Ottimizzazione, progettazione ed evitare le falle nella immunostiera fluorescente manuale

L'immunoistochimica fluorescente multiplex identifica più tipi di cellule e le loro posizioni nel tessuto incorporato nella paraffina fissa alla formalina intatta, consentendo non solo l'identificazione cellulare, ma anche l'analisi spaziale da cellula a cellula. Il principale vantaggio di questa tecnica manuale è l'uso di anticorpi multipli della stessa specie senza reattività incrociata. Questa tecnica consente una visione approfondita delle interazioni delle cellule immunitarie e tumorali nel microambiente tumorale.

Quando si prova questa tecnica per la prima volta, consentire circa tre o quattro giorni di colorazione e tenere traccia di ogni passaggio completamente durante il processo. Un metodo più debole del processo di colorazione e del design multiplex è fondamentale per ridurre le insidie comuni e previste. Inizia deparaffinizzando e reidratando le diapositive.

Mettili nel forno di ibridazione con il lato tissutale verso l'alto e cuocerli a 60 gradi Celsius per un'ora. Togliere gli scivoli dal forno e lasciare raffreddarli per cinque-10 minuti in una griglia verticale. Quindi utilizzare un set di colorazione scorrevole per trattare le diapositive tre volte con xilene e una volta con 100%etanolo, 95% etanolo e 70%etanolo per 10 minuti ciascuno.

Lavare il rack di scivoli con acqua deionizzata e quindi fissare gli scivoli immergendoli in formalina tamponata neutra per 30 minuti. Lavare gli scivoli con acqua per due minuti e procedere con il recupero dell'antigene. Posizionare il rack di diapositive in una scatola resistente al calore riempita con tampone di recupero antigene pH 6.0 o pH 9.0.

Coprire la scatola con un involucro di plastica e fissarla con un elastico. Posizionare la scatola in un forno a microonde dotato di inverter sul bordo della piastra rotante e riscaldare gli scivoli per 45 secondi al 100% di potenza seguita da 15 minuti con una potenza del 20%. Lasciare raffreddare le diapositive per 15-20 minuti dopo il microwaving.

Nel frattempo, preparare soluzioni di lavoro di anticorpi e fluorofori. Preparare il diluente dell'anticorpo primario sciogliendo 0,5 grammi di granuli di albume di siero bovino in 50 millilitri di TBST o 1X PBS. Diluire ogni soluzione di lavoro degli anticorpi primari a una concentrazione ottimizzata precedentemente determinata.

Diluire ogni fluoroforo nel diluente del fluoroforo ad una concentrazione da uno a 100. L'ultimo giorno di colorazione, preparare la soluzione di lavoro DAPI aggiungendo tre gocce di DAPI a un millilitro di TBST. Una volta raffreddati gli scivoli, rimuoverli dal microonde e togliere l'involucro di plastica.

Lavarli con acqua deionizzata per due minuti seguita da un lavaggio di due minuti con TBST. Dopo il lavaggio, asciugare lo scivolo intorno al tessuto con un delicato compito pulire e tracciare intorno all'esterno del tessuto con una penna barriera idrofobica, facendo attenzione a non toccare il tessuto o lasciarlo asciugare. Posizionare ogni diapositiva nella camera dell'umidificatore e aggiungere circa quattro gocce di soluzione di blocco al tessuto.

Quindi incubare le diapositive per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere con l'applicazione dell'anticorpo primario. Rimuovere la soluzione di blocco da ogni diapositiva toccando il lato della diapositiva su una pila di tovaglioli di carta e utilizzare una delicata salvietta per le attività per rimuovere la soluzione rimanente. Riposizionare lo scivolo nella camera umidificata, aggiungere circa 200 microlitri dell'anticorpo primario funzionante e incubare per un'ora.

Dopo l'incubazione, lavare gli scivoli tre volte immergendoli in TBST per due minuti per lavaggio. Tamponare il TBST rimanente da ogni diapositiva e applicare circa tre o quattro gocce di anticorpo secondario. Incubare gli scivoli nella camera umidificata per 10 minuti.

