Name: Un metodo per studiare la formazione de novo dei domini della cromatina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Scopri un metodo per studiare la formazione dinamica dei domini della cromatina mediati da PRC2 nelle cellule staminali embrionali murine utilizzando CRISPR/Cas9. Questo sistema permette di analizzare in tempo reale i processi cellulari.

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Ringraziamo i dottori L. Vales, D. Ozata e H. Mou per la revisione del manoscritto. Il D.R. Lab è supportato dall'Howard Hughes Medical Institute e dal National Institutes of Health (R01CA199652 e R01NS100897).

Generazione di mESC di salvataggio EED inducibili
1. Cultura cellulare
<ol><li>Utilizzare cellule staminali embrionali C57BL/6 topo senza alimentatore (mESC) in possesso di un transgene CreERT2 opportunamente integrato, che può traslocare nel nucleo dopo la somministrazione di 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.</li>
	<li>Crescere mESC in medio ESC convenzionale14,15, integrato con 1000 U/mL LIF, 1 inibitore ERK PD0325901 e 3 M GSK3 inibitore CHIR99021. Per il mezzo ESC convenzionale, utilizzare DMEM ad eliminazione diretta contenente 15% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 1X penicillina/streptomicina e 0,1 mM 2-mercaptoetanolo.</li>
	<li>Utilizzare piastre rivestite con soluzione di gelatina dello 0,1% per la coltura di mESC.</li>
</ol>2. Generazione di mESC ePEC e EED clonale (KO)
<ol><li>Guida di progettazione RNA (gRNA) per eliminare Exon 10 e Exon 11 di copia endogena di EED in mESC utilizzando lo strumento di progettazione CRISPR in Benchling16. EED-KO-gRNA-1 bersaglio dell'intron e'1 immediatamente a monte dell'esone 10 e dell'EED-KO-gRNA-2 bersaglia l'introne immediatamente a valle dell'Exon 11. L'applicazione simultanea di questi gRNA elimina sia Exon 10 che Exon 11 con un'unione finale non omologa (NHEJ).</li>
	<li>Clonare i gRNA in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) seguendo le istruzioni riportate in Ran et al., 201317.</li>
	<li>In un formato a 6 piani, transfect 2 x 105 mESC con 1 mg di ogni EED-KO-gRNA-1 e EED-KO-gRNA-2 (vedi Tabella dei materiali) utilizzando il reagente di trasfezione seguendo le istruzioni del produttore. Cambiare il supporto 24 h dopo la trasfezione.</li>
	<li>Due giorni dopo la trasfezione, isolare le cellule positive GFP utilizzando lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS). Aspettatevi che l'efficienza della trasfezione vari intorno al 10-30 %. Ordinare circa 5 x 105 celle per catturare sufficienti cellule positive GFP per la placcatura.</li>
	<li>Piastra i mESC positivi GFP isolati in piastre da 15 cm pre-rivestite con 0,1% di gelatina (10-20 x103 cellule per piastra) per la raccolta delle coccie.</li>
	<li>Far crescere le cellule in mezzo ESC per circa una settimana fino a quando le singole colonie sono visibili. Cambiare i media ogni 2 giorni.</li>
	<li>Scegli un minimo di 48 colonie utilizzando la punta di micropipetta da 20 . Raschiare la colonia mentre si aspira nella punta della micropipetta. Non suddividere la colonia in singole cellule. Trasferire la colonia in un piatto di accutasi contenente (20 mL) 96.</li>
	<li>Incubare le colonie per 10 min a 37 gradi centigradi fino a quando tutte le cellule sono dissociate.</li>
	<li>Aggiungere 200 mL di supporti ESC in ogni pozzo utilizzando pipetta multicanale.</li>
	<li>Mescolare bene e placcare le celle in due lastre di pozzo 96 separate utilizzando pipetta multicanale.</li>
	<li>Utilizzare una delle 96 lastre di pozzo per la genotipizzazione e mantenere l'altro in crescita fino a quando la genotipizzazione è conclusa. Utilizzare la soluzione di estrazione del DNA per estrarre il DNA dalla piastra da 96 pozzo seguendo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Utilizzare i numeri primi genotipizzati Gnt_EED-KO-up e Gnt_EED-KO_down, che si estendono sul sito eliminato ed eseguono la genotipizzazione della PCR con la polimerasi del DNA Taq seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: Altri tipi di polimerasi del DNA possono essere utilizzati anche per la genotipizzazione, tuttavia, la polimerasi del DNA Taq offre comodità in quanto la reazione PCR può essere caricata direttamente su un gel quando viene utilizzato il suo buffer di reazione colorato.<ol>
