Name: Produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Scopri la produzione di epatosfere 3D da cellule staminali pluripotenti umane con un sistema di coltura definito. Questo metodo controlla le dimensioni delle sfere epatiche per applicazioni in modellazione di malattie e screening farmacologico.

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Questo studio è stato sostenuto con premi dalla piattaforma britannica di medicina rigenerativa (MRC MRC MR/L022974/1) e dall'Ufficio del Chief Scientist (TCS/16/37).

1. Preparazione di muffe agarose micropiastra
 NOT:</</c0> I supporti utilizzati per questi esperimenti devono essere sterili e a temperatura ambiente (RT) per la coltura cellulare.
<ol><li>
Preparare 2% stampi agarose.
	<ol>
<li>Sciogliere 2 g di agarose a bassa temperatura di fusione in 100 mL di acqua distillata sterilizzata. Riscaldare con attenzione in un forno a microonde con agitazione a intervalli per sciogliersi completamente.</li>
		<li>Aggiungere 520 l di agarose fuso a uno stampo di formato 256-well e lasciare solidificare.</li>
		<li>Trasferire ogni micropiastra di agarose in un unico pozzo di una piastra di 12 pozze.</li>
		<li>Aggiungete 1,5 mL di 1x salina con buffer fosfatidi (DPBS) con Ca2o/Mg2 a ciascun pozzo e rimuovete le bolle d'aria dai micropozzi pipettando delicatamente su e giù più volte utilizzando una punta di pipetta P1000. Questa operazione viene eseguita per garantire una semina uniforme delle cellule. NOT:</</c4> Le microplacche di Agarose possono essere conservate fino a 6 mesi a 4 gradi centigradi in 1x DPBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Semina cellule staminali Pluripotenti umane in piastre di microwell di Agarose
<ol><li>
Preparazione della sospensione cellulare
	<ol>
<li>Aspirare il mezzo da una cultura indifferenziata di hPSC come descritto in precedenza8. NOTA: gli hPSC sono coltivati su LN-521 in mTeSR1 con il mezzo cambiato ogni 24 h, e passati regolarmente una volta che le cellule raggiungono 75% a 85% di confluenza come descritto in precedenza8.</li>
		<li>Sciacquare le celle con 5 mL di RT 1x DPBS senza Ca2o Mg2 e rimuovere il buffer.</li>
		<li>Aggiungere alle cellule 5 mL di reagente di dissociazione 1x (Tabella dei materiali) e consentire la dissociazione cellulare incubando le cellule a 37 gradi centigradi per 6-8 min. NOT:</</c8> Per fermare la reazione, esaminare il distacco cellulare al microscopio. Le cellule devono essere parzialmente staccate dalla piastra. Estendere l'incubazione per un extra 1-2 min se è richiesto più tempo.</li>
		<li>Interrompere la reazione rimuovendo il reagente di dissociazione cellulare e aggiungere 5 mL di mTe mL fresco mTeSR1 medio integrato con 10 M Rho-associated chinase (ROCK) inibitore Y27632 alle cellule. Dissociare le cellule pipettando su e giù più volte utilizzando una punta pipetta P1000.</li>
		<li>Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro e l'esclusione di colorazione blu trypan. A seguito di questo, preparare la sospensione cellulare alla concentrazione richiesta.</li>
		<li>Calcolare il numero totale di celle necessarie. Per la differenziazione dell'epatosfera 3D, seme 3,84 x 105 cellule per microplacca agarosa per generare sferoidi con 100-150 m di diametro.</li>
		<li>Trasferire il numero desiderato di cellule in uno sterile tubo centrifuga di 15 mL o 50 mL e centrifugare il tubo a 200 x g per 5 min a RT per pellet le cellule.</li>
		<li>Aspirare e scartare le cellule sovratallore e risospendere in mTeSR1 medio più 10 - M inibitore ROCK Y27632. Diluire il pellet cellulare nel volume appropriato di media per una concentrazione finale di 2,1 x 106 celle / mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Semina le cellule alle microplacche ad agarose preparate NOTA: Se si utilizzano microplacini di agarose conservati in frigorifero, metterli nell'incubatrice cellulare a 37 gradi per almeno un'ora prima dell'uso e aspirare il DPBS 1x dal ben prima della semina cellulare.<ol>
<li>Aggiungere 190 l della sospensione cellulare nel micropo di agarose.</li>
		<li>Dopo la semina, riportare le piastre all'incubatrice cellulare a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 2 h per consentire alle cellule di stabilirsi.</li>
		<li>Dopo 2 h, aggiungere 1 mL di mTeSR1 fresco e caldo medio integrato con 10 s M inibitore ROCK Y27632 ad ogni pozzo.</li>
		<li>Riportare le piastre all'incubatrice cellulare a 37 e 5% di CO2 per 24 h ed esaminare la formazione di sfere il giorno successivo per consentire alle cellule di attaccarsi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Differenziazione degli hPSC alle epatite 3D su Agarose Microwells
<ol><li>Preparazione di pozze rivestiti in poli-idrossito (poli-HEMA)
	<ol>
<li>Sciogliere 2 g di poli-HEMA in 100 mL del 95% di etanolo. Mescolare la soluzione per una notte con una piastra calda a 55 gradi centigradi. Aggiungete 250 gradi di soluzione poli-HEMA per pozzo di una piastra da 24 pozzetti e asciugate pernottamento a 60 gradi centigradi con un forno.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del mezzo di differenziazione
	<ol>
<li>Preparare una soluzione stock di 1.000 volte dell'attivivita A sciogliendo l'attivino a reddititta umana Una proteina liofilizzata nello sterile 0,2% di albumina di siero bovino (BSA)/DPBS ad una concentrazione finale di 100 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.</li>
