Preparazione e caratterizzazione dei nanoliposomi per l'entratura delle proteine globulari bioattive
31 agosto 2019
Questo studio descrive l'idratazione classica usando il metodo della pellicola lipidica sottile per la preparazione dei nanoliposomi seguito dalla caratterizzazione delle nanoparticelle. Una proteina clada e globulare k7 kDa-idrofilo, il tarino, è incapsulata con successo come strategia per migliorare la stabilità, evitare la clearance veloce e promuovere il rilascio controllato. Il metodo può essere adattato all'incapsulamento delle molecole idrofobiche.
Sarà dimostrata la preparazione di nanocapsule liposomiche con una tecnica di estrusione passo dopo passo nell'intrappolamento della tarina 48 kilodalton globulari nella proteina idrofila purificata dalla colocasia esculenta. Tutte le procedure per la caratterizzazione delle nanocapsule includono la microscopia elettronica a scansione e verrà seguito anche lo scattering dinamico della luce. Le procedure di capsulazione possono affrontare alcune sfide dalla scelta dei lipidi al raggiungimento dell'incapsulamento ad alta efficienza, mantenendo la bio attività delle molecole intrappolate.
Il protocollo che verrà descritto può superare alcune di queste difficoltà. Pesare i componenti liposomi usando un equilibrio analitico. Sciogliere i componenti lipidici in cloroformio utilizzando un pallone volumetrico che si inserisce in un evaporatore rotante per evitare la perdita di materiale.
Mescolare la miscela a 150 giri/min per 15 minuti. Rimuovere il cloroformio utilizzando un evaporatore rotante. Regolare la bocca del pallone volumetrico nella posizione standard per la migliore efficienza, mentre si è a contatto con l'acqua del bagno di riscaldamento.
Impostare i parametri in base al protocollo descritto. Dopo circa 25 minuti, rimuovere il pallone e scartare il solvente evaporato in modo appropriato. Si forma un film sottile e opaco che può essere facilmente visualizzato.
Idratare il film lipidico in una soluzione di solfato di ammonio contenente tarina a un milligrammo per millilitro. Mescolare la miscela per 40 minuti e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi, sonicare la sospensione per un minuto a 25 gradi Celsius, temperatura ambiente.
Per ridurre le dimensioni della vescicola ed evitare l'aggregazione, posizionare la membrana in policarbonato tra due supporti filtranti pre-bagnati e posizionarla nel supporto. Inserire una siringa vuota nel dispositivo, riempire l'altra con un millilitro della sospensione liposomiale e inserirla sul lato opposto. Eseguire un'estrusione a 12 cicli attraverso una membrana dei pori in policarbonato da 2 micrometri.
Spingere lentamente il campione da una siringa all'altra. Alla fine, la sospensione liposomiale dovrebbe diventare chiara durante il processo di escursione, a causa della riduzione delle dimensioni. Circa 2 millilitri del campione possono essere persi durante questo passaggio.
Separare i liposomi con l'ultracentrifugazione. In primo luogo, pesare il campione nel tubo di titanio ed equilibrare i tubi. Controllare il volume minimo da riempire e, se necessario, regolare il volume con solfato di ammonio.
Inserire i tubi in titanio nel secchio oscillante. Aprire la porta della centrifuga e posizionare il rotore all'interno. Chiudere la porta della centrifuga, premere il vuoto e attendere che il vuoto raggiunga da 200 a meno di 20 micron.
Regolare i parametri nel display ultracentrifugo. Premere il richiamo, controllare le condizioni e avviare l'esecuzione. Dopo 90 minuti, rilasciare il vuoto facendo clic sul pulsante del vuoto e aprire la porta della centrifuga.
Rimuovere il rotore dall'interno. Mantenere il campione di ultracentrifugo sul ghiaccio e quindi separare il supernatante dal pellet, capovolgendo il tubo, in una centrifuga monouso da 59 mil per separare il supernatante dal pellet. Conservare il supernatante contenente la proteina non incapsulata a quattro gradi Celsius.