<li>Osservare un prodotto di DNA con minore peso molecolare nelle cellule con una delezione omozia rispetto al caso wild-type (WT). NOTA: Per generare celle nulle PRC2, è necessaria la cancellazione omoziana degli esoni 10 e 11 per destabilizzare e degradare EED, una sottounità essenziale del core PRC213. L'efficienza mirata AL CRISPR è di circa il 10 %.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Convalidare la cancellazione di EED exon 10 e 11 e la perdita di proteina EED da parte del sequenziamento e del gonfiamento occidentale, rispettivamente.</li>
	<li>Confermare l'esaurimento di EED e H3K27me2/me3 dalla cromatina nelle cellule EED KO da ChIP-seq utilizzando anticorpi contro H3K27me2/me3 ed EED. Utilizzare il protocollo indicato in Oksuz et al., 201715 per gli esperimenti ChIP-seq.</li>
</ol>3. Ingegneria degli eED knockout mESC per ospitare l'espressione EED inducibile basata su Cre-ERT2
<ol><li>Progettare gRNA (EED-gRNA-inducible) per introdurre un taglio all'interno dell'intron seguendo l'esone 9 di EED utilizzando lo strumento di progettazione CRISPR in Benchling16 (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Clonare i gRNA in pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) seguendo le istruzioni riportate in Ran et al., 201317.</li>
	<li>Progettare un DNA modello donatore che comprenda la sequenza EED cDNA dopo l'esone 9 e un tag Flag-HA del terminale C a monte di una sequenza T2A-GFP, il tutto in orientamento inverso rispetto alla sequenza genica endogena.<ol>
<li>Affiancare la cassetta con un accettatore di giunzione e una sequenza poliadenilazione annidata tra siti loxP invertiti etelologi (lox66 e lox71)18.</li>
		<li>Includere almeno 500 bp di bracci di omologia da ogni estremità. Dividere il modello donatore in 2 segmenti di frammenti genici gBlocks (vedere gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" e gBlock-2-cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") e assemblarli in vettore PCR Blunt utilizzando la clonazione Gibson seguendo le istruzioni del produttore. NOTA: gblock-2 contiene un residuo aromatico (Y365) all'interno della gabbia di EED che è importante per l'interazione con H3K27me312. gBlock-2-Wt contiene residui di tipo selvaggio, mentre gblock-2-gabbia-mutante contiene la gabbia-mutante di EED (Y365A), incapace di legarsi a H3K27me3. Il salvataggio inducibile di WT EED è indicato come i-WT-r e il salvataggio EED indotbile in gabbia-mutante è indicato come i-MT-r per comodità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In un formato a 6 piani, trasfect 2 x 105 mESC con 1 mg di gRNA (EED-gRNA-inducibile) e 1 mg dei modelli donatore (i-WT-r o i-MT-r) utilizzando la reagente di trasfezione e isolare le cellule positive GFP utilizzando FACS.</li>
	<li>Segui i passaggi 2.3-2.11 per isolare le singole colonie pronte per la genotipizzazione per il targeting di successo.</li>
	<li>Utilizzare i primer di genotipizzazione Inducible_Genotype-FW-1 e Inducible_Genotype-REV-1, che si estendono sulla cassetta inserita ed eseguono la genotipizzazione PCR utilizzando la polimerasi del DNA Taq. NOTA: l'efficienza di targeting per CRISPR è di circa il 10 %.<ol>
<li>Confermare la corretta integrazione della cassetta da PCR utilizzando i primer Inducible_Genotype-FW-2 e Inducible_Genotype-REV-2, che si trovano al di fuori dei bracci omeologia. NOTA: L'integrazione omozigotale della cassetta è necessaria per realizzare un salvataggio efficiente di EED. Si noti che le cellule con integrazione omozio produrranno un singolo prodotto di DNA di grandi dimensioni rispetto a WT EED, che produrrà un prodotto corto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confermare l'integrazione della cassetta da parte del sequenziamento Sanger.</li>
	<li>Confermare il lancio della cassetta e l'espressione di EED e di altri componenti di base PRC2 (ad es., E-H-2 e SU-12) sull'amministrazione 4-OHT mediante gonfiore occidentale.</li>
	<li>Confermare l'espressione di T2A-GFP e la percentuale di capovolgimento per citometria di flusso. Si noti che l'espressione di GFP è indicativa di capovolgimento della cassetta e l'espressione di EED.</li>
</ol>4. A seguito della nucleazione e della diffusione dell'attività della RPC2 sulla cromatina
<ol><li>Verificare che i-WT-r e i-MT-r mESC non abbiano un'espressione perdente di GFP per citometria di flusso. In caso di espressione perdente di GFP, isolare le cellule GFP-negative da FACS prima di iniziare l'esperimento.</li>
	<li>Espandere i mESC i-WT-r e i-MT-r in cinque piastre da 15 cm (5x 106 celle per piastra).</li>
