Name: Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Scopri come rilevare il 5-idrossimetilcitosina in cellule staminali neurali e cervelli di topi mediante immunofluorescenza e DNA dot-blot. Questo protocollo accessibile facilita lo studio dell'epigenetica neurale.

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XL è stata sostenuta in parte dal National Key R&D Program of China (2017YFE0196600) e dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31771395, 31571518). Q.S. è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFC1001703) e dal Key Research and Development Program della provincia di ehejiang (2017C03009). W.X. è stato sostenuto dalla Fondazione di Scienze Naturali della provincia di ejiang (LY18H020002) e dal Dipartimento di Tecnologia Della Scienza della provincia di Ehejiang (2017C37057).

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Hejiang.
1. La coltura delle cellule staminali neurali adulte e dei neuroni
<ol><li>Isolare le cellule staminali neurali adulte dal prosencefalo di un adulto (8-10 settimane) mouse maschio C57/BL6 come descritto in precedenza31,32.</li>
	<li>Coltura cellule staminali neurali adulte in DMEM/F-12 medio contenente 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% supplemento B27, 1% antibiotico-antimiocolotico, e 2 mM L-Glutamine in un 5% DI CO2 incubatore a 37 . Indurre la differenziazione delle cellule staminali neurali adulte con 1 acido retinoico di M e 5 m forskolin per 48 h come descritto in precedenza31,32.</li>
	<li>Isolare i neuroni dal giorno embrionale 17 (E17) ippocampi del topo e della coltura con mezzo neurobasale contenente 0.25% L-Glutamine, 0.125% GlutaMax e 2% B27 supplemento in un 5% DI CO2 incubatore a 37 gradi centigradi come precedentemente descritto33.</li>
</ol>2. Perfusione transcardiale del topo
<ol><li>Preparare il 10% di idrato cloro, il 4% di paraformaldeide (PFA) e la salina tamponata di fosfato (PBS) un giorno prima dell'esperimento, e conservare a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Anestesizzare un topo adulto maschio o femmina C57 BL/6J con 10% di idrato cloro (50 mg/kg, i.p.), e assicurarsi che l'animale sia profondamente anestesizzato controllando la reazione del corpo. Fissare ogni arto con nastro adesivo su una scheda di plastica (in posizione faccia a faccia in su).</li>
	<li>Tagliare la pelle e poi il muscolo con forbici chirurgiche. Aprire la cavità toracica con una forbice chirurgica. Esporre il cuore e tagliare una piccola parte dell'atrio destro con una forbice chirurgica fine.</li>
	<li>Perfondere il topo con una siringa sterilizzata usa e getta da 10 mL dal ventricolo sinistro con PBS freddo (circa 30 mL per topo adulto).</li>
	<li>Perfondere il topo con 4% PFA (circa 30 mL in 10 min per topi adulti) fino a quando non è rigido.</li>
	<li>Aprire il cranio del topo con pinze ossee. Rimuovere il cervello e mettere in 5 mL di 4% PFA in un tubo di centrifuga 15 mL per post-fissazione a 4 gradi centigradi. NOT:</</c0> Pulire l'area chirurgica al termine dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Almeno 24 h più tardi, trasferire i campioni di cervello in una soluzione di saccarosio 30% per la completa disidratazione a 4 gradi centigradi.</li>
</ol>3. Sezionamento del cervello
<ol><li>Incorporare i campioni cerebrali in composto ottimale per la temperatura di taglio (OCT) in un piccolo contenitore e raffreddati a -20 gradi centigradi per almeno 1 h.</li>
	<li>Sezione campioni cerebrali con uno spessore di 20-40 m con un microtoma criostatista.</li>
	<li>Raccogliere le sezioni in PBS e conservare a 4 gradi centigradi.</li>
</ol>4. Immunofluorescenza Colorazione
<ol><li>Raccogliere le sezioni con le regioni cerebrali mirate e metterli in una piastra di 24 pozze con PBS. Per le celle coltivate su un coverslip, andare direttamente al passaggio 4.2.</li>
	<li>Lavare con PBS sullo shaker a temperatura ambiente per 10 min. Ripetere questo due volte di più.</li>
	<li>Rimuovere PBS e trattare con preriscaldato 1 M HCl per 30 min a 37 gradi centigradi. NOT:</</c0> Preparare 1 M HCl aggiungendo 1 mL di acido cloridrico (36-38%) in 10 mL di acqua in un cappuccio chimico. Preriscaldare 1 M HCl nell'incubatrice a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Lavare i campioni con PBS per 5 min.</li>
