Preparazione del campione per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray sonda
19 febbraio 2020
Questo articolo introduce metodi di preparazione di esempio per un metodo analitico unico in tempo reale basato sulla spettrometria di massa ambientale. Questo metodo ci permette di eseguire analisi in tempo reale delle molecole biologiche in vivo senza particolari pretrattamenti.
Quindi, questa è una spettrometria di massa ambientale unica, particolarmente adatta per l'analisi di campioni biologici, sia in vitro che in vivo. Poiché ciò non richiede regolarmente uno speciale pretrattamento di campioni, come lo smistamento cellulare, il frazionamento e la concentrazione, può analizzare un campione con perdita minima di componenti biologici, specialmente quelli che esistono come quantità molto piccola. Questa tecnica consente di analizzare le materie prime direttamente in un minuto mediante spettrometria di massa.
La rapidità è senza resistenza nel sistema, i principali vantaggi inerenti a questa tecnica. Tutto quello che devi fare è solo preparare silice, 10 milligrammi di campioni di tessuti e 10 microlitri di proliferano. E mettili in una cartuccia usa e getta.
È impostato sulla macchina PESI-MS e otterrai il risultato in pochi minuti. Scegliendo lo spettrometro di massa appropriato, è possibile annotare l'identità molecolare. Per iniziare, recuperare il fegato o il tessuto renale dal congelatore.
Su una piastra di sughero, tagliare il campione di tessuto a circa due per due per due millimetri usando un bisturi o un coltello. In alternativa, punzonare il campione con il Trepan e tagliare la lunghezza della colonna a due millimetri. Se il tessuto è contaminato dal sangue, lavare brevemente con soluzione salina tamponata da fosfati ghiacciati.
Posizionare circa 10 milligrammi del campione tagliato o perforato in un microtubo di plastica e aggiungere 100 microlitri di 50%etanolo. Utilizzare una micropestola per omogeneizzare il campione. Quindi, con il pipettaio, posizionare 10 microlitri dell'omogeneato nel pozzo della cartuccia dello spettrometro di massa.
Posizionare la cartuccia nella camera di ionizzazione dello spettrometro di massa di ionizzazione a sonda diretta e installare la sonda dell'ago di furto inossidabile che verrà utilizzata per la ionizzazione del campione. Chiudere saldamente il coperchio della camera per attivare automaticamente il dispositivo di sicurezza. Avviare il computer di bordo facendo clic sull'icona di avvio per analizzare, utilizzando i pannelli sullo schermo, applicare una tensione di 2,3 kilovolt all'ago per generare l'elettrospray e assicurarsi che la frequenza dell'ago sia di tre hertz.
Attendere 30 secondi per il completamento della misurazione. Dopo aver misurato ogni campione, smaltire la cartuccia e l'ago in uno smaltitore a rischio biologico. Per analizzare gli spettri di massa, aprire il software associato allo spettrometro di massa.
Fare clic sul file L-C-D nella finestra del browser dei file di dati del software. Scegliere di fare clic su un singolo picco della finestra dello spettro di massa e di rappresentare automaticamente un E-I-C. Controllare il T-I-C e l'E-I-C e fare clic sull'icona dello spettro medio per selezionare l'intervallo di tempo per generare lo spettro di massa.
Esportare i dati di testo spettrale di massa. Per analizzare i fluidi corporei, disegnare fino a 10 microlitri del campione di siero e disrogarlo in un microtubo da 1,5 millilitri. Aggiungere 190 microlitri di 50% di etanolo al tubo, quindi vortice per due minuti a temperatura ambiente.
Per eliminare tutti i globuli rossi, centrifugare il liquido a 15.000 volte G per uno o cinque minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 10 microlitri del supernatante nel pozzo della cartuccia e procedere a misurare sullo spettrometro di massa come in precedenza. Questo protocollo mostra la preparazione del campione per PESI-MS su campione solido, campione liquido e animale vivente.
Il carcinoma a cellule renali umane mostra picchi caratteristici di lipidi neutri. Ci sono stati picchi relativamente forti negli spettri al rapporto massa-carica di 900 dal tessuto carcinoma a cellule renali umane che non sono stati identificati nel tessuto non canceroso circostante. Questi picchi rappresentano principalmente il glicerolo triacile.
Esempi di dati acquisiti nei normali tessuti epatici, hanno raffigurato la lesione neoplastica di un paziente con epatite cronica e cirrosi epatica. Il siero umano di tre individui è stato analizzato usando PESI-MS, c'erano chiare differenze nei modelli spettrali tra gli individui. Per i cambiamenti metabolici in 5-FdU iniettati per via endovene nel vaso di coda di un topo, è stato ottenuto un rilevamento molto rapido e sensibile di 5-FdU con addotto di sodio nel fegato in situ.
Poiché la profondità della punta dell'ago dal sito del tessuto, svolge il ruolo più importante nella ionizzazione che legge l'acquisizione dei dati di successo, assicurati di seguire le istruzioni. È possibile identificare le specie molecolari esaminando il database commerciale. Questo è un modo per qualificare il meccanismo molecolare della malattia.
Molti ricercatori si sono interessati all'applicazione di questa tecnica per prevedere la prosperità della malattia ed è la prognosi. Soprattutto usando la biopsia di Ricket. Assicurati solo di non essere pungolato dall'ago della sonda.
Questo può essere semplicemente evitato con uno strumento specifico per rimuovere l'ago dalla macchina.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un metodo unico di spettrometria di massa ambientale per l'analisi in tempo reale di campioni biologici in vivo. Questa tecnica consente l'analisi di materiali tissutali grezzi senza trattamenti preliminari speciali, riducendo al minimo la perdita di componenti biologici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Spettrometria di Massa
- Analisi Biologica
- Chimica Analitica
Sfondo
- La spettrometria di massa ambientale è adatta sia all'analisi in vitro che in vivo.
