Name: Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Impara a coltivare fette ex vivo da embrioni di topo GFP per l'imaging time-lapse della crescita del nervo oculomotore. Questo metodo preserva i microambienti locali e consente di studiare le vie di guida assonale in tempo reale.

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Finanziamenti forniti dal National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], la Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Grant], e la Children's Hospital Ophthalmology Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE è un investigatore dell'Howard Hughes Medical Institute.

Tutto il lavoro sugli animali qui descritto è stato approvato ed eseguito in conformità con i protocolli del Boston Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Accoppiamenti a tempo
<ol><li>Posizionare ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP)1Slp/J Stock No: 017952) topi maschi e femmine insieme durante la notte. Pesare le femmine e registrare i pesi prima dell'accoppiamento. NOTA: ISLMN:GFP etichetta specificamente i motoneuroni con un GFP farnesillated che non è citotossico, si localizza alla membrana cellulare dei motoneuroni e dei loro assoni e consente di visualizzare i nervi durante lo sviluppo25. Potrebbero essere utilizzate anche altre linee con etichetta fluorescente.</li>
	<li>Verificare la presenza di spine vaginali al mattino presto. La data in cui una spina viene identificata è designata come E0.5.</li>
	<li>Confermare la gravidanza utilizzando l'aumento di peso e/o gli ultrasuoni a E10.5. Le dighe incinte devono aver guadagnato almeno 1 g. Gli embrioni possono essere visti con ultrasuoni a E10.5.</li>
</ol>2. Preparazione di reagenti e vibratome per la coltura della sezione
<ol><li>Preparare 500 mL di tampone di affettare: aggiungere 5 mL di HEPES e 5 mL di penicillina/streptomicina a 500 mL di Soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS) senza Ca2 e Mg2.  Raffreddare a 4 gradi centigradi. NOTA: il buffer di affettatura supplementare deve essere memorizzato a 4 gradi centigradi e può essere utilizzato per futuri esperimenti di coltura delle fette.</li>
	<li>Preparare 50 mL di supporti di coltura: In un cofano sterile, aggiungere 12,5 mL di HBSS, 12,5 mL di siero fetale bovino, 250 litri di glucosio, 250 -L di L-glutammina, 125 l di HEPES a 24,4 mL di Fluorobright DMEM. (concentrazioni finali: FlouroBright DMEM con 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% glucosio, 1 mM glutammina, e 2.5 mM HEPES.).  Riscaldare i mezzi di coltura a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua sterile. NOTA: I supporti di coltura possono essere conservati a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 settimane.<ol>
<li>In un cappuccio sterile, aggiungere 1,5 mL di supporti di coltura ad ogni pozzo di una piastra di 6 pozze.  Aggiungere un inserimento di impostazioni cultura delle celle (Tabella dei materiali) a ogni pozzo.  Mettere in un'incubatrice sterile di 37 e 5% di CO 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare il 4% di agarose a bassa temperatura di fusione: sciogliere 2 g di agarose a bassa temperatura di fusione in 50 mL di PBS sterile. Microonde a intervalli di 30-60 s fino a completa dissoluzione. Mettere in un bagno d'acqua a 40 gradi centigradi per mantenere il liquido. NOTA: l'agarose extra può essere conservato a temperatura ambiente (RT) e fuso per futuri esperimenti di coltura delle fette.</li>
	<li>Set up vibratome: Posiziona una nuova lama sul vibratome. Controllare le impostazioni: spessore 400-450 m. Pre-raffreddare lo stadio vibratoma. Mettere del ghiaccio nella camera esterna. Utilizzare una camera e un palco dedicati alle fette vive. Non utilizzare la stessa camera vibratoma per il tessuto fisso in quanto il fissativo residuo potrebbe danneggiare le fette.</li>
	<li>Preparare l'incubatrice superiore dello stadio al microscopioa 37 gradi centigradi e al 5% di CO 2.</li>
	<li>Preparare la dissezione: Pulire gli strumenti chirurgici e spruzzare con 70% etanolo. Riempire due piatti Petri con HBSS, posto sul ghiaccio. Aprire una piastra di coltura del tessuto 12 pozzo e posizionare il coperchio sul ghiaccio con la parte inferiore rivolta verso l'alto. Aprire una piastra di coltura dei tessuti a 6 pozze e posizionare inserti di membrana di coltura cellulare e 1,5 mL di coltura cellulare in ogni pozzo. Preriscaldare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi centigradi e al 5% di CO 2.</li>