Questo verrà utilizzato per determinare l'efficienza di incapsulamento. Il pellet è presentato come una gelatina traslucida. Sospendere il pellet e riscaldare la soluzione salina tamponata HEPES.
Si prega di controllare il protocollo per ulteriori informazioni. Determinare l'efficienza di incapsulamento secondo il protocollo di Peterson, al fine di evitare interferenze lipidiche nella quantificazione delle proteine. I campioni devono essere analizzati in triplice copia.
In un tubo di microfugo, diluire il supernatante lipsomale o BSA a un milligrammo per millilitro con acqua a un volume finale di un millilitro. Aggiungere DOC e incubare per 10 minuti. Aggiungere 1 millilitro di 72%TCA e mescolare bene.
Centrifuga a 3.000 g per 15 minuti a temperatura ambiente. Scartare con cura il supernatante evitando il tubo verso il basso, posarlo su una carta assorbente e lasciarlo asciugare. Sospendere il pellet in un millilitro d'acqua.
Mescolare accuratamente per assicurarsi che il pellet sia sciolto. Quindi, trasferire il campione in provette. Aggiungere un millilitro di reagente A, mescolare e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Aggiungere 5 millilitri di reagente B, mescolare e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Determinare l'assorbanza a 750 nanometri e calcolare l'efficienza di incapsulamento. La media delle dimensioni e la distribuzione delle dimensioni sono determinate dallo scattering dinamico della luce.
Trasferire le nanovesicelle liposomiche in una cuvetta di dimensionamento usa e getta. Inserire la cuvetta all'interno dell'attrezzatura. Impostare i parametri dell'apparecchiatura.
Per la determinazione della stabilità, conservare i liposomi a quattro gradi Celsius e controllare regolarmente la distribuzione delle dimensioni e la media delle dimensioni. La caratterizzazione liposoma mediante microscopio elettronico a scansione viene eseguita secondo Murta e Ramasamy in triplice copia. Fissare il coperchio di vetro scivola nella parte inferiore di una piastra di Petri con un nastro adesivo.
Rivestire i foglietti di copertura con Poli-L-lisina. Posizionare una carta da filtro bagnata all'interno della piastra di Petri per mantenere l'umidità e incubare per un'ora. Risciacquare con acqua distillata.
Aggiungere una goccia del campione e lasciarlo asciugare per un'ora, a temperatura ambiente. Per fissare i campioni, coprirli con glutaraldeide, preparati in tampone fosfato. Posizionare le carte filtranti bagnate all'interno della piastra di Petri.
È importante sigillare la piastra di Petri. Incubare a quattro gradi Celsius per 48 ore. Risciacquare il coperchio scivola tre volte per cinque minuti ciascuno, con lo stesso tampone fosfato.
Disidratare i campioni come segue lavando in una soluzione crescente di concentrazione di etanolo dal 35% all'etanolo assoluto. Asciugare chimicamente i campioni con esametildisilazane per 10 minuti. L'esametildisilazane deve essere accuratamente manipolato all'interno di un cappuccio dei fumi.
I campioni devono potersi asciugare durante la notte all'interno di un essiccatore o all'interno della cappa dei fumi a temperatura ambiente. Montare i campioni essiccati su uno stub, con un nastro adesivo conduttivo in carbonio. Sputter gli stub con l'oro.
Registra immagini SEM con un microscopio elettronico a scansione, SEM, a bassa modalità vuoto e bassa tensione, 20 kilovolt. La figura uno descrive la preparazione del nano liposoma. Fosfolipidi, droga, piolo e chemi, i principali costituenti liposomi, furono prima sciolti in cloroformio per ottenere il film lipidico.
Il film lipidico è stato quindi reidratato in un tampone salino, contenente la proteina idrofila, la tarina, da intrappolare, e l'incubazione deve essere preformata durante la notte. Quindi, la sonicazione e l'estrusione vengono applicate per generare piccole vescicole unilamellari. La fase di ultracentrifugazione separa la preparazione liposomiale dai lipidi liberi e dalle proteine non incapsulate.
