Genotipizzazione e quantificazione della colorazione dell'ibridazione in situ nel pesce zebra
January 28th, 2020
Le tecnologie di editing genico hanno permesso ai ricercatori di generare mutanti di pesci zebra per studiare la funzione genica con relativa facilità. Qui, forniamo una guida per eseguire la genotipizzazione embrionale parallela e la quantificazione dei segnali di ibridazione in situ nel pesce zebra. Questo approccio imparziale fornisce una maggiore precisione nelle analisi fenotipiche basate sull'ibridazione in situ.
Le conseguenze delle mutazioni sull'espressione genica sono spesso valutate qualitativamente dall'ibridazione in situ e generalmente valutate visivamente, il che è soggettivo e di parte dalle aspettative del ricercatore. Questo metodo fornisce un modo più coerente per confrontare gli esperimenti in situ quantificando le intensità dell'immagine e rimuove tale distorsione. Questo può anche essere facilmente adattato ad altri sistemi modello che usano l'ibridazione in situ come lettore di un'espressione genica.
Inizia con l'imaging degli embrioni macchiati di ibridazione in situ o ISH. Preparare una soluzione di glicerolo e mescolarla per omogeneizzare. Trasferire gli embrioni alla soluzione di glicerolo con una pipetta Pasteur da tre millilitri e lasciarli depositare per almeno cinque minuti.
Preparare ed etichettare abbastanza tubi PCR per trasferire gli embrioni macchiati di ISH dopo l'imaging, quindi utilizzare una pipetta Pasteur da tre millilitri per aggiungere il 100% di glicerolo sul fondo del pozzo di uno scivolo di depressione del vetro. Trasferire un singolo embrione macchiato di ISH allo scivolo di vetro e orientarlo sotto un microscopio stereo dotato di fotocamera digitale e illuminazione inferiore e superiore. Utilizzando il primo embrione, regolare l'illuminazione e il tempo di esposizione all'ingrandimento desiderato.
Immagine di tutti gli embrioni necessari ed etichetta ogni immagine con un numero univoco. Dopo l'imaging, trasferire ogni embrione su un tubo PCR etichettato con lo stesso numero e, se necessario, aspirare l'eccesso di glicerolo dai tubi PCR. Per estrarre il DNA, aggiungere da 40 a 75 microlitri di un tampone di lysis alcalina come HoTSHOT ad ogni tubo.
Incubare i tubi a 95 gradi Celsius per circa 30 minuti e quindi raffreddarli a quattro gradi Celsius. Aggiungere un volume uguale di buffer di neutralizzazione e procedere con il genotipizzazione per la mutazione di interesse. Per eseguire l'analisi delle immagini, selezionare e aprire l'immagine nelle Figi e invertire facendo clic su Modifica e quindi su Inverti, quindi convertire il tipo di immagine a 8 bit facendo clic sulla scheda Immagine, selezionando Tipo e selezionando 8 bit.
Selezionare lo strumento poligono e disegnare manualmente l'area di interesse o il ROI sull'immagine intorno all'area che contiene il segnale ISH da misurare. Premere T per aprire Gestione ROI e selezionare l'area di interesse, quindi fare clic su Misura. Copiare il valore medio dalla finestra Risultati in un foglio di calcolo.
Per misurare l'intensità dello sfondo, spostare il ROI in un'area dell'embrione senza colorazione e fare clic su Aggiungi nel gestore del ROI. Selezionare l'area di sfondo e fare clic su Misura, quindi registrare il valore di intensità media nel foglio di calcolo. Ottenere l'intensità media in pixel del segnale di ibridazione NC2 sottraendo l'intensità media dello sfondo da quella della regione macchiata.
Dopo aver determinato l'intensità media dei pixel di ogni campione, assegnare un genotipo a ciascun campione. Se il genotipo non può essere determinato, escludere il campione dall'analisi successiva. Ordinare i valori medi di intensità del campione in base al genotipo e procedere con i test statistici.
L'utilità di questa tecnica è stata dimostrata su ISH per dnmt3bb. 1 in embrioni da un incross eterozigote runx1. Una diminuzione di dnmt3bb.
1 espressione è stata rilevata nei mutanti omozigoti runx1 mentre gli embrioni eterozigoti non hanno mostrato differenze significative in dnmt3bb. 1 espressione. Quando si tenta di determinare l'effetto della mutazione lmo4 sull'espressione runx1, questa analisi non ha mostrato differenze significative nell'espressione tra mutanti lmo4 omozigoti.
Tuttavia, una piccola diminuzione dell'espressione runx1 è stata rilevata da un singolo embrione qPCR. In circa lo 0,4% degli embrioni sondati da runx1, l'ISH aveva uno sfondo elevato che ha portato a un numero negativo quando è stato sottratto dal segnale. In questi casi, gli embrioni sono stati esclusi dall'analisi.
Quattro diverse regioni sugli embrioni sono state testate per ottimizzare le correzioni di fondo. Sebbene vi fosse una differenza relativamente stabile nell'intensità del ROI in nessuna delle aree di fondo, R3 mostrava sempre un'intensità maggiore rispetto al ROI e non doveva essere utilizzato per la correzione dello sfondo. R1 e R4 si sono rivelate le aree più appropriate per la correzione dello sfondo.
È importante trovare le migliori condizioni per l'imaging e mantenerle invariate durante l'esperimento. Si consiglia inoltre di quantificare l'intensità dei pixel prima di assegnare un genotipo a ciascun campione.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per la genotipizzazione parallela degli embrioni e la quantificazione dei segnali di ibridazione in situ nei pesci zebra. Utilizzando questo approccio imparziale, i ricercatori possono ottenere una maggiore accuratezza nelle analisi fenotipiche.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Genetica
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- Le tecnologie di editing genetico facilitano la generazione di mutanti di pesci zebra.
- L'ibridazione in situ è un metodo comune per valutare l'espressione genica.
- I metodi di punteggio tradizionali possono introdurre pregiudizi e soggettività.
- Questo studio mira a fornire un approccio più coerente e quantitativo.
Obiettivo dello studio
- Migliorare l'accuratezza delle analisi fenotipiche nei pesci zebra.
- Fornire un metodo standardizzato per la genotipizzazione degli embrioni.
- Quantificare oggettivamente i segnali di ibridazione in situ.
Metodi utilizzati
- Imaging degli embrioni colorati con ISH utilizzando un microscopio stereo.
- Preparazione di soluzioni di glicerolo per il trasferimento degli embrioni.
- Utilizzo di buffer di lisi alcalina per l'estrazione del DNA.
- Impiego del software Fiji per l'analisi e la quantificazione delle immagini.
Risultati principali
- Ha dimostrato una diminuzione dell'espressione di dnmt3bb.1 nei mutanti omozigoti runx1.
- Ha identificato aree di correzione di sfondo appropriate per l'analisi delle immagini.
- Non ha mostrato differenze significative nell'espressione tra il tipo selvatico e i mutanti omozigoti lmo4.
- Ha fornito un metodo affidabile per l'assegnazione dei genotipi basata sull'intensità dei pixel.
Conclusioni
- Il metodo migliora l'affidabilità dell'analisi dell'espressione genica.
- Può essere adattato per l'uso in altri sistemi modello.
- Mantenere condizioni di imaging coerenti è cruciale per ottenere risultati accurati.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
