Name: Sequenziamento dellRNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Scopri il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per studiare l'eterogeneità cellulare e la regolazione genica nelle isole pancreatiche umane. Questo metodo ad alta portata identifica tipi cellulari rari.

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1. Dissociazione dell'isolotto umano
<ol><li>Ottenere isolotti umani isolati da donatori di organi di cadaveri di entrambi i sessi, età compresa tra 15-80 anni, senza malattie preesistenti, a meno che non siano richieste isole di donatori con dati demografici specifici per lo scopo di studio.<ol>
<li>Dopo l'isolamento, tenere le isole isolate nella struttura di coltura dei tessuti per 2-3 giorni presso il fornitore. Spesso ci vuole più di 1 giorno perché i danni all'isolotto diventino visibili.</li>
		<li>Mettere gli isolette in una bottiglia e immergerle completamente nel supporto dell'isolotto. Portarlo al laboratorio con una spedizione notturna.</li>
		<li>Ottenere la quantità equivalente di ilettè (IEQ) delle isole spedite dal fornitore dell'isolotto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recuperare le isole dalla spedizione il giorno dell'arrivo dell'isolotto. Eseguire questo passaggio utilizzando un cappuccio per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione.<ol>
<li>Raffreddare il supporto completo dell'isolotto (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x Pen-Strep, 2 mM glutamine) in frigorifero.</li>
		<li>Trasferire le isole dalla bottiglia a un tubo conico da 50 ml.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di supporti completi di isolotto preraffreddati alla bottiglia svuotata per lavare le isole rimanenti. Trasferire il supporto al tubo conico.</li>
		<li>Centrifugare il tubo a 200 x g per 2 min per recuperare le isole. Aspirare il supernatante lasciando circa 1-2 mL media con il pellet.</li>
		<li>Risospendere le isole con supporti isolotti completi pre-raffreddati. In base all'IEQ fornito dal fornitore, aggiungere supporti da 12 mL per 5000 IEQ.</li>
		<li>Versare le isole nei supporti su un piatto di coltura tissutale non trattato di 10 cm. Incubare durante la notte in un'incubatrice di coltura tissutale a 37 gradi centigradi con 5% diCO2 nell'aria atmosferica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissociare le isole come illustrato di seguito. Eseguire questo passaggio dopo l'incubazione notturna.<ol>
<li>Supporti pre-caldo completi e soluzione di dissociazione cellulare.</li>
		<li>Preparare 1x PBS contenente lo 0,04% di BSA a temperatura ambiente.</li>
		<li>Contare e raccogliere a mano 200-300 isolotti utilizzando una pipetta P200 e trasferire le isole su un tubo conico da 15 mL contenente supporti di isolotto completo preriscaldati da 5 mL.</li>
		<li>Raccogliere le isole con centrifugazione a 200 x g per 2 min. Aspira delicatamente il supernatante senza disturbare il pellet sul fondo.</li>
		<li>Aggiungere 1,0 mL di dissociazione cellulare preriscaldata e interrompere il pellet pipetting delicatamente su e giù. Incubare le isole a 37 gradi centigradi per 9-11 min. Ogni 3 min pipette su e giù lentamente per 10 s per dissociare le cellule in singole cellule.</li>
		<li>Una volta che le cellule dell'isolotto sono ben dissociate e la soluzione diventa torbida, aggiungere un supporto di issololet completo da 9 mL e filtrare attraverso un colino cellulare di 30 m in un nuovo tubo conico da 15 mL.</li>
		<li>Lavare il tubo e il colino cellulare con un supporto di isolotto completo da 2 mL per raccogliere le isole rimanenti e aggiungerle allo stesso tubo.</li>
		<li>Raccogliere le cellule per centrifugazione a 400 x g per 5 min.</li>
		<li>Aspirare delicatamente i supporti e risospendere il pellet cellulare in 5 mL 1x PBS contenente 0,04% BSA (PBS-BSA).</li>
		<li>Filtrare attraverso un nuovo colino da 30 m in un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 min per raccogliere le cellule.</li>
		<li>Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 200-300 -L 1x soluzione PBS-BSA.</li>
		<li>Misurare la concentrazione delle cellule e regolare il volume ad una concentrazione finale di 400-500 cellule/L.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Controllo qualità delle sospensioni a cella singola
<ol><li>Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore cellulare automatizzato basato sulla fluorescenza34 .<ol>
<li>Mescolare 10 celle con 0,5 AO/DAPI. Pipette mescolare accuratamente. Caricare 10,5 l sulla diapositiva ed eseguire il test del conteggio cellulare per determinare il conteggio e la fattibilità.</li>
		<li>Diluire e/o filtrare la sospensione cellulare in base alle esigenze in base al numero di celle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Partizionamento a cella singola utilizzando un chip microfluidico. Seguire il protocollo dal produttore di chip microfluidici35.
<ol><li>Portare 3' perline di gel e reagenti di trascrizione inversa (RT) a temperatura ambiente (>30 min). Ricostituire l'idera RT nel buffer TE, se necessario.</li>
	<li>Preparare la miscela master RT in un tubo a basso legame come descritto nella tabella 1.</li>
	<li>Determinare il numero di celle da immettere per ogni campione. Calcolare il volume di sospensione cellulare (X) necessario per fornire il numero di cella di destinazione desiderato. Il volume calcolato di acqua priva di nuclenonazione da aggiungere ad ogni campione sarà di 33,8-X L.</li>
	<li>Per ogni campione da partizionare, aggiungere 33,8-X acqua priva di nucle in un tubo a striscia PCR da 0,2 mL. Quindi, aggiungere 66,2 ll mix master per ogni tubo striscia. Non aggiungere le celle al tubo striscia in questo punto. Pipette delicatamente mescolare. Posizionare i tubi a striscia preparati sul ghiaccio.</li>
	<li>Mettere un chip microfluidico in una custodia per chip. Orientare la cassa del chip assicurando che i pozzi di olio (riga etichettata 3) siano più vicini alla persona che esegue l'esperimento.</li>