	<li>Campioni a blocchi con PBS contenenti il 3% del siero di capra normale e lo 0,1% Triton X-100 per 1 h sullo shaker a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare sezioni con anticorpi primari specifici durante la notte a 4 gradi centigradi sullo shaker. NOT:</</c1> Utilizzare i seguenti anticorpi primari: anticorpi del coniglio policlonale anti-5-idrossimetilcitosina (1:5.000), anticorpo monoclonale murino anti-NeuN (1:500).</li>
	<li>Estrarre i campioni e incubare ulteriormente a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Lavare i campioni con PBS per 10 min. Ripetere questo due volte di più.</li>
	<li>Incubare con anticorpi secondari corrispondenti agli anticorpi primari a temperatura ambiente per 1 h sullo shaker. Coprire la piastra con l'alluminio. NOT:</</c2> Utilizzare i seguenti anticorpi secondari: Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgG (1:500), Alexa Fluor 568 capra anti-topo IgG (1:500). Nuclei controstain con 4'6-diamidino-2-fenilindole (DAPI).</li>
	<li>Lavare i campioni con PBS per 10 min sullo shaker. Ripetilo altre due volte.</li>
	<li>Montare le sezioni cerebrali sui vetrini, aggiungere una quantità adeguata di supporto di montaggio anti-dissolvenza (circa 100-150 l) e coprire con vetro di copertura premium. Sigillare con smalto.</li>
	<li>Scattare immagini con un microscopio a fluorescenza regolare o confocale.</li>
</ol>5. Isolamento del DNA genomico
<ol><li>Eutanasia un topo adulto C57 BL/6J (maschio o femmina) per lussazione cervicale e rimuovere il cervello.</li>
	<li>Dissezitano i tessuti dell'ippocampo, della corteccia e del cervelletto su un piatto ghiacciato. Macinare i tessuti con un grinder tissutale in 1 mL di tampone di lisi di DNA e trasferirli nel tubo di microcentrifuga pulito. Aggiungete 250 g di proteinease K per 600 luna di tampone di lisi. Per i pellet cellulari, aggiungere direttamente il tampone di lisi, la proteinasi K e mescolare accuratamente. NOT:</</c0> Preparare il buffer di lisi del DNA: 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl in 100 mM Tris-HCl, pH 8.5. Lavare e autoclare la smerigliatrice dei tessuti prima dell'esperimento.</li>
	<li>Il secondo giorno, aggiungere circa 50 g di RNase A per campione per almeno 12 h a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Aggiungere un volume uguale di fenolo:cloroformio:alcool isoamyl (25:24:1) e mescolare completamente.</li>
	<li>Centrifuga a 20.817 x g per 15 min, e rimuovere il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifuga.</li>
	<li>Aggiungere 600 litri di cloroformio al supernatante per far precipitare il DNA e mescolare accuratamente.</li>
	<li>Centrifuga a 20.817 x g per 15 min, e rimuovere il supernatante in un altro nuovo tubo.</li>
	<li>Aggiungere 500 l di isopropanolo al supernatante e mescolare accuratamente.</li>
	<li>Centrifuga a 20.817 x g per 15 min, e rimuovere completamente il supernatante.</li>
	<li>Lavare la precipitazione con 1 mL di 70% etanolo, centrifugare a 20,817 x g per 1 min, e rimuovere completamente il supernatante. Ripetere una volta.</li>
	<li>Asciugare completamente il pellet di DNA.</li>
	<li>Sciogliere il pellet di DNA con il buffer Tris-HCl (pH 8,5) alla concentrazione corretta.</li>
</ol>6. DNA Dot Blot
<ol><li>Preparare le soluzioni: 2 M NaOH, tampone Tris-HCl (pH 8.5), 6x citrato di sodio saline (SSC).</li>
	<li>Fare la miscela campione come Tabella 1.</li>
	<li>Denaturare i campioni di DNA a 100 gradi centigradi per 10 min e raffreddare sul ghiaccio.</li>
	<li>Tagliare la giusta dimensione della membrana di nylon (ad es., Hybond-N) e risciacquare con 6x SSC.</li>
	<li>Mettere la membrana sull'apparato punto-macchia e collegare alla pompa a vuoto. Spot 6 - L di miscela per punto sulla membrana.</li>
	<li>Ibridare per 30 min a 80 gradi centigradi e bloccare la membrana del campione con latte senza grassi in salina tamponata tris (TBS) per 1 h.</li>
	<li>Incubare con anticorpo primario a 4 gradi centigradi durante la notte. NOTA: il seguente anticorpo primario: coniglio policlonale anti-5-idrossimetilcitosina (1:5.000).</li>
	<li>Il secondo giorno, incubare le membrane del campione a temperatura ambiente per 1 h. Lavare con TBS per 10 min.</li>
	<li>Incubare la membrana con anticorpo secondario anti-coniglio (1:5,000) per 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare con TBS per 10 min. Ripetere questo lavaggio altre due volte.</li>
	<li>Visualizzare i segnali di chemiluminescenza e quantificare l'intensità del segnale.</li>
</ol>