	<li>Indurre l'espressione di WT o gabbia-mutante EED per somministrazione di 0,5 mM 4-OHT per 0 h, 12 h, 24 h, 36 h e 8 giorni (una piastra di 15 cm per condizione). Cambiare il supporto dopo 12 h per trattamenti più lunghi di 12 h. Isolare le cellule ricombinate con successo utilizzando GFP. Regolare il tempo dei trattamenti in modo che tutte le condizioni siano raccolte contemporaneamente.</li>
	<li>Eseguire ChIP-seq per H3K27me2, H3K27me3 per indagare la loro deposizione temporale alla cromatina in risposta alla riequisetta di WT o EED a gabbia-mutante. Utilizzare il protocollo ChIP-seq, inclusa la preparazione della libreria descritta in Oksuz et al., 201715.</li>
	<li>Utilizzare il controllo spike-in in ogni campione per consentire il confronto quantitativo tra diversi punti temporali19.<ol>
<li>Per il controllo del picco, utilizzare la cromatina dalla Drosophila melanogaster (in un rapporto 1:50 rispetto alla cromatina derivata da mESC) e l'anticorpo H2Av specifico di Drosophila (1 Luna di anticorpo H2Av per 4 g di istruzioni del produttore) in ogni campione.</li>
		<li>Preparare la cromatina dalla Drosophila in un modo simile a quello da mESC utilizzando il protocollo dettagliato in Oksuz et al., 201715.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mappare la sequenza di ChIP-seq al genoma di mm10 con Bowtie 2 utilizzando i parametri di default20.</li>
	<li>Normalizzare le letture di ChIP-seq del mouse in Drosophila read conta21. Calcolare il fattore di normalizzazione spike-in utilizzando la seguente formula: 1 x 106/univoco Drosophila read conta. Aspettatevi di ottenere circa 1 x 106Drosophila conteggio delle letture e 20 x 106 conteggi di lettura del mouse per esperimento.<ol>
<li>Non includere la cromatina di Drosophila durante il sequenziamento dei campioni di input.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare lo strumento genomecov dei bedtools per convertire il file bam nel bedgraph22. Successivamente, convertire il bedgrafa in file bigwig utilizzando lo strumento bedGraphToBigWig da USCS23,24. Vedere lo script seguente: "percorso al genoma di mm10" "percorso verso le dimensioni dei cromosomi mm10" inp_bam"percorso del file bam di input " multiply: "calcola il fattore di normalizzazione del picco" bedtools genomecov -bg -scale $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph sort -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw
</li>
	<li>Visualizza le densità di lettura ChIP-seq caricando i file bigwig sul browser genoma USCS24.</li>
</ol>5. Monitoraggio dell'emergere e della crescita dei foci H3K27me3 nei nuclei mESC
<ol><li>Piatto 1x 104 mESC in scivoli a camera 8-well pre-rivestiti con gelatina dello 0,1%.</li>
	<li>Il giorno successivo, iniziare a eseguire induzioni consecutive 4-OHT (0,5 mM) per raccogliere le cellule che esprimono EED per i punti temporali indicati (0 h, 12 h, 24 h e 36 h). Cambiare il supporto dopo 12 h per trattamenti più lunghi di 12 h.</li>
	<li>Fissare i mESC con 4% paraformaldeide in salina tamponati di fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT) per 10 min.</li>
	<li>Permeabilizzare le celle con PBS/0.25% Triton X-100 a RT per 30 min.</li>
	<li>Bloccare le celle con siero d'asino PBS/5%/0,1% Triton X-100 (buffer di blocco) a RT per 30 min.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo primario H3K27me3 1:500 nel buffer di blocco e aggiungere alle cellule.</li>
	<li>Incubare le cellule con anticorpo primario durante la notte a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Il giorno successivo, eseguire 3 lavatori con PBS/0.1% Triton X-100.</li>
	<li>Diluire l'anticorpo secondario (Alexa fluor 595) 1:1000 nel buffer di blocco e aggiungere alle cellule.<ol>
<li>Eseguire tutte le incubazioni al buio nei passaggi successivi come anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor sono sensibili alla luce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare l'anticorpo secondario per 2 h a RT.</li>
	<li>Esegui 3 lavamenti con PBS/0,1% Triton X-100.</li>
	<li>Diluire DAPI (1 mg/mL) 1:4000 con PBS/0.1% Triton X-100 e aggiungere alle celle.</li>
	<li>Incubare le cellule con DAPI per 10 min a RT.</li>
	<li>Montare le celle con Aqua mount.</li>
	<li>Immagina le cellule con microscopia confocale con ingrandimento 63X.</li>
	<li>Elaborare e pseudo-colorare le immagini utilizzando una distribuzione di ImageJ, Fiji25.</li>
</ol>