	<li>Se si esegue meno di 8 campioni, utilizzare il 50% di glicerolo per riempire i canali inutilizzati nel seguente ordine:<ol>
<li>Aggiungere 90 lun del 50% glicerolo nei pozze nella fila 1 per tutti i canali inutilizzati.</li>
		<li>Aggiungere 40 lun del 50% glicerolo nei pozze nella riga 2 per tutti i canali inutilizzati.</li>
		<li>Aggiungere 270 lun del 50% glicerolo nei pozze nella riga 3 per tutti i canali inutilizzati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agganciare le perline di gel in un vortice. Vortex a tutta velocità per 30 s. Toccare la striscia sulla panca più volte per raccogliere perline. Verificare che non siano presenti bolle.</li>
	<li>Aggiungere X-L di cellule nei tubi a strisce preparati. Pipette per mescolare 5 volte. Senza scartare le punte della pipetta, trasferire 90-L di miscela cellulare nella riga 1 del chip.</li>
	<li>Attendere 30 s, quindi caricare 40 gradi L di perline di gel alla fila 2. Pipette molto lentamente per questo passaggio. Distribuisci 270 - L di partizionamento dell'olio ai pozzi della riga 3.</li>
	<li>Agganciare la guarnizione del chip sulle linguette del supporto del chip. Posizionare il supporto del chip assemblato nel dispositivo di partizionamento a cella singola e premere il pulsante esegui.</li>
	<li>Rimuovere immediatamente il supporto del chip assemblato al completamento dell'esecuzione.</li>
	<li>Togliere la guarnizione del truciolo dal supporto, aprire la custodia del chip con un angolo di 45 gradi e rimuovere 100 l'emulsione dal chip in una piastra blu in plastica 96-well.</li>
</ol>4. Amplificazione cDNA a cella singola. Seguire il protocollo dal produttore di chip microfluidici35.
<ol><li>Trascrizione inversa. NOTA: Eseguire questo passaggio sotto un cappuccio solo PCR pulito per evitare la contaminazione microbica e di altro tipo del cDNA non amplificato.<ol>
<li>Sigillare la piastra blu 96-well con un sigillo di stagnola su un sigillante a piastre riscaldate.</li>
		<li>Eseguire la reazione di trascrizione inversa in un ciclore termico come segue: 53 gradi centigradi per 45 min à 85 gradi centigradi per 5 min à 4 gradi centigradi. NOTA: questo è un punto di arresto sicuro. I campioni possono contenere a 4 gradi centigradi per un massimo di 72 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificazione post-RT<ol>
<li>Portare le perle magnetiche leganti acide nucleiche e le perle magnetiche di selezione delle dimensioni dell'acido nucleico alla temperatura ambiente e al vortice per ri-sospendere. A questo punto, scongelare il buffer di pulitura del campione per 10 min a 65 gradi centigradi. Portare tutti gli altri reagenti a temperatura ambiente e vortice.</li>
		<li>Preparare i buffer come illustrato nelle tabelle 2 e nelle tabelle 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rompere chimicamente l'emulsione e purificare.<ol>
<li>Per farlo, rimuovere delicatamente il sigillo di pellicola dalla piastra.</li>
		<li>Distribuisci 125 l di reagente che rompe l'emulsione rosa in ogni emulsione. Attendere 1 min, quindi trasferire l'intero volume in un tubo striscia pulito 0,2 mL. Assicurarsi che ci sia uno strato di chiaro e uno strato di rosa nel tubo striscia.</li>
		<li>Rimuovere 125 l dello strato rosa dal fondo del tubo striscia senza disturbare lo strato chiaro. È normale che un piccolo volume (15 dollari) dello strato rosa rimanga nel tubo.</li>
		<li>Aggiungere 200 l di pulitura dal tavolo 2 al tubo di strip e incubare a temperatura ambiente per 10 min.</li>
		<li>Trasferire il tubo a strisce su un supporto magnetico e lasciare che la soluzione si schiarisca. Rimuovere il supernatante e scartare, quindi lavare le perline con l'80% di etanolo due volte. Lasciare asciugare le perline per 1 min.</li>
		<li>Togliere il tubo di striscia dal magnete e aggiungere 35,5 gradi di soluzione di eluizione dal tavolo 3 alle perline. Pipette per risospendere le perline nella soluzione. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Trasferire il tubo a strisce su un supporto magnetico e lasciare che la soluzione si schiarisca. Rimuovere il cDNA purificato dal tubo di strip e dispensarlo per pulire i tubi a strisce da 0,2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplifica il cDNA.<ol>
<li>Preparare il mix master di amplificazione nella tabella 4, di seguito.</li>
		<li>Aggiungete a ogni campione 65 - cDNA Amplification Master Mix. Mettere il tubo a strisce in un ciclore termico ed eseguire il seguente programma: 98 c 3 min à 15 cicli di [98 s 15 s à 67 C 20 s à 72 C 1 min] à 72 c 5 min à 4 . NOTA: questo è un punto di arresto sicuro. I campioni possono essere detenti fino a 4 oC per un massimo di 72 h.</li>
		<li>Purificare il cDNA amplificato con perline magnetiche di selezione dell'acido nucleico 0,6x. Lavare due volte con l'80% di etanolo ed elutare con 40,5 l.</li>
		<li>Eseguire il cDNA di controllo qualità utilizzando l'elettroforesi automatica del gel e il test di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza36,37. NOTA: questo è un punto di arresto sicuro. I campioni possono contenere fino a 4 gradi centigradi per un massimo di 72 h o a -20oC a tempo indeterminato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Costruzione della biblioteca di sequenziamento
<ol><li>Tagmentation e pulizia di cDNA38.<ol>
<li>Normalizzare cDNA a 50 ng in 20 gradi del volume totale. La quantificazione esatta è fondamentale in questo passaggio.</li>
		<li>Fare il mix di tagmentation nella tabella 5 e 30 per ogni campione di cDNA da 20 gradi sul ghiaccio. Mettere i campioni nel ciclore termico ed eseguire il protocollo di tagmentation: 55 c 5 min à 10 gradi centigradi.</li>
		<li>Eseguire la pulizia del cDNA con tag mediante le colonne38. Aggiungere 180 buffer di legatura del DNA l per ogni campione. Trasferire 230 l in una colonna di spin.</li>
		<li>Centrifuga a 1300 x g per 2 min e scartare il flusso attraverso.</li>
		<li>Lavare due volte con 300 tamponi di lavaggio del DNA. Centrifugare un ulteriore 2 min a 1300 x g per garantire la rimozione dell'etanolo.</li>