- Il metodo non richiede un'estesa pretrattamento del campione.
- Consente l'analisi di campioni con perdita minima di componenti biologici.
- L'analisi rapida è un vantaggio fondamentale di questa tecnica.
Scopo dello studio
- Presentare un metodo per l'analisi in tempo reale di molecole biologiche.
- Dimostrare l'efficienza nell'analisi di materiali tissutali grezzi.
- Evidenziare i vantaggi dell'uso della spettrometria di massa in condizioni ambientali.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di campioni di silice e di tessuti.
- Utilizzo di cartucce monouso per l'analisi dei campioni.
- Analisi diretta di campioni biologici mediante spettrometria di massa.
- Elaborazione rapida dei campioni entro un minuto.
Risultati principali
- Il metodo consente un'analisi rapida senza una significativa perdita di componenti.
- È efficace per l'analisi di campioni con quantità molto ridotte di materiale biologico.
- Dimostra robustezza e affidabilità nell'analisi in tempo reale.
- Facilita lo studio di molecole biologiche nel loro stato nativo.
Conclusioni
- La spettrometria di massa ambientale è uno strumento prezioso per l'analisi biologica.
- La tecnica migliora la comprensione dei processi biologici.
- Offre un metodo rapido ed efficiente per l'analisi in tempo reale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La spettrometria di massa con ionizzazione elettrospray mediante sonda (PESI-MS) consente un'analisi molecolare in tempo reale di campioni biologici con minima pretrattazione, supportando una rapida validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nelle fasi iniziali della scoperta. La tecnica richiede soltanto 10 mg di tessuto o 10 µL di siero, risultando adatta a campioni preclinici a basso volume e riducendo la perdita di componenti biologici. Questa capacità migliora l'affidabilità predittiva nell'identificazione dei composti attivi fornendo dati diretti, in situ, sulla dinamica di metaboliti e farmaci provenienti da sistemi viventi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche rilevando direttamente lipidi neutri e metaboliti da tessuti solidi come il carcinoma a cellule renali.
- Valore operativo: Richiede una preparazione minima del campione—semplice omogeneizzazione del tessuto in etanolo al 50%—riducendo la complessità e la variabilità del flusso di lavoro.
- Valore predittivo: Supporta la caratterizzazione dei meccanismi molecolari mediante confronto con database commerciali, contribuendo alla valutazione della fiducia sui bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Consente l'analisi diretta del siero sanguigno umano dopo una semplice precipitazione con etanolo e centrifugazione, permettendo lo screening di biomarcatori basato su fluidi.
- Valore operativo: Utilizza cartucce monouso e sonde in acciaio inossidabile, garantendo standardizzazione e riducendo il rischio di contaminazione incrociata.
- Scalabilità: Facilita un rapido ricambio dei campioni—risultati in pochi minuti—rendendo possibile la predisposizione allo screening ad alto rendimento.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Consente il monitoraggio in tempo reale della dinamica di metaboliti o farmaci in organi specifici di animali vivi, come la rilevazione di 5-FdU nel fegato del topo.
- De-risking meccanicistico: Fornisce dati molecolari in situ senza distruzione del tessuto, preservando il contesto fisiologico per una migliore traduzione preclinica-clinica.
- Avanzamento basato sulla valutazione del rischio: Rileva modelli spettrali associati a malattie (ad esempio lesioni neoplastiche nel fegato cirrotico) per informare decisioni di avanzamento o interruzione del progetto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
PESI-MS si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla biologia iniziale all'identificazione del composto guida, offrendo letture molecolari rapide e quantitative che supportano la verifica delle ipotesi e la preparazione dei saggi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi rilevando firme molecolari specifiche per tessuto (ad esempio, triacilglicerolo nel carcinoma) senza frazionamento.
- Screening: Permette l'analisi di fluidi e tessuti pronti per il saggio mediante introduzione del campione standardizzata basata su cartucce.
- Analisi: Genera dati spettrometrici di massa (picchi m/z, EIC, TIC) per il confronto quantitativo tra diverse condizioni e individui.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica monitorando i metaboliti dei farmaci in vivo, come la 5-FdU endovenosa nella vena della coda del topo.
- Riutilizzo aziendale: Utilizza hardware riutilizzabile (sonda, camera) con materiali monouso, consentendo una standardizzazione trasversale ai progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo dati molecolari diretti da sistemi biologici integri.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso una preparazione standardizzata dei campioni (10 mg di tessuto, 10 µL di siero, etanolo al 50%) e impostazioni fisse di tensione e frequenza (2,3 kV, 3 Hz).
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) consentendo la rapida rilevazione di metaboliti o farmaci in modelli di malattia.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorità aggiustata per il rischio mediante il rilevamento di picchi specifici per la malattia (ad esempio, m/z 900 nel carcinoma) assenti nei controlli.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nell'uso della spettrometria di massa, inclusa la preparazione del solvente (50% etanolo) e l'uso della centrifuga per l'elaborazione del siero.
- È necessario un sistema di spettrometria di massa con ionizzazione tramite sonda diretta, dotato di sistema a cartucce compatibile e sonda con ago in acciaio inossidabile.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i team nelle procedure di gestione del campione—taglio del tessuto, omogeneizzazione e trasferimento del soprannatante—per garantire la coerenza dei dati.
- Deve considerare la profondità della punta dell'ago come variabile critica che influisce sull'efficienza di ionizzazione e sulla qualità dei dati nelle applicazioni in vivo.
- Limitato ai campioni compatibili con l'ionizzazione in condizioni ambientali; gli effetti della matrice potrebbero richiedere un'ottimizzazione nel caso di bioliquidi complessi.