<ol><li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li>
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<li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li>
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<li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+DNA+methylation%3A+mechanisms%2C+genomics%2C+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li>
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<li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301(2018).</li>
<li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li>
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</ol>

Non esistono interessi finanziari concorrenti.

Le modifiche epigenetiche svolgono un ruolo essenziale durante lo sviluppo cerebrale, la maturazione e la funzione. Come marcatore stabile per la modifica del DNA, dinamico 5-hmC risponde all'adattamento comportamentale, all'attività neuronale, ed è positivamente correlato con l'espressione genica; così, è coinvolto nella normale funzione del cervello e disturbo neurologico4. Per esplorare la sua funzione nelle cellule e nei tessuti, è necessario rilevare l'esistenza di 5-hmC e confrontare il live...

Le modifiche epigenetiche, tra cui la modificazione del DNA, la modificazione dell'istone e la modificazione dell'RNA, hanno dimostrato di svolgere funzioni essenziali in diversi processi biologici e malattie1,2,3, 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7. Per lungo tempo, la metilazione del DNA (cioè la metilcitosina 5 mC) è stata vista come un marcatore epigenetico altamente stabile e non può essere ulteriormente modificata nel genoma. Recentemente, è stato scoperto che 5-mC potrebbe essere ossidato a 5-idrossimetilcitosina (5-hmC) da TET (Dieci-undici traslocazioni) proteine di famiglia tra cui TET1, TET2, e TET38,9. Ulteriori studi dimostrano che 5-hmC potrebbe fungere da marcatore stabile e svolgere ruoli biologici attraverso la regolazione dell'espressione genica4,10,11,12.
Le prove attuali indicano che 5-hmC è altamente arricchito nei tessuti neuronali / cellule rispetto ad altri tipi di tessuti nei mammiferi, e presenta caratteristiche dinamiche durante lo sviluppo neuronale13,14. Nel sistema neuronale, le modifiche epigenetiche mediate a 5-hmC svolgono un ruolo importante nella regolazione delle cellule staminali neurali, dell'attività neuronale, dell'apprendimento e della memoria, ed è coinvolta in molteplici disturbi neurologici tra cui la sindrome di Rett, l'autismo, l'Alzheimer malattia di Huntington, ecc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Ci sono diversi approcci per rilevare 5-hmC in cellule e tessuti14,21,22,23,24. Qui, descriviamo due metodi per rilevare l'esistenza di 5-hmC e quantificare il livello globale di 5-hmC: colorazione immunofluorescenza e DNA dot-blot. Questi due metodi sono convenienti e sensibili, e sono stati utilizzati con successo negli studi precedenti25,26,27,28,29,30. I passaggi chiave di questi due metodi sono la denaturazione del DNA. Per la colorazione immunofluorescenza di 5-hmC, è necessario pre-trattamento di campioni con 1 M HCl. Per una macchia di punti da 5-hmC, la denaturazione del DNA viene eseguita con soluzione NaOH. Questi due metodi insieme al sequenziamento di nuova generazione sono strumenti molto utili per studiare la funzione di 5-hmC.