</ol>3. Raccogliere embrioni E10.5 e preparare fette
NOTA: Tutti i passaggi da questo punto devono essere eseguiti il più rapidamente possibile. Mantenere gli embrioni sempre sul ghiaccio.
<ol><li>Eutanasia la diga incinta (E10.5) in una camera DI CO2. Eseguire lussazione cervicale.</li>
	<li>Spruzzare l'addome con il 70% di etanolo. Tagliare l'addome con le forbici, rimuovere l'utero e metterlo in una teglia Petri con HBSS ghiacciato per lavare rapidamente via il sangue. Spostare l'utero lavato in un secondo Petri riempito con piatto ghiaccio freddo HBSS.</li>
	<li>Sotto un ambito di dissezione, rimuovere gli embrioni dal corno uterino e sacche amniotiche individuali. Posizionare gli embrioni sulla parte inferiore del coperchio di una piastra di 12 pozze. Tieniti sul ghiaccio.</li>
	<li>Sotto un ambito di dissezione, utilizzare la carta da filtro per rimuovere qualsiasi liquido che circonda ogni embrione. NOTA: Gli embrioni si attaccano alla carta da filtro se toccati.</li>
	<li>Incorporare gli embrioni in agarose. Versare l'agarosa sciolta su ogni embrione per coprirlo. Tieniti sul ghiaccio. Non appena l'agarose si è indurita, capovolgere ogni embrione e versare agarose aggiuntive sull'altro lato. Tieniti sul ghiaccio.</li>
	<li>Utilizzando un ambito di dissetazione fluorescente, tagliare l'agarose intorno a ogni embrione in modo che sia orientata correttamente quando incollata allo stadio vibratoma. Il nucleo oculomotore e la rapida escrescenza assonale sono fluorescenti. Allineare l'embrione in modo che il nucleo, gli assoni in crescita e l'occhio formino una linea, e tagliare l'agarose con una lama di rasoio tagliata parallelamente a questa linea (dorsale all'embrione, vedere Figura 1A). NOTA: Questo sarà il lato incollato allo stadio vibratoma (l'embrione sarà posizionato sulla schiena, la testa più vicina alla lama del vibratoma). Una linea tra il nucleo oculomotore e l'occhio deve essere parallela alla lama vibratoma.</li>
	<li>Riempire la camera vibratoma con tampone a fette ghiacciate. Superincollare l'embrione allo stadio vibratoma in modo che la lama sia parallela al nucleo oculomotore e agli occhi. Una volta che la supercolla è asciutta, immergere lo stadio vibratoma in modo che l'embrione sia orientato verso l'allontanamento dalla lama.</li>
	<li>Affettare 400-450 fette di m.  Raccogliere ogni fetta con un pipet di trasferimento sterile. Mettere nel buffer di affettare a freddo.</li>
	<li>Sotto il mirino di dissezione, scegliere la fetta contenente i nuclei oculomotori e gli occhi. Utilizzando un pipet di trasferimento sterile, posizionarlo sul inserto di coltura cellulare nella piastra 6 pozzo. Riportare la piastra all'incubatrice di 37 gradi centigradi. In alternativa, chiedi a una persona di affettare e a un'altra di posizionare le fette. Ridurre al minimo il tempo che intersechi e lo inserimento nell'incubatrice. NOTA: Le fette devono essere orientate in modo che la massima fluorescenza emessa dai nuclei e dagli assoni sia più vicina all'obiettivo del microscopio di imaging. In un microscopio invertito, le fette devono essere posizionate sulla membrana con i nuclei e gli assoni più vicini all'obiettivo sotto la piastra.</li>
	<li>Togliere l'agarose residua dallo stadio vibratoma, superincollare l'embrione successivo allo stadio e ripetere i passaggi 3.7-3.9 fino a quando tutti gli embrioni sono stati affettati e placcati.</li>
	<li>Aggiungere inibitore o molecola ricombinante di scelta ai media in ogni pozzo per creare una curva dose-risposta.  Diluire in un solvente appropriato. NOTA: se si utilizza DMSO, utilizzare solo DMSO di grado di coltura dei tessuti. In alternativa, le perle proteiche possono essere posizionate in posizioni specifiche della fetta.</li>
	<li>Posizionare al microscopio nella camera 37 e 5% CO 2.  Impostare il microscopio per scattare il contrasto di fase e le fotografie fluorescenti di ogni fetta ogni 30 min (o più spesso se lo si desidera). Le fette possono essere mantenute per 48-72 h.</li>
</ol>

