Genotipizzazione e quantificazione della colorazione dell'ibridazione in situ nel pesce zebra

Le conseguenze delle mutazioni sull’espressione genica sono spesso valutate qualitativamente dall’ibridazione in situ e generalmente valutate visivamente, il che è soggettivo e di parte dalle aspettative del ricercatore. Questo metodo fornisce un modo più coerente per confrontare gli esperimenti in situ quantificando le intensità dell’immagine e rimuove tale distorsione. Questo può anche essere facilmente adattato ad altri sistemi modello che usano l’ibridazione in situ come lettore di un’espressione genica.

Inizia con l’imaging degli embrioni macchiati di ibridazione in situ o ISH. Preparare una soluzione di glicerolo e mescolarla per omogeneizzare. Trasferire gli embrioni alla soluzione di glicerolo con una pipetta Pasteur da tre millilitri e lasciarli depositare per almeno cinque minuti.

Preparare ed etichettare abbastanza tubi PCR per trasferire gli embrioni macchiati di ISH dopo l’imaging, quindi utilizzare una pipetta Pasteur da tre millilitri per aggiungere il 100% di glicerolo sul fondo del pozzo di uno scivolo di depressione del vetro. Trasferire un singolo embrione macchiato di ISH allo scivolo di vetro e orientarlo sotto un microscopio stereo dotato di fotocamera digitale e illuminazione inferiore e superiore. Utilizzando il primo embrione, regolare l’illuminazione e il tempo di esposizione all’ingrandimento desiderato.

Immagine di tutti gli embrioni necessari ed etichetta ogni immagine con un numero univoco. Dopo l’imaging, trasferire ogni embrione su un tubo PCR etichettato con lo stesso numero e, se necessario, aspirare l’eccesso di glicerolo dai tubi PCR. Per estrarre il DNA, aggiungere da 40 a 75 microlitri di un tampone di lysis alcalina come HoTSHOT ad ogni tubo.

Incubare i tubi a 95 gradi Celsius per circa 30 minuti e quindi raffreddarli a quattro gradi Celsius. Aggiungere un volume uguale di buffer di neutralizzazione e procedere con il genotipizzazione per la mutazione di interesse. Per eseguire l’analisi delle immagini, selezionare e aprire l’immagine nelle Figi e invertire facendo clic su Modifica e quindi su Inverti, quindi convertire il tipo di immagine a 8 bit facendo clic sulla scheda Immagine, selezionando Tipo e selezionando 8 bit.

Selezionare lo strumento poligono e disegnare manualmente l’area di interesse o il ROI sull’immagine intorno all’area che contiene il segnale ISH da misurare. Premere T per aprire Gestione ROI e selezionare l’area di interesse, quindi fare clic su Misura. Copiare il valore medio dalla finestra Risultati in un foglio di calcolo.

Per misurare l’intensità dello sfondo, spostare il ROI in un’area dell’embrione senza colorazione e fare clic su Aggiungi nel gestore del ROI. Selezionare l’area di sfondo e fare clic su Misura, quindi registrare il valore di intensità media nel foglio di calcolo. Ottenere l’intensità media in pixel del segnale di ibridazione NC2 sottraendo l’intensità media dello sfondo da quella della regione macchiata.

Dopo aver determinato l’intensità media dei pixel di ogni campione, assegnare un genotipo a ciascun campione. Se il genotipo non può essere determinato, escludere il campione dall’analisi successiva. Ordinare i valori medi di intensità del campione in base al genotipo e procedere con i test statistici.

L’utilità di questa tecnica è stata dimostrata su ISH per dnmt3bb. 1 in embrioni da un incross eterozigote runx1. Una diminuzione di dnmt3bb.

1 espressione è stata rilevata nei mutanti omozigoti runx1 mentre gli embrioni eterozigoti non hanno mostrato differenze significative in dnmt3bb. 1 espressione. Quando si tenta di determinare l’effetto della mutazione lmo4 sull’espressione runx1, questa analisi non ha mostrato differenze significative nell’espressione tra mutanti lmo4 omozigoti.

Tuttavia, una piccola diminuzione dell’espressione runx1 è stata rilevata da un singolo embrione qPCR. In circa lo 0,4% degli embrioni sondati da runx1, l’ISH aveva uno sfondo elevato che ha portato a un numero negativo quando è stato sottratto dal segnale. In questi casi, gli embrioni sono stati esclusi dall’analisi.

Quattro diverse regioni sugli embrioni sono state testate per ottimizzare le correzioni di fondo. Sebbene vi fosse una differenza relativamente stabile nell’intensità del ROI in nessuna delle aree di fondo, R3 mostrava sempre un’intensità maggiore rispetto al ROI e non doveva essere utilizzato per la correzione dello sfondo. R1 e R4 si sono rivelate le aree più appropriate per la correzione dello sfondo.

È importante trovare le migliori condizioni per l’imaging e mantenerle invariate durante l’esperimento. Si consiglia inoltre di quantificare l’intensità dei pixel prima di assegnare un genotipo a ciascun campione.