Genotipizzazione e quantificazione della colorazione dell'ibridazione in situ nel pesce zebra
28 gennaio 2020
Le tecnologie di editing genico hanno permesso ai ricercatori di generare mutanti di pesci zebra per studiare la funzione genica con relativa facilità. Qui, forniamo una guida per eseguire la genotipizzazione embrionale parallela e la quantificazione dei segnali di ibridazione in situ nel pesce zebra. Questo approccio imparziale fornisce una maggiore precisione nelle analisi fenotipiche basate sull'ibridazione in situ.
Le conseguenze delle mutazioni sull'espressione genica sono spesso valutate qualitativamente dall'ibridazione in situ e generalmente valutate visivamente, il che è soggettivo e di parte dalle aspettative del ricercatore. Questo metodo fornisce un modo più coerente per confrontare gli esperimenti in situ quantificando le intensità dell'immagine e rimuove tale distorsione. Questo può anche essere facilmente adattato ad altri sistemi modello che usano l'ibridazione in situ come lettore di un'espressione genica.
Inizia con l'imaging degli embrioni macchiati di ibridazione in situ o ISH. Preparare una soluzione di glicerolo e mescolarla per omogeneizzare. Trasferire gli embrioni alla soluzione di glicerolo con una pipetta Pasteur da tre millilitri e lasciarli depositare per almeno cinque minuti.
Preparare ed etichettare abbastanza tubi PCR per trasferire gli embrioni macchiati di ISH dopo l'imaging, quindi utilizzare una pipetta Pasteur da tre millilitri per aggiungere il 100% di glicerolo sul fondo del pozzo di uno scivolo di depressione del vetro. Trasferire un singolo embrione macchiato di ISH allo scivolo di vetro e orientarlo sotto un microscopio stereo dotato di fotocamera digitale e illuminazione inferiore e superiore. Utilizzando il primo embrione, regolare l'illuminazione e il tempo di esposizione all'ingrandimento desiderato.
Immagine di tutti gli embrioni necessari ed etichetta ogni immagine con un numero univoco. Dopo l'imaging, trasferire ogni embrione su un tubo PCR etichettato con lo stesso numero e, se necessario, aspirare l'eccesso di glicerolo dai tubi PCR. Per estrarre il DNA, aggiungere da 40 a 75 microlitri di un tampone di lysis alcalina come HoTSHOT ad ogni tubo.
Incubare i tubi a 95 gradi Celsius per circa 30 minuti e quindi raffreddarli a quattro gradi Celsius. Aggiungere un volume uguale di buffer di neutralizzazione e procedere con il genotipizzazione per la mutazione di interesse. Per eseguire l'analisi delle immagini, selezionare e aprire l'immagine nelle Figi e invertire facendo clic su Modifica e quindi su Inverti, quindi convertire il tipo di immagine a 8 bit facendo clic sulla scheda Immagine, selezionando Tipo e selezionando 8 bit.
Selezionare lo strumento poligono e disegnare manualmente l'area di interesse o il ROI sull'immagine intorno all'area che contiene il segnale ISH da misurare. Premere T per aprire Gestione ROI e selezionare l'area di interesse, quindi fare clic su Misura. Copiare il valore medio dalla finestra Risultati in un foglio di calcolo.
Per misurare l'intensità dello sfondo, spostare il ROI in un'area dell'embrione senza colorazione e fare clic su Aggiungi nel gestore del ROI. Selezionare l'area di sfondo e fare clic su Misura, quindi registrare il valore di intensità media nel foglio di calcolo. Ottenere l'intensità media in pixel del segnale di ibridazione NC2 sottraendo l'intensità media dello sfondo da quella della regione macchiata.
Dopo aver determinato l'intensità media dei pixel di ogni campione, assegnare un genotipo a ciascun campione. Se il genotipo non può essere determinato, escludere il campione dall'analisi successiva. Ordinare i valori medi di intensità del campione in base al genotipo e procedere con i test statistici.
L'utilità di questa tecnica è stata dimostrata su ISH per dnmt3bb. 1 in embrioni da un incross eterozigote runx1. Una diminuzione di dnmt3bb.
1 espressione è stata rilevata nei mutanti omozigoti runx1 mentre gli embrioni eterozigoti non hanno mostrato differenze significative in dnmt3bb. 1 espressione. Quando si tenta di determinare l'effetto della mutazione lmo4 sull'espressione runx1, questa analisi non ha mostrato differenze significative nell'espressione tra mutanti lmo4 omozigoti.
Tuttavia, una piccola diminuzione dell'espressione runx1 è stata rilevata da un singolo embrione qPCR. In circa lo 0,4% degli embrioni sondati da runx1, l'ISH aveva uno sfondo elevato che ha portato a un numero negativo quando è stato sottratto dal segnale. In questi casi, gli embrioni sono stati esclusi dall'analisi.
Quattro diverse regioni sugli embrioni sono state testate per ottimizzare le correzioni di fondo. Sebbene vi fosse una differenza relativamente stabile nell'intensità del ROI in nessuna delle aree di fondo, R3 mostrava sempre un'intensità maggiore rispetto al ROI e non doveva essere utilizzato per la correzione dello sfondo. R1 e R4 si sono rivelate le aree più appropriate per la correzione dello sfondo.
