Piattaforma di manipolazione cellulare integrata accoppiata con la sonda singola per l'analisi della spettrometria di massa di farmaci e metaboliti in singole cellule di sospensione

Poiché questo metodo analizza le cellule dalla soluzione, può essere utilizzato per studiare le cellule in un ambiente quasi nativo. Ciò include l'analisi dei campioni di cellule derivate dal paziente. Questa tecnica richiede poca o nessuna preparazione del campione di cellule.

Pertanto, possiamo analizzare singole cellule online in condizioni ambientali, il che ci consente di esplorare l'eterogeneità cellulare. Questa tecnica può essere applicata per studiare biopsie liquide da una varietà di stati di malattia diversi, poiché può analizzare diversi tipi di cellule direttamente isolate dai campioni del paziente. Per convertire i tubi di vetro a foro singolo in una sonda affusolata con una punta affilata, posizionare innanzitutto un singolo tubo di vetro di foro nei morsetti di un supporto di pipetta verticale, centrando il vetro rispetto alla bobina di riscaldamento e stringere per fissare il tubo in posizione.

La bobina di riscaldamento è composta da un filo di resistenza al cromo di nichel calibro 18 arrotolato attorno a un'asta metallica 2,5 volte. Impostare il tubo di vetro con programma di temperatura 19.5. Impostare il pistone solenoide alle quattro.

Attiva il solenoide per premere i tubi di vetro. Questo passaggio crea due sonde fuse sulla punta. Utilizzare i maglioni per tagliare a circa un millimetro di distanza dalla punta di ogni sonda, creando un orifizio di circa 10 micron di diametro sulla punta della sonda.

Per piegare la sonda di vetro per un facile accoppiamento all'ICMP, è necessario impostare SCMS a sonda singola. Per prima cosa impostare una sonda di vetro tirata nella microforgia. Posizionare la parte superiore di circa tre millimetri sopra il filo riscaldante in platino.

Quindi, ruotare il calore sul filo di platino al 30% della temperatura massima. Piegare la sonda a circa 45 gradi dalla posizione originale. Posizionare il microscopio invertito in due sistemi di manipolazione cellulare su un tavolo motorizzato per un facile accoppiamento con lo spettrometro di massa.

Per impostare il dispositivo di selezione della cella di vetro, inserire la sonda di selezione della cella di vetro all'interno del supporto metallico del microiniettore posizionando il lungo scivolo nel supporto capillare e stringendo la vite per fissare la sonda in posizione. Posizionare le punte della sonda angolate parallelamente alla piastra riscaldata. Fissare il supporto metallico del micro iniettore nel sistema di manipolazione cellulare.

Quindi posizionare la punta della sonda vicino al centro della luce del microscopio invertita. Fissare lo scivolo di vetro contenente la singola sonda nel morsetto del braccio del sistema di manipolazione cellulare. Collegare il solvente fornendo capillare a un'unione conduttiva posizionando il capillare nel manicotto del ferrule plastico e stringendo il raccordo.

Collegare l'altro lato dell'unione conduttiva a un capillare collegato a una siringa contenente il solvente di campionamento posizionando il capillare nel manicotto e stringendo il raccordo. Utilizzare acetonitrile con acido formico allo 0,1% come solvente di campionamento in questi esperimenti. Fissare la siringa nella pompa della siringa sullo spettrometro di massa.

Posizionare la ionizzazione nanoelettrospray o l'emettitore nano ESI di circa un millimetro all'orifizio del tubo di trasferimento ionico esteso. Utilizzare il sistema di manipolazione cellulare per controllare i movimenti spaziale della singola sonda e posizionare l'emettitore nano ESI centralmente di fronte al tubo di trasferimento ionica esteso. Pipettare le cellule dal pallone di coltura cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.