		<li>Preparare una soluzione di riserva di 1.000 volte di Wnt3a sciogliendo la proteina linofilizzata Wnt3a del topo nello sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare all'1:200.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 1.000 x del fattore di crescita umano dell'epatocito (HGF) sciogliendo la proteina liofilizzata HGF umana nello sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.</li>
		<li>Preparare una soluzione di stock 1.000x di oncostatinM (OSM) sciogliendo OSM in sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 20 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.</li>
		<li>Preparare una soluzione di stock 1000x del fattore di crescita epiteliale (EGF) sciogliendo la proteina liofilizzata nello sterile 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.</li>
		<li>Preparare una soluzione di riserva di 1.000 volte il fattore di crescita del fibroblasto di base (bFGF) sciogliendo la proteina liofilizzata nello zerfo 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.</li>
		<li>Preparare una soluzione di riserva di 1.000 volte il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) sciogliendo la proteina liofilizzata nello 0,2% BSA/DPBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL. Conservare a -20 gradi centigradi in piccoli aliquote. Utilizzare a 1:1,000.</li>
		<li>Rendere il mezzo di differenziazione dell'endodermico costituito da Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) mezzo basale integrato con 2% B27 supplemento (50x, senza insulina), e 1% penicillina / streptomicina (concentrazioni finali: 100 IU/mL e 100 g/mL, rispettivamente). A meno che indicato, ad ogni cambiamento medio, integrare il volume richiesto con Wnt3a e activin A ad una concentrazione finale di 50 ng/mL e 100 ng/mL, rispettivamente. NOT:</</c2> Conservare a 4 gradi centigradi e utilizzare entro due settimane.</li>
		<li>Rendere il mezzo di differenziazione dell'epatoblasto costituito dal mezzo Eagle modificato di Dulbecco (KO-DMEM) di knockout con la sostituzione del siero da urlo del 20% (KOSR) e integrato con lo 0,5% di un integratore alternativo alla glutammina, l'1% di amminoacidi non essenziali (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoetanolo, 1% di solfuro dimetilo (DMSO) e 1% penicillina/streptomicina (concentrazioni finali rispettivamente a 100 IU/mL e 100 g/mL). Filtrare sotto vuoto. NOT:</</c3> Conservare a 4 gradi centigradi e utilizzare entro due settimane.</li>
		<li>Rendere il mezzo di maturazione dell'epatocite costituito da mezzo epatocite integrato con l'1% di un integratore alternativo a L-glutamine, 10 hydrocortisone 21-emisucciato sale di sodio (HCC), 1% penicillina / streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e rispettivamente 100 g/mL. Per ogni cambiamento medio, integrare il volume richiesto con OSM e HGF (concentrazioni finali a 20 ng/mL e 10 ng/mL, rispettivamente). NOT:</</c4> Conservare il brodo a 4 gradi centigradi e utilizzarlo entro due settimane.</li>
		<li>Rendere il mezzo di manutenzione dell'epatocite costituito da Un mezzo e l'epatocite di William's E, integrato con la sostituzione del siero al 10%, costituito dall'1% di un integratore alternativo a L-glutamine, 1% di penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100 g/mL, rispettivamente). Per ogni variazione media, integrare il volume richiesto con HGF, EGF, bFGF e VEGF (concentrazione finale di ogni fattore di crescita a 10 ng/mL). NOT:</</c5> Conservare il brodo a 4 gradi centigradi e utilizzarlo entro due settimane.</li>
	</ol></li>
	<li>Controllare la formazione dell'epatosfera 24 h post seeding e avviare la differenziazione degli epatociti. Rimuovere con attenzione il mezzo mTeSR1 e sostituirlo con 1 mL di mezzo di differenziazione endodermi fresco integrato con 100 ng/mL activin A e 50 ng/mL Wnt3a.</li>
	<li>Cambio integrato endoderm priming medium ogni 24 h per 3 giorni per hESCs. Quando si lavora con hiPSC, estendere questa fase per altri 2 giorni integrando i media con activin A (100ng/mL) da solo.</li>
	<li>Dopo l'induzione definitiva dell'endodermi, passare al mezzo di differenziazione dell'epatoblasto per la specifica dell'epatoblasto per 5 giorni sostituendo il mezzo ogni 2 giorni ed eseguire l'ultimo cambiamento l'ultimo giorno della specifica dell'epatoblasto.</li>
	<li>Trasferire epatosfere nei pozze rivestite poli-HEMA.
	<ol>
<li>Lavare le cellule una volta con il mezzo di maturazione dell'epatocite senza integratori dopo aver rimosso il mezzo KSR/DMSO medio e aggiungere 1 mL di mezzo di maturazione epatite integrato con 10 ng/mL HGF e 20 ng/mL OSM.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta P1000, sollevare le epatosfere dalla micropiastra agarose pipetting su e giù per la soluzione più volte.</li>
		<li>Trasferire il mezzo contenente le epatosfere in un pozzo poli-HEMA rivestito.</li>
		<li>Lavare la micropiastra di agarose utilizzando 1 mL di mezzo di maturazione dell'epatocito integrato con 10 ng/mL HGF e 20 ng/mL OSM e trasferire il mezzo al pozzo rivestito poli-HEMA.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 3.6.4 più volte possibile per trasferire tutte le epatosfere dalla microplacca agarose. NOT:</</c2> È fondamentale pipetta con attenzione su e giù per la soluzione contenente le epatosfere per evitare di danneggiarle.</li>
	</ol></li>
	<li>Aspirare con attenzione il mezzo in eccesso senza rimuovere le epatosfere utilizzando una pipetta P100 fino a 1 mL di mezzo contenente le epatosfere rimane nel pozzo poli-HEMA rivestito.</li>
	<li>Cambiare il mezzo ogni 48 h per 12 giorni.</li>
	<li>Al giorno 20 quando si lavora con hESC o giorno 22 se si lavora con hiPSC, passare il mezzo a supporto di manutenzione epatocitico.
	<ol>