È importante trovare le migliori condizioni per l'imaging e mantenerle invariate durante l'esperimento. Si consiglia inoltre di quantificare l'intensità dei pixel prima di assegnare un genotipo a ciascun campione.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per il genotipaggio parallelo degli embrioni e la quantificazione dei segnali di ibridazione in situ nel pesce zebra. Utilizzando questo approccio privo di bias, i ricercatori possono ottenere una maggiore accuratezza nelle analisi fenotipiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Le tecnologie di editing genico facilitano la generazione di mutanti di pesce zebra.
- L'ibridazione in situ è un metodo comune per valutare l'espressione genica.
- I metodi tradizionali di valutazione possono introdurre bias e soggettività.
- Questo studio mira a fornire un approccio più coerente e quantitativo.
Scopo dello studio
- Per migliorare l'accuratezza delle analisi fenotipiche nel pesce zebra.
- Fornire un metodo standardizzato per il genotipaggio degli embrioni.
- Per quantificare in modo oggettivo i segnali di ibridazione in situ.
Metodi Utilizzati
- Acquisizione di immagini di embrioni colorati con ISH utilizzando un microscopio stereoscopico.
- Preparazione di soluzioni di glicerolo per il trasferimento degli embrioni.
- Utilizzo di un tampone di lisi alcalina per l'estrazione del DNA.
- Impiego del software Fiji per l'analisi e la quantificazione delle immagini.
Risultati principali
- Dimostrato una riduzione dell'espressione di dnmt3bb.1 nei mutanti omozigoti per runx1.
- Identificate aree appropriate per la correzione del fondo da utilizzare nell'analisi delle immagini.
- Non sono state osservate differenze significative nell'espressione tra il tipo selvatico e i mutanti omozigoti per lmo4.
- Fornito un metodo affidabile per assegnare i genotipi in base all'intensità dei pixel.
Conclusioni
- Il metodo migliora l'affidabilità dell'analisi dell'espressione genica.
- Può essere adattato per l'uso in altri sistemi modello.
- È fondamentale mantenere condizioni di imaging costanti per ottenere risultati accurati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
L'analisi quantitativa di ibridazione in situ riduce la soggettività nella valutazione dell'espressione genica, migliorando l'affidabilità dei dati per la validazione di bersagli in modelli di zebrafish. Questo approccio favorisce la riduzione del rischio meccanicistico consentendo una correlazione imparziale tra genotipo e modelli di espressione fenotipica. Il metodo aumenta la sicurezza predittiva nella fase iniziale della scoperta fornendo misurazioni standardizzate e riproducibili su campioni con genotipi misti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso la quantificazione senza pregiudizi di segnali di espressione genica localizzati nello spazio.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro uniforme per confrontare fenotipi di tipo mutante e di tipo selvatico eliminando i bias dell'osservatore.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafoglio distinguendo i cambiamenti significativi di espressione dal rumore di fondo nei modelli genetici.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi, stabilendo profili di espressione di base.
- Riproducibilità: Standardizza i protocolli di acquisizione e analisi delle immagini per ridurre al minimo la variabilità tra esperimenti.
- Output quantitativo: Genera dati misurabili di intensità dei pixel adatti al confronto statistico tra gruppi trattati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Mantiene la coerenza dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica, utilizzando letture fenotipiche oggettive.
- Allineamento del Biomarcatore: Facilita la correlazione tra modifiche nell'espressione genica e lo stato genotipico per lo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Decisioni Adeguate al Rischio: Permette decisioni di avanzamento basate sui dati, riducendo i falsi positivi negli studi di validazione del bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della scoperta precoce collegando la conferma genotipica con la valutazione fenotipica quantitativa, sostenendo l'identificazione dei composti guida attraverso la riduzione del rischio meccanicistico.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi fornendo dati quantitativi sulla distribuzione dell'mRNA per chiarire la funzione genica nei percorsi dello sviluppo.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi attraverso condizioni riproducibili di acquisizione e analisi delle immagini, garantendo una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative dell'intensità e valori corretti per il fondo, che consentono il confronto statistico tra condizioni sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Collega i risultati della scoperta alla continuità preclinica assicurando una valutazione fenotipica coerente tra diversi sistemi modello.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma di genotipizzazione e quantificazione riutilizzabile, applicabile a multipli geni e linee mutanti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei dati di espressione genica.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità attraverso protocolli standardizzati per la manipolazione degli embrioni e l'analisi delle immagini.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati oggettivi per l'allocazione del capitale in programmi precoci.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione aggiustata per il rischio distinguendo effetti biologici reali dalla variabilità tecnica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione di embrioni di pesce zebra, microscopia e tecniche di genotipizzazione di base.
- È dipendente da una microscopia stereoscopica dotata di capacità di acquisizione digitale e del software Fiji per l'analisi.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alle condizioni di acquisizione, ai tempi di esposizione e alle aree di correzione del fondo.
- Comporta considerazioni di adattamento per diverse ceppi di pesce zebra e stadi di sviluppo.
- Include limitazioni pratiche, come l'ottimizzazione della correzione del fondo e l'esclusione di campioni con genotipi indeterminati o con rumore di fondo elevato.