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<li>Højfeldt, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+H3K27+methylation+can+be+established+de+novo+by+SUZ12-directed+PRC2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).</li>
</ol>

D.R. è co-fondatore di Constellation Pharmaceuticals e Fulcrum Therapeutics. Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Un approccio potente per comprendere i dettagli meccanicistici durante la formazione di un dato dominio cromatico, è quello di interrompere prima il dominio e poi monitorare la sua ricostruzione in corso all'interno delle cellule. Il processo può essere sospeso in qualsiasi momento durante la ricostruzione per analizzare in dettaglio gli eventi in corso. Studi precedenti sui domini di cromatina non sono stati in grado di risolvere tali eventi in quanto sono stati eseguiti in condizioni di stato costante (ad esempio, conf...

I genomi eucarioti sono altamente organizzati e i cambiamenti nell'accessibilità della cromatina controllano direttamente la trascrizione genica1. Il genoma contiene diversi tipi di domini di cromatina, che sono correlati all'attività trascrizionale e alla temporizzazione della replicazione2,3. Questi domini di cromatina variano in dimensioni da pochi kilobase (kb) a più di 100 kb e sono caratterizzati da un arricchimento in distinte modifiche istoni4. Le domande centrali sono: come si formano questi domini e come vengono propagati?
Uno dei domini di cromatina più caratterizzati è favorito attraverso l'attività del complesso repressivo Polycomb 2 (PRC2). PRC2 è un complesso multi-sottounità composto da un sottoinsieme del Polycomb Group (PcG) delle proteine5,6, e catalizza la mono-, di- e trimetilazione di lisina 27 di istone H3 (H3K27me1/me2/me3)7,8, 9,10. H3K27me2/me3 sono associati a uno stato di cromatina repressiva, ma la funzione di H3K27me1 non è chiara6,11. Uno dei componenti fondamentali della PRC2, sviluppo ectodernico embrionale (EED), si lega al prodotto finale della catalisi PRC2, H3K27me3, attraverso la sua gabbia aromatica e questa caratteristica si traduce nella stimolazione allosteric della PRC212,13. L'attività enzimatica PRC2 è cruciale per preservare l'identità cellulare durante lo sviluppo in quanto l'espressione inappropriata di alcuni geni dello sviluppo che sono controindicati per un lignaggio specifico, sarebbe dannosa5,6 . Pertanto, svelare i meccanismi attraverso i quali la RPC2 favorisce la formazione di domini di cromatina repressiva nei mammiferi è di fondamentale importanza per comprendere l'identità cellulare.
Tutti i sistemi sperimentali passati progettati per studiare la formazione di domini di cromatina, compresi i domini di cromatina mediati dalla RPC, sono stati eseguiti in condizioni stabili, che non sono in grado di monitorare gli eventi di svolgimento della formazione del dominio della cromatina Cellule. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per generare un sistema cellulare inducibile che monitora il reclutamento iniziale e la propagazione dei domini di cromatina. In particolare, ci concentriamo sul monitoraggio della formazione di domini di cromatina repressiva mediati da PRC2 che comprendono H3K27me2/3. Questo sistema in grado di cogliere i dettagli meccanicistici della formazione del dominio della cromatina, potrebbe essere adattato per incorporare altri domini della cromatina, come i domini ampiamente studiati che comprendono H2AK119ub o H3K9me. In combinazione con la genomica e le tecnologie di imaging, questo approccio ha il potenziale per affrontare con successo varie domande chiave nella biologia della cromatina.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-idrossitamoxifene (5 mg)</td><td>Sigma</td><td>H7904-5MG</td><td>Per l'induzione dell'espressione EED</td></tr><tr><td>Soluzione acquosa di paraformaldeide al 16% (10x10 ml)</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15710</td><td>Per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985-023</td><td>Per colture mESC</td></tr><tr><td>Soluzione di gelatina al 2%</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ml</td><td>Per mESC coltura</td></tr><tr><td>Accutase 500 ML</td><td>Innovative Cell Tech/FISHER</td><td>AT 104-500</td><td>Per colture mESC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresaerch</td><td>711-585-152</td><td>Per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Aqua-Mount Mounting Medium</td><td>FISHER/VWR</td><td>41799-008</td><td>Per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>CAMERA SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK</td><td>Fisher