<li>Rimuovere il mezzo di maturazione dell'epatocite e lavare le cellule una volta con il mezzo di manutenzione epatocite senza gli integratori. Aggiungere 1 mL di mezzo di manutenzione epatocite integrato con 10 ng/mL di HGF, EGF, FGF e VEGF.</li>
	</ol></li>
	<li>Cambiare il mezzo per il mezzo di manutenzione epatocite fresco ogni 48 h.</li>
</ol>4. Analisi funzionale delle epatie 3D coltivate a lungo termine
<ol><li>Passare al mezzo di maturazione dell'epatocito integrato rispettivamente con 10 M di HCC, L-glutamine, 1% penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100g/mL, rispettivamente) e 10 ng/mL HGF 48 h prima di eseguire l'analisi funzionale.</li>
	<li>
Analizzare la funzione metabolica dell'epatocito utilizzando i saggi citocromatici (CYP) P450.
	<ol>
<li>Sostituire il substrato medio con 1 mL di maturazione dell'epatocito fresco integrato con un substrato di etere lucidferina-6'-pentafluoro-benzyl (luciferin-PFBE) per rilevare l'attività basale CYP3A o il substrato di 100 etere luciferina-metilare (luciferin-ME) per rilevare CYP1A2 attività basale (numero di repliche n. 3). Utilizzare i media di coltura dei tessuti come controllo negativo. NOT:</</c2> Al fine di evitare la reattività incrociata, si consiglia di non utilizzare gli stessi pozzi contenenti epatosfere 3D per testare diverse attività CYP P450 ma di eseguirle in singoli pozzi.</li>
		<li>Incubano le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Raccogliere i supernatanti utilizzando una punta di pipetta P100 ed eseguire il saggio come da istruzioni del produttore.</li>
		<li>Misurare i livelli relativi di attività basale e normalizzare per proteina mg come determinato dal saggio di acido bicinchoninico (BCA).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Testare la produzione di proteine del siero utilizzando un test dell'immunosorbent sfondanti enzimatico (ELISA).
	<ol>
<li>Sostituire medio con 1 mL di medio di maturazione epatocito fresco integrato con 10 ng/mL HGF e 20 ng/mL OSM (numero di repliche : 3). Utilizzare i media di coltura dei tessuti come controllo negativo.</li>
		<li>Incubano le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Raccogliere il supernatante utilizzando una punta pipetta P100 e misurare i livelli relativi di produzione di proteine del siero come da istruzioni del produttore.</li>
		<li>Normalizzare per proteine per mg come determinato dal saggio BCA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immunocitochimica
<ol><li>
Preparazione di sezioni di paraffina contenenti epatosfere.
	<ol>
<li>Lavare le epatosfere tre volte con 1x DPBS.</li>
		<li>Fissare le epatosfere con metanolo ghiacciato per 30 min.</li>
		<li>Lavare tre volte con 1x DPBS.</li>
		<li>Incorporare le epotosfere in 300 gradi di una soluzione temperata del 2% di agarose sciolta in H2O utilizzando un pozzo vuoto di una piastra di 24 piani come stampo e lasciarla solidificare per 30 min.</li>
		<li>Incorporare l'agarose contenente epatosfere in paraffina.</li>
		<li>Sezionare il blocco di paraffina contenente epatosfere fisse in sezioni spesse 4 m utilizzando un microtoma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De-ceretta e reidratazione delle sezioni. NOTA: utilizzare soluzioni fresche ogni volta che è possibile. Non utilizzare soluzioni che sono state sul trogolo di colorazione per più di una settimana.<ol>
<li>Posizionare le sezioni in un rack di diapositive.</li>
		<li>Immergere il rack scorrevole contenente sezioni in una macchiatura contenente 300 mL di xilene per 5 min.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 5.2.2.</li>
		<li>Immergiti nell'etanolo assoluto per 20 s.</li>
		<li>Immergiti nel 95% di etanolo per 20 s.</li>
		<li>Immergiti nel 90% di etanolo per 20 s.</li>
		<li>Immergiti nell'80% di etanolo per 20 s.</li>
		<li>Immergiti nel 70% di etanolo per 20 s.</li>
		<li>Reidratare le sezioni con acqua per 5 min. NOT:</</c5> Mantenere le diapositive nello stesso rack di diapositive e spostarlo da una barra di colorazione a quella successiva. Il volume utilizzato (in genere 300 mL) dipende dalle dimensioni della depressione di colorazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recupero di antigeni di sezioni di paraffina contenenti epatosfere.
	<ol>
<li>Le sezioni di calore decerate e reidratate in 1x soluzione cuscinetto 1x Tris-EDTA (TE) pH 9.0 per 15 minuti in un microonde a 800 W.</li>
		<li>Raffreddare i campioni immergendoli nell'acqua del rubinetto per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining.
	<ol>
<li>Incuba diapositive con soluzione di blocco in PBS con 0,1% di polisoro20 (PBS/T)/10% BSA per 1 h a RT.</li>
		<li>Sostituire la soluzione di blocco con l'anticorpo primario appropriato diluito in PBS/T/1% BSA e incubare a 4 gradi centigradi con agitazione delicata durante la notte.</li>
		<li>Lavare le cellule con PBS/T per 5 min e ripetere tre volte.</li>
		<li>Incubare con l'anticorpo secondario appropriato diluito in PBS/T/1% BSA e incubare al buio a RT per 1 h con agitazione delicata. NOT:</</c10> Gli anticorpi primari e secondari ottimizzati sono elencati in Tabella dei materiali.</li>
		<li>Lavare le cellule con PBS/T per 5 min e ripetere tre volte.</li>
		<li>Aggiungere 4',6-diamidino-2-fenilitinal (DAPI) alle cellule secondo le istruzioni del produttore e posizionare delicatamente un coperchio di vetro per ridurre le bolle d'aria. Mantenere le celle fisse a 4 gradi centigradi al buio. Osservare la colorazione al microscopio con un filtro appropriato e una lampada fluorescente. NOTA: Conservare le piastre a 4 gradi centigradi al buio fino all'imaging.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