		<li>Elute ha purificato il cDNA con l'aggiunta di 31 L di tampone di eluizione alla colonna e incubare a temperatura ambiente per 2 min.</li>
		<li>Centrifuga per 2 min a 1300 x g per recuperare il prodotto purificato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Indice di esempio PCR.<ol>
<li>Scegliere codici a barre che non si sovrappongono durante una sequenza multiplexata.</li>
		<li>Creare una combinazione master PCR di indice di esempio, come illustrato nella Tabella 6.</li>
		<li>Aggiungere 60 -L di Sample Index PCR master mix a 30 .</li>
		<li>Aggiungete 10 -L di un indice campione di 20 m e 4 oligo ad ogni campione (indice di registrazione utilizzato). Il volume di reazione totale è ora di 100.</li>
		<li>Mettere in un ciclore termico con il coperchio impostato a 105 gradi centigradi. Eseguire il seguente programma: 98 c 45 s à 12-14 cicli di [98 c 20 s à 54 .C 30 s à 72 s 20 s] à 72 c 1 min à 4 . NOTA: questo è un punto di arresto sicuro. I campioni possono contenere a 4 gradi centigradi per un massimo di 72 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificare le librerie con doppia pulizia del tallone.<ol>
<li>Aggiungere al campione 100 l di dimensioni dell'acido nucleico per raggiungere il campione e mescolare accuratamente con una pipetta. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Trasferire su un magnete e lasciarlo riposare fino a quando la soluzione non si schiarisce. Rimuovere e scartare il super-natante.</li>
		<li>Lavare due volte con 200 l di 80% di etanolo.</li>
		<li>Asciugare le perline sul magnete per 2 min. Rimuovere dal magnete e aggiungere 50,5 L di EB Buffer al pellet di perline. Pipette per sospendere nuovamente le perline nel buffer.</li>
		<li>Incubare a temperatura ambiente per 2 min. Trasferire su un magnete e lasciare riposare per 2 min.</li>
		<li>Aggiungere 40 perline magnetiche di selezione delle dimensioni dell'acido nucleico al campione e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Trasferire su un magnete e lasciare la soluzione libera. Rimuovere e scartare supernatante.</li>
		<li>Lavare due volte con 125 l2 dell'80% di etanolo.</li>
		<li>Asciugare le perline sul magnete per 2 min. Rimuovere dal magnete e aggiungere 60,5 l di EB Buffer al pellet di perline. Pipette per sospendere nuovamente le perline nel buffer.</li>
		<li>Incubare a temperatura ambiente per 2 min. Trasferire su un magnete e lasciarlo riposare per 2 min. Questa è la biblioteca finale.</li>
		<li>Conservare i campioni a 4 gradi centigradi per un massimo di 72 h o a -20 gradi centigradi a tempo indeterminato. Si noti che si tratta di un punto di arresto sicuro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificare ed eseguire il controllo di qualità delle librerie finali utilizzando l'elettroforesi automatica del gel e il test di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza36,37. Diluire i campioni 1:10 prima di eseguire il controllo di qualità.</li>
</ol>6. Sequenza delle librerie
<ol><li>Normalizzare ogni campione da sequenziare a 2 ng/-L e pool 3 - L di ogni campione normalizzato insieme.</li>
	<li>Misurare la concentrazione della piscina con il saggio di quantificazione del DNA basato sulla fluorescenza37.</li>
	<li>Diluire la piscina a 0,25 ng/L.</li>
	<li>Denaturare la piscina come segue: 12 l di diluito campione raggruppato (0,25 ng/L) : 1 controllo del DNA ll (1 nM), 2 Buffer EB L - 5 N. L NaOH (0,4N). Lasciare incubare per 5 min, quindi aggiungere 10 L di 200 mM Tris pH 8.0.</li>
	<li>Caricare 4,05 l in 1345,95 HT1. Caricare 1,3 mL nella cartuccia del sequencer ed eseguire secondo le linee guida del produttore39 utilizzando una ricetta di sequenziamento con 26 cicli (Lettura 1) - 8 cicli (indice i7) - 0 cicli (indice i5) - 55 cicli (Lettura 2).</li>
</ol>7. Allineamento di lettura (file supplementare 1)
<ol><li>Eseguire Cell Ranger (v2.0.0) per demultiplex file di chiamata di base raw (BCL) generati dalla sequenza in file FASTQ. Allineare i file FASTQ all'assembly del genoma B37.3 umano e al modello genico UCSC per ottenere la quantificazione dell'espressione.</li>
	<li>Controllo della qualità dell'allineamento.<ol>
<li>Generare metriche di allineamento e controllare le basi Q30, la frazione di codice a barre valida, la frazione di lettura associata alle celle, la frazione di lettura mappata e le letture rilevate in ogni cella.</li>
		<li>Esaminare il grafico di classificazione dei codici a barre per assicurarsi che la separazione dei codici a barre associati alle celle e dello sfondo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Analisi dei dati (file supplementare 2)
<ol><li>Controllo e pre-elaborazione della qualità delle celle.<ol>
<li>Escludere le celle con < 500 geni rilevati, < 3000 numero totale di identificatori molecolari univoci (UMI), > 0,2 punteggidi fattibilità come descritto in precedenza32. Regolare i tagli in base ai tipi di tessuto e cellule.</li>
		<li>Rimuovere i doppietti.<ol>
<li>Valutare i cinque geni dell'ormone endocrino (glucagone - GCG,insulina - INS, somatostatina - SST, polipeptide pancreatica - PPYe grelina - GHRL) per il modello di espressione bimodale (modalità alta e bassa espressione) utilizzando R pacchetto mclust40.</li>
			<li>Rimuovere le cellule che esprimono più di un gene ormonale, cioè con due o più geni ormonali nella modalità ad alta espressione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Normalizzare l'espressione genica per l'UMI totale e moltiplicare per il fattore di scala di 10.000 a livello di cella utilizzando il pacchetto R Seurat41.</li>
		<li>Rimuovere i geni rilevati in meno di 3 cellule.</li>
		<li>Rileva geni variabili usando l'espressione media e la dispersione di tutte le cellule. Regolare i tagli in base ai tipi di tessuto e cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire l'analisi del componente principale con i geni variabili. Raggruppare le celle con il numero selezionato di componenti principali. Derivageni arricchiti a grappolo cellulare confrontando un cluster di cellule con il resto delle cellule.</li>
</ol>