Sci</td><td>177445PK</td><td>Per l'immunofluorescenza</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilidolo, Dicloridrato) - 10 mg</td><td>Life Tech</td><td>D1306</td><td>Per l'immunofluorescenza</td></tr><tr><td>ERK inibitore, PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Per la coltura di mESC</td></tr><tr><td>ESGRO Proteina LIF ricombinante</td><td>Millipore/Fisher</td><td>ESG1107</td><td>Per la coltura di mESC</td></tr><tr><td>FBS Cellule staminali qualificate</td><td>Atlanta</td><td>S10250</td><td>Per la coltura di mESC</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Per la clonazione del modello del donatore</td></tr><tr><td>Inibitore GSK3, CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Per la coltura di mESC</td></tr><tr><td>H3K27me2 (D18C8) coniglio mAB</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9728S</td><td>Anticorpo per ChIP-seq</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9733S</td><td>Anticorpo per ChIP-seq</td></tr><tr><td>Istone H2Av anticorpo (pAb)</td><td>Motivo attivo</td><td>39715</td><td>Controllo spike-in per ChIP-seq</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td>Per colture mESC</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>Per colture mESC</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>LifeTech</td><td>11668019</td><td>Per trasfezione</td></tr><tr><td>MangoTaq DNA polimerasi</td><td>Bioline</td><td>BIO-21079</td><td>Per genotipizzazione PCR</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale (10 mL)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma/Roche</td><td>P0781</td><td>Per colture mESC</td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>Per clonazione di gRNA</td></tr><tr><td>Soluzione di estrazione del DNA QuickExtract</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td>Per la genotipizzazione PCR</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Kit di clonazione PCR Zero Blunt</td><td>Thermo Fisher</td><td>K270020</td><td>Per clonazione modello di donatore</td></tr><tr><td>Primers/gBlocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-1</td><td></td><td></td><td>Sequenza: ctctggctactgtcaactag. gRNA si accoppia per knockout EED in ESC C57BL/6 per sistemi i-WT-r e i-MT-r.</td></tr><tr><td>Sequenza EED-KO-gRNA-2</td><td></td><td></td><td>: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. I gRNA si accoppiano per knockout EED nelle ESC C57BL/6 per i sistemi i-WT-r e i-MT-r.</td></tr><tr>Sequenza inducibile <td></td><td></td><td>da EED-gRNA</td><td>: atggcaccccgaaattagaa. gRNA e donatore per generare il sistema i-WT-r nel background EED-KO.</td></tr><tr>Donatore <td></td><td></td><td>i-WT-r</td><td>https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA e donatore per generare il sistema i-WT-r nel background EED-KO.</td></tr><tr>Sequenza inducibile <td></td><td></td><td>da EED-gRNA</td><td>: atggcaccccgaaattagaa. gRNA e donatore per generare il sistema i-WT-r nel background EED-KO.</td></tr><tr>Donatore <td></td><td></td><td>i-MT-r</td><td>https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA e donatore per generare il sistema i-MT-r nel background EED-KO.</td></tr><tr><td>Primer di genotipizzazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-FW-1</td><td></td><td></td><td>Sequenza: ctgtaggctgccatctgtga. L'allele wild type produrrà un prodotto di 1,9 kb. L'allele knockout produrrà un prodotto di 200 bp.</td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-REV-1</td><td></td><td></td><td>Sequenza: agccagggctacacagagaa. L'allele wild type produrrà un prodotto di 1,9 kb. L'allele knockout produrrà un prodotto di 200 bp.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-1</td><td></td><td></td><td>Sequenza: tgcagtgaaaaaatttggaa. Quando la cassetta viene inserita, gli inneschi produrranno 1863 bp. L'allele wild type produrrà un prodotto di ~200 bp.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-1</td><td></td><td></td><td>Sequenza: gagaggggtggcactgtaaa. Quando la cassetta viene inserita, gli inneschi produrranno 1863 bp. L'allele wild type produrrà un prodotto di ~200 bp.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-2</td><td></td><td></td><td>Sequenza: ccccctctttctccttttctct. Quando la cassetta viene inserita, gli inneschi produrranno 3200 bp. L'allele wild type produrrà un prodotto di 1560 bp.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-2</td><td></td><td></td><td>Sequenza: atgcctgggtgaatgaaaaa. Quando la cassetta viene inserita, gli inneschi produrranno 3200 bp. L'allele wild type produrrà un prodotto di 1560 bp.</td></tr></tbody></table>