<table><tbody><tr><td>4'-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop software</td><td>Adobe Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 capra anti-topo IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>anti-5-idrossimetilcitosina</td><td>Active Motif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 integratore</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di B27</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo criostato</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medio</td><td>OmegaScientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo neurobasale</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra normale</td><td>Vector Laboratories</td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in nylon (Hybond&trade;-N+ )</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td>RPN303B</tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24:1 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>Acido</td> <td>retinoicoSigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

il rilevamento di 5-hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Sono state identificate diverse modifiche del DNA nel genoma dei mammiferi. Di questi, sono stati studiati intensamente i meccanismi epigenetici mediati da 5-metilcytosina e 5-idrossimethylcytosine. 5-idrossimetilcitosina mostra caratteristiche dinamiche durante lo sviluppo embrionale e postnatale del cervello, svolge una funzione regolatrice nell'espressione genica, ed è coinvolto in più disturbi neurologici. Qui, descriviamo i metodi dettagliati tra cui l'immunofluorescenza colorazione e DNA dot-blot per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule coltivate e tessuti cerebrali del topo.

Per rivelare la distribuzione di 5-hmC nell'ippocampo di topi adulti, abbiamo eseguito l'immunofluorescenza con anticorpi contro le cellule neuronali (NeuN) e 5-hmC. Nell'ippocampo, 5-hmC co-localizzato bene con marcatore cellulare neuronale NeuN (Figura 1A-H), suggerendo un arricchimento di 5-hmC nei neuroni.
Per determinare la dinamica di 5-hmC durante lo sviluppo neuronale, è stato eseguito un punto-blot con campioni di DNA isolati da cellule s...

Qui, presentiamo un protocollo per rilevare 5-idrossimetilcitosina nelle cellule e tessuti cerebrali, utilizzando immunofluorescenza colorazione e metodi di DNA dot-blot.

Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Qui presentiamo un protocollo per rilevare la 5-idrossimetilcitosina nelle cellule e nei tessuti cerebrali usando l'immunofluorescenza, il nuovo metodo e il DNA dot-blot. La 5-idrossimetilcitosina, cioè 5hmC, modifica epigenetica mitigata, svolge una funzione importante nella regolazione dell'espressione genica e coinvolta in molteplici disturbi neurologici.In realtà, i nostri metodi possono essere utilizzati per rilevare 5hmC in più cellule e tessuti. È conveniente e può essere eseguito con attrezzature comuni in laboratorio. Inizia posizionando il mouse a faccia in su su una tavola di plastica e fissando ogni arto con nastro adesivo.Utilizzare forbici chirurgiche per tagliare la pelle e il muscolo e aprire la cavità toracica. Esporre il cuore e tagliare una piccola parte dell'atrio destro con forbici chirurgiche fini. Utilizzando una siringa sterilizzata monouso da 10 millilitri, perfondere il mouse dal ventricolo sinistro con PBS freddo.Quindi, perfondere il mouse con il 4%PFA fino a quando non è rigido. Quindi, apri il cranio con le forcep ossee e rimuovi il cervello. Mettere il cervello in un tubo di centrifuga da 15 millilitri riempito con cinque millilitri del 4% di PFA e conservarlo a quattro gradi Celsius.Dopo 24 ore, trasferire il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% e lasciarlo a quattro gradi Celsius per una completa disidratazione. Prima di sezionamento, ho incitato il cervello in un composto ottimale della temperatura di taglio e raffreddato a meno 20 gradi Celsius per almeno un'ora. Se sezione campioni cerebrali ad uno spessore da 20 a 40 micrometri utilizzando un microtomo criostato.Raccogliere sezioni in PBS e archiviare a quattro gradi Celsius. Raccogli le sezioni cerebrali di interesse e mettile in una piastra da 24 po 'con PBS. Lavare le sezioni con PBS su uno shaker per 10 minuti.Rimuovere il PBS e trattare con acido cloridrico monomolare preriscaldato a 37 gradi Celsius per 30 minuti. L'acido cloridrico è corrosivo e si prega di prepararlo nella stiva chimica. Quindi, lavare i campioni tre volte con PBS per cinque minuti e bloccarli con PBS contenente il 3% di siero di capra normale e lo 0,1%Triton X-100.Lasciare i campioni su uno shaker a temperatura ambiente per un'ora. Aggiungere anticorpi primari specifici alle sezioni e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius su uno shaker. Il giorno dopo, prelevare i campioni e lasciarli a temperatura ambiente per un'ora.Lavare i campioni tre volte con PBS e aggiungere anticorpi secondari. Coprire la piastra con alluminio e lasciarla a temperatura ambiente per un'ora mentre si trema. Dopo l'incubazione, lavare i campioni tre volte con PBS e montarli su diapositive.Aggiungere da 100 a 150 microlitri di mezzo di montaggio anti-dissolvenza, coprire con un vetro di copertura premium e sigillare con smalto per unghie. Immagini le sezioni cerebrali con un microscopio regolare o confocale. Per isolare il DNA genomico, inizia sezionando i tessuti dell'ippocampo, della corteccia e del cervelletto su un piatto raffreddato a ghiaccio.Aggiungere un millilitro del tampone di lysis del DNA e macinare i tessuti. Trasferire il campione in un tubo di microcentrifugo pulito e aggiungere 250 microgrammi di proteinasi-K per ogni 600 microlitri di tampone di lysis. Quindi, aggiungere circa 50 microgrammi di RNasi A per campione e incubare per almeno 12 ore a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, aggiungere un volume uguale di fenolo cloroformio alcol isoamlico e mescolare accuratamente. Centrifugare la miscela secondo le indicazioni manoscritte e trasferire il supernatante su un nuovo tubo. Aggiungere 600 microlitri di cloroformio al supernatante, mescolare accuratamente e centrifugare secondo le indicazioni manoscritte.Trasferire il supernatante su un nuovo tubo e aggiungere 500 microlitri di isopropanolo. Mescolare accuratamente e centrifugare di nuovo per far precipitare il DNA. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e lavare il pellet di DNA con il 70% di etanolo secondo le indicazioni del manoscritto.Asciugare completamente il pellet di DNA e quindi scioglierlo nel tampone Tris-HCl. Prima di iniziare, preparare le soluzioni richieste e la miscela di campioni in base alle indicazioni manoscritte. Denaturare il campione di DNA riscaldarlo a 100 gradi Celsius per 10 minuti e quindi posizionarlo sul ghiaccio.Tagliare le dimensioni appropriate di una membrana di nylon e risciacquarla con 6X SSC. Posizionare la membrana su un apparato a macchie di punti e collegare la pompa per vuoto. Individuare punti a sei microliter sulla membrana e ibridare per 30 minuti a 80 gradi Celsius.Quindi, bloccare la membrana del campione con latte privo di grassi e soluzione salina tamponata tris, o TBS, per un'ora. Aggiungere l'anticorpo anti-5-idrossimetilcitosina del coniglio policlonale alla membrana e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lasciare la membrana campione a temperatura ambiente per un'ora, quindi lavare la membrana tre volte con TBS.Incubare la membrana con l'anticorpo secondario anti-coniglio per 30 minuti e quindi lavare tre volte con TBS. Visualizzare i segnali di chemiluminescenza e quantificarne l'intensità. Questo protocollo può essere utilizzato per visualizzare la 5-idrossimetilcitosina, o 5hmC, nell'ippocampo dei topi adulti.Immunofluorescenza con anticorpi contro le cellule neuronali, il 5hmC rivela che c'è un arricchimento di 5hmC nei neuroni. La dinamica di 5hmC durante lo sviluppo neuronale può essere determinata con un saggio dot-blot di campioni di DNA isolati da cellule staminali neurali adulte proliferano e differenziate. I livelli globali di 5hmC aumentano significativamente durante la differenziazione e il livello di 5hmC nei neuroni è più alto che nelle cellule staminali neurali.Il passaggio chiave di questo metodo è assicurarsi che la denaturazione completa dei campioni di DNA.