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<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Human islets contain four distinct subtypes of beta cells.</a> Nature Communications. 7, 11756(2016).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+reveal+characteristic+features+of+human+pancreatic+islet+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types.</a> EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).</li>
<li>Muraro, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Cell+Transcriptome+Atlas+of+the+Human+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas.</a> Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).</li>
<li>Segerstolpe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptome+Profiling+of+Human+Pancreatic+Islets+in+Health+and+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes.</a> Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).</li>
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<li>Lawlor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+identify+human+islet+cell+signatures+and+reveal+cell-type-specific+expression+changes+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes.</a> Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).</li>
<li>Wang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptomics+of+the+Human+Endocrine+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas.</a> Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotime+Ordering+of+Single+Human+beta-Cells+Reveals+States+of+Insulin+Production+and+Unfolded+Protein+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response.</a> Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Sequencing+of+Single+Human+Islet+Cells+Reveals+Type+2+Diabetes+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes.</a> Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).</li>
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<li>10X Genomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%2210X+Genomics%3A+Chromium+Single+Cell+3%E2%80%99+Reagents+Kits+v2%3A+User+Guide%22">10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide</a>. , 10X Genomics. (2017).</li>
<li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Agilent+Bioanalyzer%3A+High+Sensitivity+DNA+Kit+Guide%22">Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide</a>. , Agilent Technologies. (2013).</li>
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<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+integration+of+single+cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Preprint+at+bioRixv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive integration of single cell data.</a> Preprint at bioRixv. , (2018).</li>
<li>DePasquale, E. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DoubletDecon%3A+Cell-State+Aware+Removal+of+Single-Cell+RNA-Seq+Doublets%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
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<li>Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrublet%3A+computational+identification+of+cell+doublets+in+single-cell+transcriptomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Dominguez Gutierrez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Signature+of+Proliferating+Human+Pancreatic+alpha+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells.</a> Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19 (1), 224(2018).</li>
</ol>