David C. Hay è co-fondatore e azionista di Stemnovate Ltd e HigherSteaks Ltd. Il resto degli autori certifica di non avere conflitti di interesse nell'argomento o nei materiali discussi in questo articolo.

Lo sviluppo di sistemi definiti e xeno-free per produrre epatosfere umane in 3D è necessario sia per gli sforzi in vitro che per quelli in vivo. Attualmente la maggior parte degli approcci di differenziazione degli epatociti dalle cellule staminali pluripotenti umane viene eseguita in colture bidimensionali aderenti. Questi ambienti mancano di molti dei segnali ambientali coinvolti nella genesi dei tessuti e l'omeostasi che includono; interazioni di cellule eterotipiche, produzione di matrici e rimodellamento, con conseguente scarsa traduzione alla biologia in vivo18,19.
Di conseguenza, la ricerca si è concentrata su approcci alternativi per generare epatosfere da cellule staminali pluripotenti. Una serie di studi 3D hanno avanzato il campo, ma questi si basano su prodotti di origine animale20,22,24 per fornire supporto e/o richiedono l'uso del tessuto umano21,22 che complica scalabilità e compromissione della tecnologia e compromissione sperimentale e l'applicazione.
La procedura descritta nel nostro articolo (Figura 1) è definita, efficiente, altamente riproducibile e conveniente, consentendo la produzione di sfere epatiche funzionali, che rimangono funzionali per un anno in vitro e forniscono supporto epatico critico in vivo14. È importante sottolineare che questa piattaforma consente all'utente di controllare le dimensioni delle sfere epatiche 3D, limitando la formazione di centri necrotici densi e la perdita di fenotipo.
Il trasferimento delle epatosfere 3D alle piastre rivestite poli-HEMA rappresenta un passo critico in questo protocollo. È importante pipetta delicatamente in questa fase della procedura per evitare di danneggiare la sfera. Inoltre, i cambiamenti dei supporti devono essere eseguiti con attenzione per evitare lo stress da taglio e la distorsione della struttura della sfera.
In questi studi, le epatosfere 3D mostravano una struttura organizzata (Figura 2 e Figura 3), funzione P450 citocromatica ( Figura4) e proteine epatiche secrete, tra cui albumina e alfa-fetoproteina (Figura 5). Questa procedura è stata eseguita con successo in quattro linee di cellule staminali pluripotenti con risultati comparabili. Guardando al futuro, questa tecnologia potrebbe essere impiegata come piattaforma per sviluppare ulteriori tessuti endodermici e mesenchymicon con architetture complesse.