Mentre il supernatante viene utilizzato per la determinazione dell'efficienza dell'intrappolamento. I nanoliposomi prodotti utilizzando la suddetta metodologia mostrano una distribuzione delle dimensioni che va da 51 a 396 nanometri e una dimensione media di 155 nanometri. La preparazione è omogenea, poiché l'indice di polidispersità è di 168.
Un'elevata efficienza di intrappolamento dell'83% viene raggiunta se i liposomi vengono estrusi attraverso una membrana di dimensioni dei pori di 2 micrometri. Le caratteristiche morfologiche del nanoliposoma sono state valutate mediante microscopia elettronica a scansione. I liposomi dovrebbero essere trattati in modo simile alle cellule viventi, per ottenere immagini di migliore qualità.
Le procedure di fissazione e asciugatura sono importanti per garantire la visualizzazione di vescicole intatte più piccole che supportano oltre 20 kilovolt in condizioni di vuoto. Le figure 2A e 2B mostrano vescicole liposomiche a forma rotonda nell'intervallo di 121 nanometri, analizzate a 20 kilovolt. Mentre le figure 2C e 2D, mostrano campioni preparati in modo inadeguato.
I campioni maltrattati consentivano solo l'osservazione di vescicole più grandi e o danneggiate, che non possono resistere alle condizioni di vuoto e o tensione. Il protocollo descritto, qui in, consentiva la produzione di vescicole riproducibili che mostravano una forma rotonda, una superficie piccola e una dimensione media di circa 150 nanometri. Il metodo può essere utilizzato per intrappolare molecole complesse e grandi, come proteina tetramerica, esibendo un correttore idrofilo.
L'auto intrappolamento carente è superiore all'80% e il tasso di perdita è molto basso, inferiore all'1,5% Quando le nanocapsule sono conservate a quattro gradi Celsius. Speriamo che questo video vi aiuti nell'incapsulamento di grandi molecole, come il teri.
Panoramica
Questo studio illustra la preparazione di nanocapsule liposomiali che incapsulano la proteina idrofila tarina mediante il metodo del film lipidico sottile. L'incapsulamento ha lo scopo di migliorare la stabilità, controllare il rilascio e affrontare le difficoltà nel raggiungere un'elevata efficienza di incapsulamento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Nanotecnologia
- Biotecnologia
- Scienze farmaceutiche
Sfondo
- Le nanocapsule liposomiali sono utilizzate per il rilascio di farmaci.
- L'incapsulamento di proteine può migliorarne la stabilità e la biodisponibilità.
- Le sfide includono la selezione dei lipidi e il mantenimento dell'attività biologica.
- La diffusione dinamica della luce e la microscopia elettronica a scansione sono tecniche fondamentali per la caratterizzazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per incapsulare la tarina in nanocapsule liposomiali.
- Migliorare la stabilità e il rilascio controllato di proteine idrofile.
- Fornire un protocollo che affronti le sfide comuni nella preparazione dei liposomi.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di liposomi mediante tecnica di estrusione.
- Caratterizzazione mediante scattering dinamico della luce e microscopia elettronica a scansione.
- L'efficienza di incapsulamento determinata utilizzando il protocollo di Peterson.
- Ultracentrifugazione per separare i liposomi dalle proteine non incapsulate.
Risultati principali
- È stata raggiunta un'incapsulazione efficace del tarin.
- La caratterizzazione ha confermato le dimensioni e la stabilità dei liposomi.
- Il metodo ha dimostrato un'elevata efficienza di incapsulamento.
- Le difficoltà nella selezione dei lipidi sono state affrontate in modo efficace.
Conclusioni
- Il metodo del film lipidico sottile è efficace per la preparazione di nanocapsule liposomiali.