Tutti gli autori sono dipendenti e azionisti di Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Le tecnologie a cella singola sviluppate negli ultimi anni forniscono una nuova piattaforma per caratterizzare i tipi di cellule e studiare l'eterogeneità molecolare nelle isole pancreatiche umane. Abbiamo adottato un protocollo di isolamento microfluidico a singola cellula basato sulle goccioline e analisi dei dati per studiare le isole umane. Il nostro protocollo ha prodotto con successo dati di sequenziamento dell'RNA da oltre 20.000 singole cellule di istolette umane con variazioni relativamente piccole nella qualità...

Le isole pancreatiche rilasciano ormoni endocrini per regolare i livelli di glucosio nel sangue. Cinque tipi di cellule endocrine, che differiscono dal punto di vista funzionale e morfologico, sono coinvolte in questo ruolo essenziale: le cellule z-cellule producono glucagone, insulina a cellule z, somatostatina -cellule del PP, polipeptide pancreatica delle cellule PP e ghrelina di cellule sè1. La profilazione dell'espressione genica è un approccio utile per caratterizzare le cellule endocrine in condizioni normali o specifiche. Storicamente, la profilazione dell'espressione genica dell'intero islet è stata generata utilizzando il sequenziamento dell'RNA di microarray e di nuova generazione2,3,4,5,6,7 , 8. Sebbene l'intero trascrittoma dell'isolotto sia informativo per identificare le trascrizioni specifiche dell'organo e i geni candidati alla malattia, non riesce a scoprire l'eterogeneità molecolare di ogni tipo di cellula issolata. La tecnica della microdissection laser di cattura (LCM) èstata applicata per ottenere direttamente tipi di cellule specifici dalle isole 9,10,11,12 ma non è al di sotto della purezza della cellula mirata popolazione. Per superare queste limitazioni, lo smistamento delle cellule attivato dalla fluorescenza (FACS) è stato utilizzato per selezionare specifiche popolazioni di cellule endocrine, come le cellule di z e z13,14,15,16 , 17 mi lato , 18.Inoltre, Dorrell et al. ha utilizzato un approccio di selezione FACS basato su anticorpi per classificare le cellule z in quattro sottopopolazioni19. Le cellule di isolotto in ordine FACS possono anche essere placcate per il sequenziamento dell'RNA di singole cellule; tuttavia, i metodi a piastre devono affrontare sfide di scalabilità20,21,22.
Per generare dati trascrittoma di alta qualità e su larga scala di ogni tipo di cellula endocrina, abbiamo applicato la tecnologia microfluidica alle cellule delle istome umane. La piattaforma microfluidica genera dati trascrittomi da un gran numero di singole cellule in modo ad alta velocità effettiva, alta qualità e scalabile23,24,25,26,27. Oltre a rivelare le caratteristiche molecolari di un tipo di cellula catturate in una grande quantità, la piattaforma microfluidica altamente scalabile consente l'identificazione di tipi di cellule rare quando vengono fornite abbastanza cellule. Quindi, l'applicazione della piattaforma alle isole pancreatiche umane ha permesso la profilazione di cellule sseriforanti, un raro tipo di cellula endocrina con funzione poco conosciuta a causa della sua scarsità28. Negli ultimi anni, diversi studi sono stati pubblicati da noi e altri riportano dati trascrittomi su larga scala di isole umane utilizzando la tecnologia29,30,31,32, 33. I dati sono disponibili al pubblico e risorse utili per la comunità delle isolotto per studiare l'eterogeneità delle cellule endocrine e le sue implicazioni nelle malattie.
In questo caso, descriviamo un protocollo di sequenziamento dell'RNA microfluidico a celle microfluidico basato sulle goccioline, che è stato utilizzato per produrre dati trascrittomi di circa 20.000 cellule di isole umane, tra cui 32. Il flusso di lavoro inizia con isolotti umani isolati e illustra i passaggi di dissociazione delle isolotti, acquisizione di una singola cella e analisi dei dati. Il protocollo richiede l'uso di isolotti appena isolati e può essere applicato alle isole provenienti da esseri umani e altre specie, come i roditori. Utilizzando questo flusso di lavoro, è possibile costruire atlas imparziale e completo delle celle isolotto e completo in condizioni di base e altre condizioni.