un metodo per studiare la formazione de novo dei domini della cromatina

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

L'organizzazione e la struttura dei domini della cromatina sono uniche per le singole linee cellulari. La loro cattiva regolamentazione potrebbe portare a una perdita di identità cellulare e/o malattia. Nonostante gli enormi sforzi, la nostra comprensione della formazione e della propagazione dei domini della cromatina è ancora limitata. I domini di cromatina sono stati studiati in condizioni stabili, che non sono favorevoli a seguire gli eventi iniziali durante la loro istituzione. Qui, presentiamo un metodo per ricostruire indebitamente i domini della cromatina e seguire la loro ri-formazione in funzione del tempo. Anche se, prima applicato al caso di formazione del dominio cromatina repressiva mediata da PRC2, potrebbe essere facilmente adattata ad altri domini di cromatina. La modifica di e/o la combinazione di questo metodo con la genomica e le tecnologie di imaging fornirà strumenti preziosi per studiare in dettaglio la creazione di domini di cromatina. Crediamo che questo metodo rivoluzionerà la nostra comprensione di come i domini della cromatina si formano e interagiscono tra loro.

Un sistema generale del sistema di salvataggio condizionato La figura 1 mostra lo schema di targeting per salvare in modo condizionale le cellule EED KO con WT o EED (Y365A) echeggiato dal locus EED endogeno. Dopo aver eliminato EED, viene introdotta una sottounità centrale di PRC2 essenziale per la sua stabilità e attività ezimatica, viene introdotta una cassetta all'interno dell'intron dopo l'esone 9 di EED (Figura 1). La cassetta è costitu...

Questo metodo è progettato per seguire la formazione di domini di cromatina mediati da PRC2 nelle linee cellulari e il metodo può essere adattato a molti altri sistemi.