La capacità delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) di auto-rinnovarsi, pur mantenendo la pluripotenza, offre l'opportunità di produrre tipi di cellule umane e tessuti su richiesta. Gli hPSC sono stati differenziati in modo efficiente in celle simili a epatociti (HLC) utilizzando sistemi di coltura aderenti bidimensionali (2D)1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Questi sistemi sono stati utilizzati per modellare con successo la malattia monogenica, il ciclo di vita dei virus, le lesioni epatiche indotte dai farmaci (DILI), l'esposizione fetale alle tossine e la malattia epatica grassa non alcolica (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Tuttavia, questi modelli possiedono alcuni inconvenienti, che limitano il loro uso di routine. Questi includono l'espressione del marcatore fetale, il fenotipo instabile e la scarsa architettura tissutale16,17,18,19, che potrebbe anche limitare l'estrapolazione alla funzione dell'organo in vivo.
Per superare questi limiti, sono state sviluppate piattaforme di differenziazione tridimensionali (3D) per simulare l'architettura dei tessuti in vivo. Pur abilitando, tali approcci si basano sull'uso di prodotti e matrici di origine animale per guidare la genesi dei tessuti20,21,22, limitando l'aprono e l'applicazione diffusa.
Qui, dettagliamo le procedure per generare grandi quantità di epatosfere 3D da hPSC utilizzando materiali definiti e auto-assemblaggio delle cellule. In particolare, il tessuto generato dalla nostra procedura rimane funzionale per più di un anno nella coltura cellulare ed è in grado di supportare la funzione epatica in vivo23.
In sintesi, il nostro approccio definito di differenziazione consente la generazione di epotosfere umane stabili sia da cellule staminali embrionali umane (hESC) che da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Riteniamo che la procedura descritta rappresenti una svolta significativa nella generazione di epatosfere 3D per la ricerca scientifica di base e applicata.

<table><tbody><tr><td>Colture cellulari e saggi funzionali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreagents Agarose Fisher</td><td>10766834</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>integratore di B27&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanolo</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2058&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>DPBS con ThermoFisher di Calcio e Magnesio</td><td></td><td></td><td></td>14040133</tr><tr><td>Reagente delicato per dissociazione cellulare</td><td>STEMCELL Technologies&nbsp;</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>&nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Attivina Umana A&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Alfa Fetoproteina umana ELISA</td><td>Alpha Diagnostics</td><td>500</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita Fibrobaslt di base umano</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di Gropwth epiteliale umano</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita degli epatociti umani</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatina umana M&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Laminina umana ricombinante 521&nbsp;</td><td>BioLamina&nbsp;</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica umana ELISA</td><td>Alpha Diagnostics</td><td>1190</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita vascolare umano</td><td>Bio-techne</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone 21-emiuccinato sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Sostituzione del siero knockout&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>Sferoidi per microstampi&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z764000</tr><tr><td>mTeSR1 medio&nbsp;</td><td>Tecnologie STEMCELL&nbsp;</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Sistema di analisi e screening</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Sistema di analisi e screening</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>poli-HEMA (poli-2-idrorossietilmetacrilato)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinante Wnt3a&nbsp;</td><td>Bio-techne</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Tecnologie per la vita&nbsp;</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microonde</td><td>Bosch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leika</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td>Thermoscientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi primari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A6684&nbsp;</td><td>1:100 (mouse)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>Università di Dundee</td><td>Università di Dundee</td><td>1:200 (pecora)</td></tr><tr><td>E-caderina</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (topo)</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:100 (coniglio)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td>1:100 (pecora)</td></tr></tbody></table>

produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

Lo sviluppo di fonti rinnovabili di tessuto epatico è necessario per migliorare la modellazione basata sulle cellule e sviluppare il tessuto umano per il trapianto. Le cellule staminali embrionali umane (HESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) rappresentano fonti promettenti di sfere epatiche umane. Abbiamo sviluppato un metodo di differenziazione cellulare libero e definito del siero per generare sfere epatiche umane tridimensionali formate da cellule staminali pluripotenti umane. Una potenziale limitazione della tecnologia è la produzione di sfere dense con materiale morto all'interno. Per aggirare questo, abbiamo impiegato la tecnologia del microwell agarose a densità cellulari definite per controllare le dimensioni delle sfere 3D, impedendo la generazione di nuclei apoptotici e/o necrotici.  In particolare, le sfere generate dal nostro approccio mostrano la funzione epatica e il fenotipo stabile, che rappresentano una risorsa preziosa per la ricerca scientifica di base e applicata. Crediamo che il nostro approccio potrebbe essere utilizzato come tecnologia di piattaforma per sviluppare ulteriori tessuti per modellare e trattare le malattie umane e in futuro potrebbe consentire la generazione di tessuto umano con architettura tissutale complessa.