<table><tbody><tr><td>30 &micro; m Filtri di pre-separazione</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>Filtro cellulare</td></tr><tr><td>Vetrini a 8 camere</td><td>Chemometec</td><td>102673-680</td><td>Vetrini per saggi di conteggio Dell</td></tr><tr><td>Bioanalyzer Kit DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>per il controllo qualità</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Terreno a cellula singola</td></tr><tr><td>Cromo a cellula singola 3' Libreria & Kit di perline in gel v2, 16 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120237</td><td>Reagenti a cellula singola</td></tr><tr><td>Kit di chip A a cellula singola di cromo v2, 48 rx (6 chip)</td><td>10X Genomics</td><td>120236</td><td>Chip microfluidici</td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>ThermoFisher</td><td>11530-037</td> Terreno <td>di coltura completo</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>Tampone di eluizione</td></tr><tr><td>Eppendorf twin-tec PCR plate, 96 pozzetti, blu, semi-bordatura</td><td>VWR</td><td>47744-112</td><td>Piastra di emulsione</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-036</td><td>Terreni insulari completi</td></tr><tr><td>Isolotti umani</td><td>Prodo Labs</td><td>HIR</td><td>Isolotti umani isolati</td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>Terreno isolato completo per isolotti</td></tr><tr><td>Nextera Kit di preparazione della libreria DNA (96 campioni)</td><td>Libreria Illumina</td><td>FC-121-1031</td><td> reagenti di preparazione</td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 Kit ad alto rendimento v2.5 (75 cicli)</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2005</td><td>Sequenziamento</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Terreno completo per le isole Qubit</td></tr><tr><td>Kit dsDNA ad alta sensibilità</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>per la soluzione QC</td></tr><tr><td>18</td><td>Chemometec</td><td>103011-420</td><td>Saggio di conteggio delle cellule reagente</td></tr><tr><td>SPRISelect Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>B23318</td><td>Perle di purificazione</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali (10 cm)</td><td>VWR</td><td>10861-594</td><td>per coltura di isole</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Life Technologies</td><td>12604-013</td><td>Soluzione di dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Zymo DNA Clean & Concentratore-5, 50 reazioni</td><td>VWR</td><td>77001-152</td><td>Colonne per la pulizia della libreria</td></tr></tbody></table>