Lavare nuovamente i vetrini con TBST e applicare circa 100 microlitri della soluzione di lavoro a fluoroforo. Riportare i vetrini nella camera umidificata e incubare per 10 minuti. Ripetere il lavaggio TBST e quindi microonde le diapositive secondo le indicazioni manoscritte per rimuovere gli anticorpi.

Una cosa importante da ricordare durante questo processo di colorazione di più giorni è fermarsi dopo la fase di microwaving e lasciare le diapositive nel tampone di recupero dell'antigene durante la notte, garantendo l'integrità dei tessuti e delle macchie. Rimuovere l'ultima applicazione anticorpale con la soluzione di recupero dell'antigene e lavare gli scivoli con acqua deionizzata seguita da TBST per due minuti per lavaggio. Ripetere i passaggi di colorazione per il resto delle coppie di flurofori anticorpali e quindi procedere con l'applicazione DAPI.

Applicare circa 150 microlitri di soluzione DAPI funzionante su ogni diapositiva e incubarli nella camera umidificata per 10 minuti. Dopo l'incubazione, lavare gli scivoli con TBST per circa 30 secondi e montare i coperchi. Una volta che il supporto di montaggio si è asciugato, applicare uno smalto chiaro per unghie ai quattro angoli del coperchio scivolare per fissarlo.

Per analizzare il monoplex, immagini le diapositive al microscopio con un'esposizione di 250 millisecondi usando DAPI per mettere a fuoco. Valutare ogni diapositiva monoplex osservando l'intensità di fluorescenza del marcatore macchiato e confrontare questa intensità con lo sfondo. Utilizzare la posizione della diapositiva nel multiplex finale se l'intensità del marcatore macchiato è almeno cinque volte superiore allo sfondo.

Quando si macchia il multiplex, scegliere l'ordine appropriato per ogni anticorpo e assegnare ogni fluoroforo a un anticorpo. Procedere con la colorazione del multiplex come descritto in precedenza e preparare una diapositiva vuota che riceve diluente anticorpo, diluente al fluoroforo e TBST invece di anticorpi primari, fluoroforo o DAPI. Quando sei pronto per l'immagine del multiplex al microscopio, imposta l'esposizione su 250 millisecondi per tutti i canali e acquisisci ogni immagine usando DAPI per mettere a fuoco.

Quindi utilizzare il software di analisi per valutare ogni multiplex per falso colore fluorescente e per vista patologica, che confermerà la specificità di ogni marcatore. Per garantire il successo del saggio multiplex, è necessario eseguire un test monoplex per determinare l'ordine di ogni anticorpo. Ad esempio, quando Foxp3 si trova nella terza posizione dell'array, viene dimostrata la colorazione e la colocalizzazione specifiche e robuste con CD3.

Al contrario, quando Foxp3 è in prima posizione, si verifica una colorazione non specifica di Foxp3. Aree granulosa ed effuse di rosso sono presenti sulla maggior parte dello scivolo e l'intensità fluorescente di queste aree è bassa. Un altro passo importante in questo saggio è la controsottenizione della DEPI, che è la base per l'identificazione delle cellule e ulteriori analisi.

Si può vedere un chiaro contrasto tra immagini con DAPI funzionante e non funzionante. Per il saggio multiplex, le bellissime immagini composite non sempre riflettono una macchia accurata. Mentre il CD3 viene visualizzato e mostra una colorazione specifica, la vista del campo luminoso della patologia del CD163 dimostra che l'anticorpo non è specifico.

Un'immagine multiplex ottimale dimostra una colorazione specifica in un'immagine composita e la specificità CD3 e CD163 è confermata con la vista del campo luminoso della patologia. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire calcoli di autofesotipizzazione e analisi spaziale per analizzare ulteriormente le interazioni da cella a cella. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per esplorare la modelliatura spaziale delle cellule e del tessuto intatto, favorendo la nostra comprensione del microambiente immunitario tumorale.