congelamento (BFS-10MP, Physiotemp), impostato su -40&ordm; C</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>IgG di coniglio, Ab intero legato a HRP (anti-coniglio)</td><td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini (Star Frost)</td><td>Knittel Glaser</td><td></td><td>Vetrini rivestiti di gelatina</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Vetec</td><td>60REAVET017050</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC HRP Kit (Perossidasi, Standard)</td><td>Vector</td><td>PK-4000, Kit Standard</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Synth</td><td>01X1001.01.BJ</td><td></td></tr></tbody></table>

a breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotipica, o colture di fette, sono state ampiamente impiegate per modellare aspetti del funzionamento del sistema nervoso centrale in vitro. Nonostante il potenziale delle colture di fette nelle neuroscienze, gli studi che utilizzano il tessuto nervoso adulto per preparare tali culture sono ancora scarse, in particolare quelle provenienti da soggetti umani. L'uso di tessuto umano adulto per preparare le colture di fette è particolarmente interessante per migliorare la comprensione delle neuropatologie umane, in quanto contengono proprietà uniche tipiche del cervello umano maturo privo di fette prodotte da roditori (di solito neologati) tessuto nervoso. Questo protocollo descrive come utilizzare il tessuto cerebrale raccolto da donatori umani viventi sottoposti a chirurgia cerebrale resective per preparare colture di fette a breve termine, galleggianti libere. Vengono inoltre presentate procedure per mantenere ed eseguire saggi biochimici e di biologia cellulare utilizzando queste culture. I risultati rappresentativi dimostrano che la tipica laminazione corticale umana è conservata in fette dopo 4 giorni in vitro (DIV4), con la presenza prevista dei principali tipi di cellule neurali. Inoltre, le fette al DIV4 subiscono una robusta morte cellulare quando vengono sfidate con uno stimolo tossico (H2O2), indicando il potenziale di questo modello per fungere da piattaforma nei saggi di morte cellulare. Questo metodo, un'alternativa più semplice ed economica al protocollo ampiamente usato utilizzando inserti di membrana, è raccomandato principalmente per l'esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all'età. Infine, sebbene il protocollo sia dedicato all'utilizzo del tessuto corticale raccolto da pazienti sottoposti al trattamento chirurgico dell'epilessia del lobo temporale farmacoresistente, si sostiene che anche i tessuti raccolti da altre regioni/condizioni cerebrali per produrre simili colture di fette a flotta ntetto.

Un aspetto critico per valutare la qualità e la salute delle fette coltivate è la presenza e la morfologia tipica dei tipi di cellule neurali previste, neuroni e cellule gliali. L'architettura tipica della laminazione corticale umana è stata osservata in una fetta al DIV4, rivelata dall'immunoetichettatura neuronale (Figura 2D). Inoltre, è stata osservata anche la prevista presenza di microglia e astroglia (Figura 2B,C). Questi ...

Viene presentato un protocollo per preparare colture di fette galleggianti libere dal cervello umano adulto. Il protocollo è una variazione del metodo di coltura della fetta ampiamente utilizzato utilizzando inserti di membrana. È semplice, conveniente e consigliato per l'esecuzione di saggi a breve termine volti a svelare meccanismi di neurodegenerazione dietro le malattie cerebrali associate all'età.

A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Presentiamo un protocollo per preparare colture di fette galleggianti libere dal tessuto cerebrale raccolte da donatori umani viventi sottoposti a chirurgia cerebrale resettiva. Questa coltura è suscettibile di eseguire saggi biochimici e di biologia cellulare o immunoistochimica. Si prevede che contribuirà alla spiegazione del meccanismo alla base della neurodegenerazione nelle malattie cerebrali associate.Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un'alternativa più semplice ed economica al classico protocollo di coltura delle fette utilizzando inserti a membrana. Sebbene il protocollo complessivo non sia complesso, alcuni passaggi come la rimozione delle meningi, l'incollaggio del tessuto al disco del campione di vibratomo e la resezione per l'immunoistochimica sono meglio compresi quando dimostrati visivamente. A dimostrare la procedura saranno Niele Mendes e Glaucia Almedia, studentesse laureate, e Giovanna Nogueira, un'altra studentessa laureata.Per iniziare questa procedura, aggiungere sale a un secchio di ghiaccio. Trasferire la soluzione di affezione in questo secchio e lasciarlo riposare sotto la miscela di carbogeno gorgogliando per almeno 20 minuti prima dell'uso