sequenziamento dell'rna a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Le isole pancreatiche comprendono cellule endocrine con modelli distintivi di espressione ormonale. Le cellule endocrine mostrano differenze funzionali in risposta a condizioni normali e patologiche. L'obiettivo di questo protocollo è quello di generare dati transcriptome di alta qualità e su larga scala di ogni tipo di cellula endocrina con l'uso di una tecnologia di sequenziamento di RNA microfluidico a celle singola basata su goccia. Tali dati possono essere utilizzati per costruire il profilo di espressione genica di ogni tipo di cellula endocrina in condizioni normali o specifiche. Il processo richiede un'attenta maneggevolezza, una misurazione accurata e un rigoroso controllo di qualità. In questo protocollo vengono descritti i passaggi dettagliati per la dissociazione, il sequenziamento e l'analisi dei dati delle isole pancreatiche umane. I risultati rappresentativi di circa 20.000 cellule di isolotto umano dimostrano il successo dell'applicazione del protocollo.

Il flusso di lavoro di sequenziamento dell'RNA a cella singola è costituito da tre passaggi: dissociare le isole umane intatte in sospensione a singola cellula, acquisire singole cellule utilizzando una tecnologia basata su goccia e analizzare i dati RNA-seq (Figura 1). In primo luogo, le isole umane acquisite sono state incubate durante la notte. Gli isolotti intatti sono stati esaminati al microscopio (Figura 2A). L'integrità d...

Qui, presentiamo un protocollo per generare dati trascrittomi su larga scala di alta qualità e su larga scala di singole cellule da isole pancreatiche umane isolate utilizzando una tecnologia di sequenziamento di RNA microfluidico a celle a goccia.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Questo protocollo genera dati di trascrizione ad alta velocità effettiva delle singole cellule isolotti umane, che possono essere utilizzati per studiare l'eterogeneità delle cellule anocrome, identificare il tipo di cellule rare e la regolazione genica nelle malattie. Questa tecnica genera dati a cella singola su larga scala, è facile da usare e ha tempi di elaborazione abbastanza brevi. Questo metodo può essere applicato agli isolotti di altre specie e per profilare altri tessuti appena isolati.Tuttavia, il protocollo deve essere ottimizzato per adattarsi alle procedure di dissociazione specifiche dei tessuti. È fondamentale preparare cellule dissociate di alta qualità. Qc della sospensione cellulare prima del partizionamento a cella singola è fondamentale, così come la gestione dell'emulsione con attenzione e rapidità.Alcuni checkpoint di qualità come sapere se un chip si è intasato sono meglio visti che letti. Dopo aver ottenuto isolotti umani e aver incubato durante la notte, contare e fare un passo da 200 a 300 isolotti utilizzando una pipetta P200. Trasferire gli isolotti in un tubo conico di 15 millimetri contenente cinque millimetri di supporto isolotto completo, preri war