Ruotare le cellule a 400 volte G in 37 gradi Celsius per cinque minuti e scartare il supernatante. Resuspend le cellule in quattro millilitri di mezzo RPMI contenente il composto farmacologico alla concentrazione di trattamento desiderata. Personalizzare i parametri sperimentali per lo spettrometro di massa.

Sotto l'intestazione della modalità di scansione del software dello strumento, selezionare definisci scansione. Utilizzare una risoluzione di 60.000 m su Z 400, un microscan 100 millisecondo di tempo massimo di iniezione e il controllo automatico del guadagno. Sotto la pompa della siringa, selezionare la portata di 150 nanolitri al minuto.

Selezionare la sorgente NSI e applicare una tensione di circa 4,5 kilovolt. Accendere il microscopio invertito a 40 volte l'ingrandimento selezionato sia per la piastra superiore che per l'obiettivo inferiore. Collegalo alla porta USB di un laptop per acquisire feed video in diretta.

Accendere la piastra riscaldata e impostarla a 37 gradi Celsius. Nel computer, passare alla scheda acquisisci dati e selezionare continuamente sotto il tempo acquisito. Per preparare il campione per l'analisi, pipettare da due a tre del campione nel coperchio di una piccola piastra di Petri.

Posizionare il campione al centro della luce dal microscopio invertito sopra la piastra riscaldata. Preparare la sonda di selezione delle celle di vetro per l'analisi. Utilizzare il sistema di manipolazione cellulare per spostare la sonda in modo che la parte superiore sia focalizzata sotto la microcsope invertita nello stesso piano delle celle.

Utilizzate il sistema di manipolazione delle celle per spostare la punta della sonda di selezione delle celle in una cella di destinazione per l'analisi. Questo processo viene monitorato utilizzando il microscopio invertito. Ruotare delicatamente la maniglia del microiniettore per regolare la posizione dell'olio minerale all'interno del tubo.

Un'aspirazione delicata è fornita dal microiniettore per fissare la cella di destinazione alla punta della sonda di selezione cellulare. Utilizzare il sistema di manipolazione delle celle per spostare la cella nella punta della sonda di selezione delle celle sulla punta della sonda singola utilizzando un microscopio digitale focalizzato sulla punta della singola sonda per monitorare questo processo. Le cellule K-562 non trattate vengono utilizzate per stabilire il metodo sperimentale.

In un tipico esperimento SCMS, evidenti cambiamenti di spettri di massa possono essere osservati dal trasferimento di una cellula durante il rilevamento del contenuto cellulare e dopo aver terminato la misurazione. Tre picchi lipidici cellulari comuni tra cui PC 34:4, PC 36:4 e PC 38:5 vengono monitorati per garantire che la cellula venga trasferita correttamente e che il contenuto cellulare venga rilevato. L'identità di molti PC nell'intervallo di massa da 750 a 850 è confermata utilizzando MSMS su campioni di lisato cellulare non trattato.

Utilizzando l'ICMP single probe MS set up, Gemcitabine, Taxol e OSW1 sono stati rilevati dopo l'incubazione con cellule K-562. Questi risultati suggeriscono che questo metodo può essere utilizzato per studiare lipidi intracellulari, farmaci e metaboliti a livello di singola cellula dalle cellule in soluzione in un ambiente quasi nativo. Ricordarsi di posizionare in modo sicuro la sonda di selezione della cella di vetro nel supporto della pipetta universale in modo che l'aspirazione possa essere applicata in modo adeguato.

Questo metodo può anche essere applicato a campioni derivati dal paziente per distinguere le differenze tra i metaboliti cellulari da una varietà di tipi di cellule, il che ci consente di ottenere una migliore comprensione di questi stati di malattia. Dopo aver sviluppato questo metodo, potremmo potenzialmente implementare la quantificazione dei composti farmaceutici a livello di singola cellula. Quando si lavora con le cellule, è importante avere dispositivi di protezione individuale appropriati tra cui camice da laboratorio e guanti.

Un'ulteriore usura degli occhi può essere utilizzata quando si lavora con il vetro.