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Neuroscience

Neuroscienze

Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit analisi può essere utilizzato per analizzare e quantificare 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all'interno di un luogo spe specifico. Il kit distingue 5-5-mC da HMC con l'aggiunta di glucosio al gruppo ossidrilico di 5-HMC tramite una reazione enzimatica che utilizza β-glucosiltransferasi (T4-BGT). Quando 5-HMC si verifica nel contesto di CCGG, questa modifica converte un sito cleavable MspI a un non-cleavable sito.

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in Balb / C tessuto cerebrale

Descritto è un processo a due fasi usando etichettatura β-glucosil (β-GT) per trasferire una azide-glucosio al 5-HMC, seguita dalla chimica click per trasferire un linker biotina per l'arricchimento facile e densità-indipendenti. Questo metodo efficace di etichettatura e specifica consente l'arricchimento di 5-HMC con fondo estremamente basso e high-throughput mappatura epigenomic tramite sequenziamento di prossima generazione.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

Qui si descrive in vivo mutagenesi saggio per un piccolo numero di cellule ematopoietiche purificate utilizzando il modello di topo transgenico LacI. Il gene LacI può essere isolato per determinare la frequenza, la posizione ed il tipo di mutanti DNA sorto spontaneamente o dopo l'esposizione a genotossine.

L&#39;identificazione del DNA Mutazioni in depurata ematopoietiche cellule staminali / progenitrici

La somministrazione di due analoghi della timidina, EdU e BrdU, nei topi in gravidanza permette l'analisi della progressione del ciclo cellulare in cellule progenitrici neurali e nel cervello embrionale mouse. Questo metodo è utile per determinare gli effetti dello stress genotossico, incluse le radiazioni ionizzanti, durante lo sviluppo del cervello.

Valutare progressione del ciclo cellulare delle staminali e cellule progenitrici del cervello di sviluppo del mouse dopo stress genotossico

Qui descriviamo un metodo immunochimico sensibile per mappare la distribuzione spaziale dei derivati di ossidazione 5mC basati sull'uso di anticorpi secondari coniugati con perossidasi e sull'amplificazione del segnale della tiramide.

Il rilevamento di forme modificate di Citosina Uso Sensitive immunoistochimica

Recentemente scoperto forme ossidate di 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) può rappresentare distinte modificazioni del DNA con ruoli funzionali unici. Qui è descritto un flusso di lavoro semi-quantitativa per visualizzazione della distribuzione spaziale di oxi-mCs', profilatura di intensità di segnale e colocalizzazione.

Immunostaining per modificazioni del DNA: analisi computazionale delle immagini Confocal

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

L'obiettivo di questo rapporto è di descrivere il protocollo per rilevazione immunohistochemical robusto di marcatori epigenetici, 5-metilcitosina (5mC) e 5-idrossimetilcitosina (5hmC) nello sviluppo e postmitotic mouse retina.

Rilevazione di Immunohistochemical di 5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina nello sviluppo e Retina di topo Postmitotic

Il saggio di immunoprecipitazione dell'RNA metilato è un metodo a base di anticorpi utilizzato per arricchire i frammenti di RNA metilati. Accoppiato con il sequenziamento profondo, porta all'identificazione di trascrizioni che trasportano la modifica m5C.

Test di immunoprecipitazione dell'RNA metilato per studiare m5C Modifica in Arabidopsis

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

Questo articolo descrive un protocollo per il monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni intatti di zebrafish.

Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti

Scopri come rilevare il 5-idrossimetilcitosina in cellule staminali neurali e cervelli di topi mediante immunofluorescenza e DNA dot-blot. Questo protocollo accessibile facilita lo studio dell'epigenetica neurale.

Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi

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