<ol><li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+%28CCDDs%29%3A+insights+into+axon+growth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li>
<li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li>
<li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li>
<li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics%2C+kinesin+interactions%2C+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit%2FRobo+repulsion+and+Netrin%2FDCC+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li>
<li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li>
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<li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li>
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<li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li>
<li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li>
<li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li>
<li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li>
<li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li>
<li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+migration+in+neocortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li>
<li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li>
<li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96(2018).</li>
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<li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CXCR4%2FCXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li>
<li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309(2011).</li>
<li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li>
<li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li>
<li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li>
<li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li>
<li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+axon+guidance%3A+are+we+nearly+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo di coltura delle fette ex vivo offre vantaggi significativi rispetto alle tradizionali indicazioni degli assoni23. La dimensione di ogni nucleo motorio cranico non è un fattore limitante, e non è necessaria alcuna dissezione difficile. Il microambiente endogeno attraverso il quale gli assoni viaggiano, consentendo la modifica di un percorso di segnalazione pur mantenendo altri percorsi di segnalazione. Inoltre, gli effetti possono essere valutati in punti diversi lungo la traiett...

Il sistema motore oculare fornisce un elegante sistema per studiare i meccanismi di guida degli assoni. È relativamente semplice, costituito da tre nervi cranici che innervadono sei muscoli extraoculari (EOM) che muovono l'occhio, e la superiorità levatore palpebra (LPS) che solleva la palpebra. Il nervo oculomotore innerva l'LPS e quattro EOM - i muscoli obliqui inferiori e mediali, inferiori e superiori. Gli altri due nervi, il trochlear e l'abducens, ognuno solo innervare un muscolo, il superiore obliquo e muscolo di retto laterale, rispettivamente. I movimenti oculari forniscono una facile lettura, mostrando se l'innervazione era appropriata, mancante o aberranti. Inoltre, ci sono disturbi del movimento dell'occhio umano che derivano da deficit nello sviluppo neuronale o guida assone, collettivamente chiamato i disturbi didisinnervazione cranica congeniti (CCDD)1.
Nonostante questi vantaggi, il sistema motorio oculare è raramente utilizzato negli studi di guida degli assoni2,3,4,5,6,7,8, 9 (in vie , 10, a causa di inconvenienti tecnici. I saggi di guida assoni in vitro hanno molti svantaggi11. I saggi di co-coltura, in cui gli espiante neuronali vengono coltivati insieme agli espianti del tessuto bersaglio12 o delle cellule trasfette13, dipendono sia dalla simmetria dell'espianto che dal posizionamento preciso tra l'espianto e il tessuto bersaglio. I saggi Striscia14,15, in cui due spunti sono disposti a strisce alternate e gli assoni sono valutati per la crescita preferenziale su una striscia, indicano solo che un substrato è preferibile all'altro, non che uno dei due sia attraente o ripugnante, o fisiologicamente rilevante. Le camere microfluidiche possono formare precisi gradienti chimici, ma soggetti a picconi in crescita per inclinare lo stress di taglio16,17,18, che possono influenzare la loro crescita. Inoltre, in ciascuno di questi approcci, la raccolta di espianti o cellule dissociate richiede che gli assoni in crescita in crescita siano assitopi e quindi questi saggi esaminino effettivamente la rigenerazione degli assoni, piuttosto che la crescita iniziale degli assoni. Infine, questi approcci in vitro rimuovono il microambiente che influenza gli assoni e le loro risposte ai segnali lungo diversi punti del loro corso, e tradizionalmente testano solo un segnale in isolamento. A complicare questi svantaggi, le piccole dimensioni di ogni nucleo nel sistema motorio oculare rendono la dissezione tecnicamente difficile per gli espianti o per le colture dissociate. Inoltre, le colture primarie di motoneuroni oculari sono di solito eterogenee, hanno una morte cellulare significativa e dipendono dalla densità, richiedendo il raggruppamento di cellule da embrioni multipli (Ryosuki Fujiki, comunicazione personale). I metodi in vivo, tuttavia, compresi i modelli di topo a foratura, sono inappropriati da utilizzare per lo screening, dati i tempi e le spese richiesti.
Metodi sviluppati per la coltura di embrioni interi19 consentono l'etichettatura delle cellule migratorie20 o il blocco di molecole specifiche21, ma le colture intere embrionali richiedono incubazione in bottiglie a rulli che preclude l'imaging in tempo reale di etichettato Strutture. Sono possibili anche tecniche chirurgiche che consentono la manipolazione dell'embrione e il successivo ulteriore sviluppo sia nell'utero che nell'addome della madre (mantenendo la connessione placentare)22, ma anche queste non consentono il time-lapse Imaging.
Per superare gli ostacoli dei saggi in vitro e consentire uno screening rapido dei percorsi di segnalazione, è stata sviluppata una tecnica di coltura a fette embrionale ex vivo23, adattata da un protocollo precedentemente pubblicato per la escrescenza del nervo periferico24. Utilizzando questo protocollo, il nervo oculomotore in via di sviluppo può essere immaginato nel tempo in presenza di molte delle strutture circostanti lungo la sua traiettoria, compresi gli obiettivi dell'oOM. Aggiungendo inibitori di piccole molecole, fattori di crescita o indicazioni guida ai media di coltura, possiamo valutare le perturbazioni di orientamento in più punti lungo la traiettoria dell'assone, consentendo una valutazione più rapida dei potenziali fattori di crescita e di guida.