Gli aggregati tridimensionali della linea delle cellule staminali embrionali (H9) o della linea cellulare staminale pluripotente indotta (P106) sono stati differenziati verso il lignaggio degli epatociti utilizzando la nostra procedura definita (Figura 1). Le cellule staminali pluripotenti sono state per la prima volta orientate verso l'endoderma definitivo prima della specifica dell'epatoblasto. In seguito, gli epatoblasti sono stati maturati in epatosfere 3D che potrebbero essere mantenute in cultura fino a un anno23.
Per studiare la struttura delle sfere 3D, sono state fissate, sezionati e macchiati sfere derivate da hESC o iPSC di 30 giorni. Sono stati impiegati il fattore nucleare di epatociti 4 alfa (HNF4) e la vimentina del marcatore mesenchymal, rivelando la presenza di uno strato esterno composto da epatociti come cellule che circondano un nucleo di cellule mesenchymal (Figura 2). Abbiamo seguito questi esperimenti analizzando l'espressione delle proteine espresse negli epatociti: albumina, CYP3A ed E-cadherin. L'immunostaining ha rivelato che l'espressione di queste proteine era limitata allo strato esterno delle sfere (Figura 3).
Le analisi funzionali delle epatosfere sono state eseguite in 30 culture del giorno. CYP1A2 e CYP3A sono enzimi importanti all'interno degli epatociti funzionali. La loro attività è stata valutata utilizzando saggi stabiliti. L'attività Epatospheres derivato da H9 ha mostrato un'attività CYP3A di 220,375 x 74514 Proteina RLU/mL/mg e attività CYP1A2 di 732.440 33.330 RLU/mL/mg proteine (Figura 4A). L'attività CYP3A nelle epatosfere derivate da P106 era di 132117 : 43.391 proteina RLU/mL/mg e l'attività CYP1A2 era 409,907 121.723 proteina RLU/mL/mg (Figura4B). Rispetto a due lotti di epaticiti primari umani, le sfere epatiche 3D mostravano livelli rispettabili di attività CYP10.
L'analisi della sintesi e della secrezione di albumina e alfa-fetoproteina (AFP) ha rivelato che le epatos di origine H9 hanno secreto rispettivamente 683,9 e 159 x 20 - 20 ng/mL/24 h/mg di proteina di albumina e alfa-fetoproteina (Figura 5A). Mentre le epatosfere derivate da P106 hanno smentito rispettivamente 497 , 41 e 756 , 24 ng/mL/24 h/mg di albumina e alfa-fetoproteina (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig1.jpg"> Figura 1 : procedura di differenziazione graduale per generare epatosfere 3D da hESC. Le parentesi blu rappresentano i giorni di differenziazione per hiPSC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig2.jpg"> Figura 2 : Riorganizzazione strutturale delle epatosferie 3D. Immagini rappresentative dell'espressione del fattore nucleare epatocite 4 alfa (HNF4 - verde) e vimentina (rosso) in (A) Epatosfere 3D derivate da H9 e (B) Epatobi 3D derivate da P106 e i corrispondenti controlli immunoglobulin G (IgG) . Le barre della scala rappresentano 60 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig3.jpg"> Figura 3 : Valutazione dell'espressione del marcatore epatico in epatosfere 3D. Immagini rappresentative dell'espressione dei marcatori epatociti - albumina, CYP3A, E-cadherin e dei corrispondenti controlli IgG in (A) H9- e (B) P106-derivato epatospheres. Barre della scala: 60 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig4.jpg"> Figura 4 : Funzione P450 citocromatica in epatosfere 3D. Misurazione dell'attività citocromatica P450 1A2 e 3A nell'attività 3D di derivazione di (A) e (B) epatospheres 3D derivata da P106. I dati rappresentano la media di tre repliche biologiche e le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). L'attività è citata come unità di luce relativa (RLU) per mL per mg di proteine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig5.jpg"> Figura 5 : Analisi della secrezione proteica dell'epatosfera. La secrezione di albumina e alfa-fetoproteina (AFP) è stata analizzata in (A) H9-derivato epatospheres e (B) P106-derivato epatospheres. I dati sono rappresentativi di tre repliche biologiche, e le barre di errore rappresentano la proteina segreta è citata come nanogrammi di proteine per mL per 24 h per mg di proteine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un approccio per produrre epatosfere da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un sistema di coltura definito e l'autoassemblaggio delle cellule. Questo protocollo è riproducibile in un certo numero di linee cellulari, conveniente e consente la produzione di epatosfere umane stabili per l'applicazione biomedica.

Produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Questa metogenetica grande quantità di epatosfere 3D di cellule staminali pluripotenti umane utilizzando i materiali fini e le cellule di assemblaggio. Il principale progresso di questa tecnica è che consente di controllare le dimensioni delle sfere epatiche 3D, limitando la formazione di centri necrotici e la perdita di fenotipo. A dimostrare la procedura con me sarà Yu Wang, un post-dottorato nel nostro laboratorio.Prepararsi a presentare stampi di agarosio sciogliendo due grammi di agarosio a bassa temperatura di fusione in 100 millilitri di acqua distillata sterilizzata. Riscaldare con cura la miscela nel microonde con l'intervallo che trema per sciogliere completamente l'agarosio. Aggiungere 520 microlitri dell'agarosio fuso a uno stampo ben formato 256 e consentirne la solidificazione.Quindi, trasferire ogni micro piatto di agarosio in un unico pozzo di una piastra da 12 porri. Aggiungere 1,5 millilitri di DPBS con calcio e magnesio ad ogni pozzo e pipettare su e giù per rimuovere le bolle. Per preparare la sospensione cellulare, iniziare aspirando il mezzo da una coltura indifferenziata di cellule staminali pluripotenti umane, o HPSC.Risciacquare le cellule aggiungendo cinque millilitri di DPBS a temperatura ambiente, senza calcio o magnesio e quindi rimuovere il tampone. Aggiungere cinque millilitri di reagente di dissociazione cellulare alle cellule e incubare a 37 gradi Celsius per sei-otto minuti. Osservare il distacco cellulare al microscopio ed estendere l'incubazione per uno o due minuti in più, se necessario.Fermare la reazione rimuovendo il reagente di dissociazione cellulare e aggiungendo cinque millilitri di MT fresco servire un mezzo integrato con 10 inibitori della roccia micromolare, Y27632. Pipetta su e giù più volte per dissociare le cellule. Contare le cellule vitali con l'emocitometro e la colorazione blu tripano per calcolare il numero totale di cellule necessarie.Trasferire il numero desiderato di cellule in un tubo di centrifuga sterile da 15 o 50 millilitri e centrifugare a 200 volte G per cinque minuti per pellettare le cellule. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in MT servire un mezzo con 10 inibitori della roccia micromolare per una concentrazione finale di 2,1 milioni di cellule per millilitro. Successivamente, salvare le cellule aggiungendo 190 microlitri di sospensione cellulare preparata per micro pozzo di agarosio e incubando le micro piastre di agarosio a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al cinque% per due ore.Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di un mezzo fresco, caldo, T-serve un mezzo con inibitore della roccia ad ogni bene. Restituire le piastre all'incubatrice e lasciarle lì per 24 ore. Il giorno dopo, esamina la sfera della formazione.Preparare pozzatti rivestiti di poli-due idrossietile metacrilato o poliema sciogliendo due grammi di poliema in 100 millilitri di etanolo al 95% e mescolando la soluzione durante la notte su una piastra calda di 55 gradi Celsius. Il giorno successivo, aggiungere 250 microlitri della soluzione ad ogni pozzo di una piastra da 24 po 'e asciugare la piastra durante la notte in un forno a 60 gradi Celsius. Inizia la differenziazione degli epatociti rimuovendo attentamente l'MT per servire un mezzo dalle cellule precedentemente seminate e sostituendolo con un millilitro di mezzo di differenziazione dell'endoderma fresco.Per le cellule staminali embrionali umane, aggiornare il mezzo ogni 24 ore per tre giorni. È importante iniziare la differenziazione degli epatociti 24 ore dopo la semina per evitare la differenziazione cellulare spontanea. Dopo l'induzione definitiva dell'endoderma, passare il mezzo al mezzo di differenziazione dell'epatoblasto per cinque giorni.Sostituire il mezzo ogni due giorni, eseguendo l'ultima modifica l'ultimo giorno di specifica dell'epatoblasto. Per trasferire le epatosfere nei pozzi rivestiti in poliema preparati, lavare le cellule con mezzo di maturazione epatocita e quindi aggiungere un millilitro del mezzo integrato con 10 nanogrammi per millilitro HGF e 20 nanogrammi per millilitro OSM. Pipettare la soluzione su e giù più volte per sollevare le epatosfere dalla micro piastra di agarosio e trasferirle in un pozzo rivestito in poli-ema.Lavare la microstra di agarosio con un millilitro del mezzo di maturazione epatocita integrato e trasferire il mezzo al pozzo rivestito in poliema. Utilizzando una pipetta P-100, aspirare con cura il mezzo in eccesso senza rimuovere le epatosfere fino a quando non rimane circa un millilitro di mezzo nel pozzo. Rinfrescare il mezzo ogni 48 ore per 12 giorni.Se si lavora con cellule staminali embrionali, passare dal mezzo al mezzo di mantenimento degli epatociti al giorno 20 rimuovendo il mezzo di maturazione, lavando le cellule con mezzo di mantenimento e quindi aggiungendo un millilitro di mezzo di mantenimento integrato. Dopo questo, aggiornare il mezzo ogni 48 ore. I cambiamenti immediati devono essere eseguiti con attenzione per evitare gravi stress e distorsioni di questa struttura sferica.La colorazione degli epatociti nei marcatori mesenchimali rivela che le epatosfere formate usando questa tecnica sono composte da cellule simili a epatociti che circondano un nucleo di cellule mesenchimali. Altre proteine tipicamente espresse in epatociti si trovano anche sullo strato esterno delle sfere. L'analisi funzionale degli enzimi citocromi P450 o CYP nelle colture di epatosfera di 30 giorni ha mostrato che le sfere 3D mostrano livelli rispettabili di attività cyp rispetto agli epatociti primari umani.Inoltre, si può dimostrare che le epatosfere secernono proteine epatiche come l'albumina e l'alfa-fetoproteina. La cosa più importante da ricordare per questo protocollo è pipettare delicatamente su e giù per la soluzione contenente epatosfere 3D quando le trasferiscono nella piastra rivestita in poli-ema. Questo aiuta a evitare di danneggiarli.Una volta padroneggiata, questa metodologia consente la generazione di sfere epatiche 3D che rimangono funzionali per oltre un anno in vitro con molteplici applicazioni nella modellazione e nello screening dei farmaci deceduti. Guardando al futuro, questa tecnologia potrebbe essere utilizzata come piattaforma per sviluppare ulteriori tessuti entodermi e mesenchimali con architetture complesse.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Il metodo presentato qui descrive una soluzione scalabile e buone pratiche di fabbricazione (GMP) sistema di differenziazione -ready per generare cellule epatociti-come l'essere umano da cellule staminali pluripotenti. Serve come un sistema economico e standardizzato per generare cellule epatociti-come l'essere umano per la ricerca di base e applicata fegato umano.