- L'incapsulamento di proteine idrofile può potenziarne il potenziale terapeutico.
- Questo protocollo può essere adattato per altre molecole idrofobe.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'incapsulamento di proteine idrofile in nanoliposomi affronta sfide fondamentali nella somministrazione di prodotti biologici, tra cui stabilità, biodisponibilità e rilascio controllato. Questo metodo supporta la validazione precoce del bersaglio consentendo una formulazione riproducibile di biomolecole complesse per saggi funzionali. L'elevata efficienza di incapsulamento e la bassa velocità di fuoriuscita migliorano l'affidabilità predittiva nei percorsi di sviluppo preclinico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della funzione proteica in un ambiente protetto e biomimetico per chiarire i meccanismi del bersaglio.
- Valore operativo: Fornisce nanovesicole standardizzate per condizioni di saggio costanti tra diversi gruppi di ricerca.
- Valore predittivo: Riduce l'ambiguità meccanicistica mantenendo la bioattività proteica durante l'incapsulamento e lo stoccaggio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera vescicole di dimensioni nanometriche uniformi (dimensione media di 155 nm, PDI 0,168) adatte a piattaforme di screening ad alto rendimento.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità attraverso passaggi di estrusione e ultracentrifugazione che minimizzano la variabilità tra i lotti.
- Prontezza per saggi: Facilita la preparazione di sistemi stabili per l'interazione ligando-recettore mediante proteine globulari intrappolate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Favorisce il passaggio dalla fase di scoperta a quella preclinica mantenendo l'integrità strutturale delle proteine tetrameriche.
- Contenimento del rischio: Un basso tasso di fuoriuscita (<1,5% a 4°C) consente una modellizzazione affidabile della farmacocinetica e della biodistribuzione.
- Ponte formulativo: Offre una piattaforma di nanoveicoli scalabile e adattabile ad altri biologici idrofili.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'ottimizzazione del capostazione fino alla formulazione preclinica, in particolare per proteine idrofile che richiedono stabilizzazione.
- Biologia della scoperta: Consente il test funzionale di lectine e proteine globulari intrappolate in studi di chiarimento dei percorsi metabolici.
- Screening: Fornisce nanoliposomi monodispersi adatti a saggi basati sulla fluorescenza o su legame che richiedono dimensioni uniformi delle particelle.
- Analisi: Utilizza la diffusione dinamica della luce per la distribuzione dimensionale quantitativa e l'efficienza di incapsulamento tramite il protocollo di Peterson per una quantificazione accurata.
- Ricerca traslazionale: Mantiene l'integrità delle proteine attraverso estrusione delicata e conservazione a freddo, supportando modelli preclinici allineati ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo operativo standardizzato riproducibile per l'incapsulamento liposomiale applicabile a diversi bersagli proteici e progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Un'elevata efficienza di incapsulamento (83%) e una bassa fuoriuscita migliorano l'affidabilità dei dati negli studi di interazione con il bersaglio.
- Valore operativo: L'idratazione standardizzata del film lipidico e l'estruzione permettono una produzione scalabile e adattabile alle buone pratiche di produzione (GMP).
- Valore strategico: Riduce l'abbandono dei candidati de-riuscendo le sfide formulative in una fase precoce del percorso di scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei candidati proteici basata sulla sviluppabilità e sulla fattibilità formulativa, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di manipolazione dei lipidi, sonificazione, estrusione e ultracentrifugazione.
- È subordinato all'accesso a un evaporatore rotante, un estrusore con membrane in policarbonato, DLS, SEM e un'ultracentrifuga.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo ai rapporti lipidici, ai tamponi di idratazione e ai cicli di estrusione per garantire la riproducibilità.
- L'adattamento ad altri modelli richiede un'ottimizzazione della composizione lipidica e della concentrazione di carico proteico.
- I limiti pratici includono le possibili interazioni tra lipidi e proteine e la necessità di analisi triplicate per assicurare l'accuratezza della quantificazione.