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Slice Cultura organotipica di E18 cervello dei topi

Descriviamo un metodo per preparare organotipica fettine di ippocampo che può essere facilmente adattato ad altre regioni del cervello. Sezioni di cervello sono previste sulle membrane porose e terreni di coltura è consentito costituiscono l'interfaccia. Questo metodo consente di mantenere l'architettura lordo dell'ippocampo per un massimo di 2 settimane in cultura.

Organotipica Culture Slice ippocampale

Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Questo video dimostra una tecnica per preparare colture di fette fluttuanti dal cervello umano adulto. Fette sottili vengono generate da una sezione del cervello utilizzando un vibratomo. Queste fette vengono quindi sospese in un terreno di coltura integrato con fattori di crescita per mantenere la vitalità dei tessuti.

Preparazione di colture a fette fluttuanti da un cervello umano adulto

Il video dimostra la generazione e il mantenimento di colture organotipiche di fette da tessuto di glioblastoma. Il tessuto isolato è incorporato in una matrice di agarosio e sezioni sottili sono ottenute utilizzando un vibratomo. Queste sezioni vengono quindi posizionate su inserti di membrana permeabili all'interno di una micropiastra e coltivate in un terreno di mantenimento della coltura a fette per un mantenimento a lungo termine.

Generazione e mantenimento di colture di fette da tessuto di glioblastoma umano

In questo articolo mostriamo un metodo per preparare fette acute di cervello a temperatura fisiologica, utilizzando una soluzione fisiologica convenzionale senza particolari modifiche per il taglio (come l'aggiunta di saccarosio) e senza perfusione intracardica dell'animale prima della preparazione della fetta.

Slice It Hot: acuta cervello adulto affettare in fisiologica Temperatura

Qui si descrive una tecnica per lo studio dell'ippocampo la neurogenesi postnatale utilizzando la tecnica organotipica cultura fetta. Questo metodo permette la manipolazione in vitro di neurogenesi adulta e permette l'applicazione diretta di agenti farmacologici per l'ippocampo in coltura.

Colture organotipiche Slice di studi di post-natale neurogenesi

Colture organotipiche fettine di ippocampo (OHSC) rappresentano un modello in vitro che simula molto bene la situazione in vivo . Qui descriviamo un basato su vibratome migliorato affettare protocollo per ottenere fette di alta qualità per uso nel valutare il potenziale di neuroprotective del romanzo sostanze o il comportamento biologico delle cellule del tumore.

Colture Hippocampal Fetta organotipiche come modello di studio Neuroprotection e l'invasività delle cellule del tumore

Presentato qui è un metodo di tubo rullo modificate per la coltura e fette di imaging ad alta risoluzione intermittente del cervello del roditore sopra molte settimane con riposizionamento preciso sulle lamelle di fotoincisioni. Vitalità neuronale e fetta morfologia sono ben tenute. Vengono fornite applicazioni di questo sistema completamente chiusa usando i virus per espressione specifica del tipo di cella.

Metodo del tubo rullo modificate per Imaging intermittente precisamente localizzata e ripetitivi durante la coltura a lungo termine delle fette di cervello in un sistema chiuso

Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.

Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Questo protocollo descrive colture organotipiche a lungo termine di corteccia umana adulta combinate con trapianto intracorticale ex vivo di progenitori corticali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte, che presentano una nuova metodologia per testare ulteriormente terapie basate su cellule staminali per malattie neurodegenerative umane.

Colture organotipiche della corteccia umana adulta come modello ex vivo per il trapianto e la validazione di cellule staminali umane

Impara a preparare colture di fette libere da tessuto cerebrale umano adulto per studiare neurodegenerazione. Questo metodo semplificato consente saggi biochimici e immunistochimici su campioni chirurgici.

A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto

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