Definito e Generazione scalabile di cellule epatociti-come da cellule staminali umane pluripotenti

Qui viene riportato un protocollo per sviluppare un sistema tridimensionale (3-D) da cellule staminali pluripotenziali umane (hiPSCs) chiamate il corpo embrionale libero (SFEB) serico. Questo modello di 3-D può essere utilizzato come una cultura di fetta organotipica per modellare lo sviluppo corticale umano e per l'interrogatorio fisiologico dei circuiti neurali in via di sviluppo.

Sviluppare corpi embrioni liberi del siero derivato da HiPSC per l&#39;interrogazione di colture a cellule staminali a 3 dosi utilizzando saggi fisiologicamente rilevanti

Il protocollo presentato qui descrive una piattaforma per identificare piccole molecole per il trattamento dell'affezione epatica. Una descrizione dettagliata è presentata dettagliare come differenziarsi iPSCs in cellule con le caratteristiche dell'epatocita in piastre da 96 pozzetti e per utilizzare le celle per schermo per piccole molecole con potenziale attività terapeutica.

Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

Questo protocollo descrive un approccio semi-automatizzato per produrre dell'epatocita-come le cellule da cellule staminali pluripotenti umane in un formato ben 96 PORTATARGA. Questo processo è rapido ed economico, permettendo che la produzione di qualità ha assicurato lotti dell'epatocita-come delle cellule per la ricerca umana di base e applicata.

Produzione semi-automatizzata di Hepatocyte come cellule staminali pluripotenti

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo monostrato e privo di siero-per generare in modo efficiente cellule simili a epatociti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in 18 giorni. Ciò comporta sei passaggi in quanto gli hPSC si differenziano in sequenza in tipi di cellule intermedie come la striscia primitiva, l'endoderma definitivo, il foregut posteriore e i progenitori del germoglio epatico prima di formare cellule simili a epatociti.

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un approccio standardizzato per indurre la differenziazione del progenitore epatico umano dalle cellule staminali pluripotenti. Lo sviluppo di questa procedura con formulazioni di media pronti all'uso offre all'utente un sistema facile per generare cellule epatiche umane per la ricerca e la traduzione biomedica.

Specifica del progenitore epatico da cellule staminali pluripotenti utilizzando un sistema di differenziazione definito

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule funzionali simili a epatociti (HHC) completando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE).

Un metodo efficiente per l'induzione di cellule simili a epatociti diretti da cellule staminali embrionali umane

Qui presentiamo un metodo non genetico per generare sferoidi epatici autologhi umani usando cellule mononucleate isolate dal sangue periferico allo stato stazionario.

Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Questo protocollo descrive la generazione di organoidi epatici endodermici (eHEPO) veloci e riproducibili. Con questo protocollo, gli eHEPO possono essere prodotti entro 2 settimane e ampliati a lungo termine (più di 1 anno) senza perdere la loro differenziazione e funzionalità.

Generazione di organoidi epatici endodermici funzionali

Scopri la produzione di epatosfere 3D da cellule staminali pluripotenti umane con un sistema di coltura definito. Questo metodo controlla le dimensioni delle sfere epatiche per applicazioni in modellazione di malattie e screening farmacologico.

Produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti

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