Un metodo per studiare la formazione de novo dei domini della cromatina

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

Delineamo un sistema per valutare la formazione dinamica dei domini di cromatina. Utilizziamo questo sistema per seguire il reclutamento e la diffusione di domini di cromatina mediati da PRC2 nelle cellule. Il processo può essere messo in pausa in qualsiasi momento per analizzare gli eventi in corso.Questo sistema potrebbe essere orientato a monitorare i cambiamenti dinamici in un dato processo cellulare e quindi non si limita a tracciare la formazione di dominio di cromatina. Inizia progettando RNA guida per eliminare l'esone 10 e 11 di una copia endogena dello sviluppo di ectoderma embrionale, o EED, nelle cellule staminali embrionali del topo utilizzando crispr design tool. Clonare gli RNA guida nel plasmide CRISPR/Cas9 secondo le indicazioni manoscritte.In un formato a piastre a sei pozzetti, trasfettare 200.000 cellule staminali embrionali di topo, o mESC, con un microgrammo di ogni RNA guida utilizzando reagenti di trasfezione secondo le istruzioni del produttore. Cambiare il supporto 24 ore dopo la trasfezione. Due giorni dopo la trasfezione, isolare le cellule positive alla GFP utilizzando FACS.L'efficienza di trasfezione varia da circa il 10 al 30%, quindi ordina circa 500.000 celle per catturare celle positive alla GFP sufficienti per la placcatura. Placcare le cellule isolate positive alla GFP in piastre di 15 centimetri pre-rivestite con gelatina allo 0,1% per la raccolta delle colonie. Far crescere le cellule nel mezzo ESC per circa una settimana fino a quando non sono visibili singole colonie, assicurandosi di cambiare i supporti ogni due giorni.Scegli un minimo di 48 colonie usando una punta di pipetta da 20 microliter per raschiare la colonia durante l'aspirazione. Senza suddividere la colonia in singole cellule, trasferirla su una piastra di 96 pozzi contenente Accutasi. Incubare le colonie a 37 gradi Celsius per 10 minuti per dissociare le cellule.Quindi aggiungere 200 microlitri di supporti ESC a ciascun pozzo con una pipetta multicanale. Mescolare bene e placcare le celle in due piastre separate da 96 pozzi. Utilizzare una delle piastre per la genotipizzazione e mantenere l'altra in crescita fino alla conclusione del genotipizzazione.Estrarre il DNA dalla piastra utilizzando reagenti commerciali e seguendo le indicazioni del produttore. Utilizzare primer di genotipizzazione che si estendono sul sito eliminato per eseguire la genotipizzazione della PCR con Taq DNA polimerasi. Osservare un prodotto di DNA di minor peso molecolare nelle cellule con una cancellazione omozigota rispetto alle cellule di tipo selvatico.Guida al design RNA per introdurre un taglio all'interno dell'introne dopo l'esone 9 di EED utilizzando uno strumento di progettazione CRISPR e clonarlo nel plasmide CRISPR / Cas9 secondo le indicazioni del manoscritto. Progettare un DNA modello donatore che includa la sequenza CDNA EED dopo l'esone 9 e un tag Flag-HA del terminale C a monte di una sequenza T2A-GFP, il tutto in orientamento inverso rispetto alla sequenza genica endogena. Fiancheggia la cassetta con un accettore di giunzione e una sequenza di poliadenilazione annidata tra siti loxP invertiti eterologa, e includi almeno 500 coppie di basi di bracci di omologia da ogni estremità.Dividi il modello donatore in due segmenti di frammenti genetici gBlocks e assemblali in un vettore SMussato PCR usando la clonazione Gibson seguendo le istruzioni del produttore. In formato piastra a sei pozze di pozzo, trasfetto 200.000 mESC con un microgrammo dell'RNA guida e un microgrammo dei modelli donatori. Quindi isolare le cellule positive alla GFP utilizzando FACS.Isolare le singole colonie per la genotipizzazione secondo le indicazioni manoscritte. Utilizzare la citometria del flusso per confermare che gli mESC non hanno espressione perdente di GFP e, in tal caso, isolare le cellule GFP negative da FACS prima di iniziare l'esperimento. Espandere le cellule in cinque piastre di 15 centimetri e indurre l'espressione di EED mutante di tipo selvaggio o gabbia somministrando 4-idrossitamoxifene 5-micromolare per cinque diverse durate di tempo che vanno da zero ore a otto giorni.Cambiare il supporto dopo 12 ore per trattamenti che durano più a lungo. Isolare le cellule ricombinate con successo da FACS utilizzando GFP ed eseguire ChIP-seq per H3K27me2 e H3K27me3 per indagare la loro deposizione temporale alla cromatina in risposta alla ri-espressione di EED di tipo selvaggio o mutante in gabbia. Per convalidare i sistemi di salvataggio indutbili di tipo selvatico e di salvataggio mutante inducibile, la macchia occidentale è stata eseguita su estratti interi dopo l'induzione di EED di tipo selvatico o mutante in gabbia con trattamento con 4-idrossitamoxifene.L'analisi della citometria a flusso è stata utilizzata per confermare l'efficienza dell'espressione T2A-GFP nelle cellule i-WT-r prima e dopo il trattamento con 4-idrossitamoxifene, il che dimostra il successo del lancio della cassetta invertita. ChIP-seq di H3K27me3 è stato eseguito dopo la ri-espressione di EED wild-type o cage-mutant. L'emergere di H3K27me3 si osserva a 12 ore dopo l'espressione EED di tipo selvaggio in siti di nucleazione discreti e poi a 24 ore in regioni distanti dai siti di nucleazione iniziali.ChIP-seq è stato anche usato per tracciare la deposizione temporale di H3K27me2, che sembra precedere la deposizione di H3K27me3. Anche i focolai H3K27me3 e la loro crescita sono stati visualizzati con microscopia a fluorescenza. Dopo 12 ore di espressione EED di tipo selvaggio, ci sono prove della formazione di focolai H3K27me3.Questi focolai aumentano di 24 ore di numero e dimensioni e alla fine si diffondono in grandi regioni del nucleo di 36 ore. Il design accurato dei costrutti di DNA è molto importante per generare il sistema di salvataggio induttibile desiderato. Questo metodo può fornire un controllo temporale e speciale delle mutazioni delle proteine nei topi.In questo modo, si potrebbe determinare l'effetto delle mutazioni in un tessuto specifico o in uno stadio specifico di sviluppo. Attualmente stiamo utilizzando questo sistema per monitorare la creazione dinamica di un altro dominio di cromatina, il complesso repressivo Polycomb 1.

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Questo video descrive il protocollo per il taglio della cromatina utilizzando la digestione enzimatica della nucleasi micrococcica. Il taglio della cromatina è una fase essenziale dell'immunoprecipitazione della cromatina o del flusso di lavoro ChIp, che aiuta a studiare l'interazione proteina-DNA nelle cellule di leucemia mieloide cronica umana. Nel protocollo di funzionalità, il taglio della cromatina viene eseguito utilizzando la sonicazione.