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Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (I parte: la digestione e la raccolta di tessuto pancreatico) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

Metodi computer-assistita romanzo di grandi appalti e l'analisi di campioni di pancreas immunoistochimiche colorati sono descritte: (1) l'acquisizione di Virtual Fetta di tutta la sezione, (2) analisi di massa di dati su larga scala, (3) Ricostruzione di sezioni 2D virtuale , (4) la mappatura delle isole 3D, e (5) Analisi Matematica.

Assistita da computer su larga scala di visualizzazione e quantificazione della Messa di isole pancreatiche, distribuzione delle dimensioni e architettura

Microdissezione laser è una tecnica che consente il recupero di cellule scelte da piccole quantità di parenchima. Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici da utilizzare per gli studi di trascrittomica. Il nostro protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro collezione.

Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Ex vivo dell'isolotto pancreatico studi sono importanti per la ricerca sul diabete. Le tecniche esistenti per studiare isolotti coltivati nella loro architettura 3-dimensionale nativo sono che richiede tempo, inefficiente e utilizzati raramente. Questo lavoro descrive un metodo nuovo, semplice ed efficiente per la generazione di sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti tutta coltivati.

Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Descriviamo un metodo per l'isolamento di cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale, seguite dal sequenziamento di RNA di cella singola. Questo metodo consente analisi dello sviluppo del pancreas endocrino lignaggio, eterogeneità e trascrittomica dinamiche di cella.

Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse

Questo protocollo delinea un metodo per l'analisi quantitativa della formazione complessa di proteine mitopagia specificamente nelle cellule beta da campioni di isolotto umano primario. Questa tecnica consente quindi l'analisi della mitofagia da materiale biologico limitato, che sono cruciali nei preziosi campioni di cellule beta pancreatiche umane.

Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

In questo protocollo, le isole pancreatiche vengono ricostruite e analizzate utilizzando algoritmi computazionali implementati in un'applicazione multipiattaforma dedicata.

Ricostruzione computazionale delle isole pancreatiche come strumento per l'analisi strutturale e funzionale

Le cellule metaplastiche pancreatiche sono precursori di cellule maligne che danno origine ai tumori pancreatici. Tuttavia, isolare le cellule pancreatiche vitali intatte è difficile. Qui presentiamo un metodo efficiente per la dissociazione del tessuto pancreatico. Le cellule possono quindi essere utilizzate per il sequenziamento di RNA a singola cellula (scRNA-seq) o per la co-coltura bi- o tridimensionale.

Dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali

Questo protocollo descrive un metodo per l'acquisizione sincrona e la co-registrazione di eventi di segnalazione intracellulare e la secrezione di insulina e glucagone da parte di pseudoisole umane primarie utilizzando la somministrazione adenovirale di un biosensore ciclico di adenosina monofosfato (cAMP), un rivelatore di differenza di cAMP in situ (cADDis) e un sistema di microperifusione.

Sistema di pseudoisole umane per la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali

Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule endoteliali di topo dall'intero pancreas.

Isolamento delle cellule endoteliali pancreatiche di topo

Questo protocollo descrive le procedure per isolare nuclei di alta qualità da isole pancreatiche congelate di primati non umani per l'uso nel sequenziamento simultaneo di RNA a singolo nucleo e nel sequenziamento ATAC, preservando la frazione citosolica di massa per le analisi metabolomiche dagli stessi campioni.

Preparazione di isole fetali di primati non umani congelate per il sequenziamento combinato di RNA a nuclei singoli e il sequenziamento ATAC e la metabolomica di massa

Scopri il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per studiare l'eterogeneità cellulare e la regolazione genica nelle isole pancreatiche umane. Questo metodo ad alta portata identifica tipi cellulari rari.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

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