<table><tbody><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur monouso (vetro di selce)</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrite DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio (200 g/L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (1X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato termicamente</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina (250 nM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Supercolla Loctite</td><td>Loctite Agarosio</td><td></td><td></td></tr> a <tr><td>basso punto di fusione</td><td>Thermo Fisher Scientific 16520050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserto per colture cellulari Millicell (30 mm, PTFE idrofilo, 0,4 um)</td><td>Millipore Sigma</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Moria Mini cucchiaio perforato</td><td>Strumenti per la scienza 10370-19</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri (100 x 15 mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (1X, pH 7,4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba VWR</td><td></td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche - Blunt</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-12</td><td></td></tr><tr><td>Ti Eclipse Perfect Focus con TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome (VT 1200S)</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td></td></tr><tr><td>Lame Vibratome (Doppio Taglio, Acciaio Inox)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-6</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo oculomotor slice coltura da embrionico gfp-expressing mice per time-lapse imaging di oculomotor nerve outgrowth

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Movimenti accurati degli occhi sono cruciali per la visione, ma lo sviluppo del sistema motorio oculare, in particolare le vie molecolari che controllano la guida degli assi, non è stato completamente chiarito. Ciò è in parte dovuto ai limiti tecnici dei tradizionali saggi di orientamento degli assoni. Per identificare ulteriori segnali di guida ascia che influenzano il nervo oculomotore, è stato sviluppato un saggio ex vivo per immaginare il nervo oculomotore in tempo reale man mano che cresce verso l'occhio. Gli embrioni E10.5 IslMN-GFP vengono utilizzati per generare fette ex vivo incorporandole in agarose, tagliandole su un vibratoma, per poi coltivarle in un'incubatrice a stadio al microscopio con fotomicroscopia time-lapse per 24-72 h. Le fette di controllo riassumono il ricapitolare il tempismo in vivo della crescita degli assoni dal nucleo all'orbita. Gli inibitori delle piccole molecole o le proteine ricombinanti possono essere aggiunti ai mezzi di coltura per valutare il ruolo dei diversi percorsi di guida degli assoni. Questo metodo ha i vantaggi di mantenere più del microambiente locale attraverso il quale gli assoni attraversano, non assiomizzando gli assoni in crescita e valutando gli assoni in più punti lungo la loro traiettoria. Può anche identificare gli effetti su specifici sottoinsiemi di assoni. Ad esempio, l'inibizione di CXCR4 fa sì che gli assoni ancora all'interno del midbrain crescano dorsalmente piuttosto che ventralmente, ma gli assoni che sono già usciti dal ventralsi non sono interessati.

Risultati normali: la figura 1 fornisce uno schema dell'esperimento. A partire dall'E9.5 nel topo, i primi assoni cominciano ad emergere dal nucleo oculomotore26. Con E10.5, un nervo oculomotore a fasciculato, che contiene i primi neuroni pionieri, può essere visto nel mesenchyme. C'è una significativa variabilità tra gli embrioni a E10.5 (anche all'interno della stessa lettiera) in quanto il nervo è progredito verso l'orbita, probabilmente a causa delle differenze di...

Un test etta ex vivo permette di immaginare l'escrescenza del nervo oculomotore in tempo reale. Le fette vengono generate incorporando embrioni E10.5 IslMN:GFP in agarose, tagliando su un vibratoma e crescendo in un incubatore stage-top. Il ruolo dei percorsi di orientamento degli assoni viene valutato aggiungendo inibitori ai mezzi di coltura.

Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Questo protocollo ci permette di identificare le vie di guida dell'assone attive nel nervo oculomotore e di valutare i loro ruoli in diversi punti lungo la traiettoria nervosa in tempo reale. Questa tecnica preserva gli ambienti locali attraverso i quali viaggiano gli assoni e i loro obiettivi finali. Gli assoni in crescita non vengono tagliati, quindi è possibile valutare la crescita iniziale dell'assone, piuttosto che la rigenerazione.Questo metodo fornisce informazioni sulla guida dell'assone nel sistema motorio oculare, ma potrebbe essere adattato allo studio della guida dell'assone di altri nervi. Questa tecnica porta la pratica a padroneggiare e lavorare rapidamente è estremamente importante. Quando lo si prova per la prima volta, utilizzare solo pochi embrioni, piuttosto che un'intera cucciolata.Prima di iniziare la procedura, prima confermare la gravidanza tramite ultrasuoni il giorno embrionale 10.5 da un accoppiamento a tempo. Raccogliere gli embrioni, spruzzare l'addome del topo incinta con il 70% di etanolo e utilizzare le forbici per aprire la cavità addominale per estrarre l'utero. Lavare l'utero in una piastra di Petri di HBSS ghiacciato prima di posizionare l'organo

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Vi presentiamo un metodo per preparare le fette di organotipica metà gestazione embrioni di topo per l'imaging coltivazione e time-lapse di escrescenza dei nervi periferici.

Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

Questo protocollo descrive un saggio organotipica fetta ottimizzato per il cervello postnatale e ad alta risoluzione time-lapse imaging di migrazione neuroblasti nel flusso migratorio rostrale.

Un saggio Slice organotipica per High-Resolution Time-Lapse Imaging della migrazione neuronale nel cervello postnatale

Qui sviluppiamo gli strumenti necessari...

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Il video dimostra l'isolamento di motoneuroni oculomotori, trocleari e spinali da un embrione di topo transgenico. L'embrione esprime motoneuroni marcati con una proteina fluorescente verde (GFP) per una facile visualizzazione e identificazione. I motoneuroni vengono isolati chirurgicamente al microscopio a fluorescenza e mantenuti in un terreno di coltura.

Isolamento e coltura di motoneuroni oculomotori, trocleari e spinali da un embrione di topo

Questo video dimostra la coltura ex vivo e l'imaging di fette oculomotorie da embrioni di topo transgenico. Gli embrioni vengono isolati e immersi nell'agarosio. Utilizzando un vibratomo si ottengono fette contenenti i nuclei oculomotori e gli occhi. Le fette vengono mantenute in coltura e visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Coltura ex vivo e imaging di fette oculomotorie da embrioni di topo transgenico

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  Time-lapse Imaging confocale di neuroni in migrazione in una coltura di fette organotipiche del cervello embrionale di topo utilizzando In Utero Elettroporazione. J. Vis. Exp. (2017) Questo video mostra la microscopia confocale time-lapse per osservare la migrazione radiale del neurone corticale dalla zona subventricolare alla placca corticale tramite scaffold gliali radiali in fette di cervello embrionale di topo trasdotte.

Imaging time-lapse della migrazione radiale dei neuroni corticali in fette di cervello embrionale di topo trasdotto

Viene descritta una tecnica per studiare le cellule NG2 e gli oligodendrociti utilizzando un sistema di coltura a fette del proencefalo e del cervelletto.  Questo metodo consente di esaminare le dinamiche di proliferazione e differenziazione delle cellule all'interno della linea degli oligodendrociti, dove l'ambiente extracellulare può essere facilmente manipolato mantenendo la citoarchitettura tissutale.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Questo protocollo dimostra un metodo semplice e robusto per studiare la crescita degli assoni in situ e la dinamica dei coni di crescita. Descrive come preparare ex vivo fette di cervello acuto fisiologicamente rilevanti e fornisce una pipeline di analisi di facile utilizzo.

Sul posto Visualizzazione delle dinamiche dei coni di crescita e crescita degli assoni in colture di fette di cervello embrionali ex vivo acute

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Impara a coltivare fette ex vivo da embrioni di topo GFP per l'imaging time-lapse della crescita del nervo oculomotore. Questo metodo preserva i microambienti locali e consente di studiare le vie di guida assonale in tempo reale.

Ex Vivo Oculomotor Slice Coltura da embrionico GFP-Expressing Mice per Time-Lapse Imaging di Oculomotor Nerve Outgrowth

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