Taglio della cromatina: un metodo per generare frammenti di cromatina utilizzando la digestione enzimatica

La questione di come le autorità di regolamentazione e degli stati della cromatina cromatina influisce sul genoma in vivo è fondamentale per la nostra comprensione di come presto decisioni destino cellulare sono realizzati negli embrioni. ChIP-Seq-il metodo più popolare per studiare le caratteristiche della cromatina a livello globale è qui delineato per gli embrioni di Xenopus.

Genoma Snapshot dei regolatori della cromatina e membri<em&gt; Xenopus</em&gt; Gli embrioni da Chip-Seq

Estrazione del sale sequenziale delle proteine della cromatina associata è uno strumento utile per determinare le proprietà di associazione dei complessi della proteina grande. Questo metodo può essere impiegato per valutare il ruolo delle singole subunità o domini dell'affinità complessiva di una proteina complessa di massa della cromatina.

Estrazioni sequenziale sale per l'analisi di massa di cromatina associazione proprietà di complessi di rimodellamento della cromatina

Vi presentiamo un'immunoprecipitazione della cromatina native modificate sequenziamento (ChIP-seq) metodologia per la generazione di sequenza DataSet adatto per un quadro analitico di densità ChIP-seq nucleosoma integrando l'accessibilità nucleasi di micrococcal (MNase) con misure di modifica dell'istone.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina nativo sequenziamento librerie per analisi di densità del nucleosoma

La plasticità dell'architettura nucleare è controllata da meccanismi epigenetici dinamici tra cui non codificanti RNA, DNA metilazione, nucleosoma riposizionamento come istone composizione e modifica. Qui descriviamo un protocollo di isolamento Formaldehyde-Assisted di elementi normativi (FAIRE) che permette la determinazione dell'accessibilità della cromatina in modo riproducibile, poco costoso e semplice.

Formaldeide-assistita di isolamento di elementi regolatori per l'accessibilità della cromatina di misura in cellule di mammifero

Questo protocollo si concentra sulla preparazione della cromatina da tessuti congelati a scatto ed è adatto per l'immunoprecipitazione della cromatina reticolante (X-ChIP) seguita da analisi quantitative PCR (X-ChIP-qPCR) o approcci di sequenziamento di nuova generazione (X-ChIP-seq).

Estrazione della cromatina dal tessuto epatico chimerico congelato per l'analisi dell'immunoprecipitazione della cromatina

Questo protocollo presenta una tecnica per la mappatura ad alta risoluzione dei siti di replicazione in cromatina strutturalmente conservata in situ che impiega una combinazione di marcatura EdU-streptavidin-Nanogold pre-incorporante e ChromEMT.

Domini replicativi di imaging in cromatina conservata ultrastrutturalmente mediante tomografia elettronica

Questo protocollo descrive il metodo Capture Hi-C utilizzato per caratterizzare l'organizzazione 3D di regioni genomiche mirate di dimensioni megabased ad alta risoluzione, compresi i confini dei domini topologicamente associati (TAD) e le interazioni cromatiniche a lungo raggio tra elementi regolatori e altri elementi di sequenza del DNA.

Decifrare l'organizzazione della cromatina 3D ad alta risoluzione tramite Capture Hi-C

Qui, presentiamo un adattamento della tecnica di cattura della conformazione cromosomica (3C) in dettaglio con particolare attenzione al coinvolgimento e all'apprendimento universitario.

Ottenere una A con le 3C: cattura della conformazione cromosomica per gli studenti universitari

Presentiamo un protocollo di colorazione e analisi per la microscopia di localizzazione a singola molecola della cromatina a tre colori (SMLM) che consente la mappatura riproducibile di eucromatina, eterocromatina e RNAP II per l'analisi spaziale. Questo protocollo consente un'efficiente marcatura multicolore in ambienti nucleari densi, inclusi bersagli associati alla cromatina, consentendo una rilevazione simultanea affidabile.

Un protocollo di microscopia a localizzazione di molecole singole multimarcatore per l'indagine della cromatina nell'ambiente nucleare denso

Scopri un metodo per studiare la formazione dinamica dei domini della cromatina mediati da PRC2 nelle cellule staminali embrionali murine utilizzando CRISPR/Cas9. Questo sistema permette di analizzare in tempo reale i processi cellulari.

Un metodo per studiare la formazione de novo dei domini della cromatina

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