Name: Purificazione di Human S100A12 e delle sue Oligomeri indotte dallo ione per la stimolazione cellulare immunitaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Scopri la purificazione di S100A12 e dei suoi oligomeri indotti da ioni per studi di biologia cellulare e immunologia. Questo metodo fornisce proteine pure e prive di endotossine per la stimolazione dei monociti umani.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del programma di ricerca medica innovativo intramurale della facoltà di medicina dell'Università Muenster (da KE121201 a C.K.) e della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG, Fo354/3-1 a D.F.).

NOT:</</c0> Si prega di fare riferimento alla tabella supplementare 1 per la preparazione di buffer e soluzioni di stock.
1. Espressione proteica in E. coli
<ol><li>
Clonazione
	<ol>
<li>Clona l'uomo s100A12 (ncBI Reference Sequence: NP_005612.1) in un vettore di espressione batterica pET11b. Per esprimere la proteina, trasformare il costrutto in E. coli BL21(DE3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
cultura
	<ol>
<li>Preparare una coltura di avviamento inoculando una singola colonia in 5 mL di mezzo di crescita (brodo LB con 100 ampicillina g/mL) in un tubo rotondo da 14 mL. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi con agitazione a 220 giri/min. Trasferire 2/4 mL di coltura overnight in 400 mL di mezzo di crescita in un flacone di Erlenmayer 2 L e incubare la coltura a 37 gradi centigradi con agitazione a 220 rpm. NOT:</</c5> La densità iniziale della coltura principale deve essere densità ottica a 600 nm (OD600) - 0,1.</li>
		<li>Monitorare l'OD600 durante la crescita. Indurre l'espressione proteica con l'aggiunta di 1 M isopropile--D-Thiogalactopyranosid (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM aOD 600 - 0,5-0,6. Incubare a 37 e 220 giri/min per ulteriori 4 h. NOT:</</c9> In generale, un OD600 di 0,6 sarà raggiunto dopo 1,5,2,5 h a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Preparare 50 mL di sonicazione buffer sciogliendo 50 mM MM Tris, 50 mM NaCl e 1 mM di acido tetraacetico (EDTA) in 40 mL di acqua deionizzata. Regolare il pH con HCl a 8,0 e fare fino a 50 mL. Aggiungere l'inibitore della proteasi (1 compressa per soluzione da 50 mL) e far eclimare il tampone a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Trasferire la coltura batterica in bottiglie di centrifuga e raccogliere le cellule a 3.200 x g per 30 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in 25 mL di cuscinetto di sonicazione a freddo ghiaccio. D'ora in poi tenere le cellule sul ghiaccio. NOTA: Le celle risospese possono essere conservate a -20 gradi centigradi per breve termine e a -80 gradi centigradi a lungo termine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonicazione/lisi
	<ol>
<li>Sonicare le cellule per 6 cicli di 30 s sul ghiaccio. Dopo ogni ciclo, riposare le cellule per 30-60 s per proteggere le cellule dal surriscaldamento.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifugazione ad alta velocità pre-raffreddato da 50 mL e centrifugare in un rotore ad angolo fisso a 15.000 x g per 30 min a 4 gradi centigradi. Decant il lisato eliminato che contiene le proteine citosoliche solubili in un tubo fresco da 50 mL e scarti il pellet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Purificazione delle proteine
<ol><li>Cromatografia per lo scambio di anioni
	<ol>
<li>dialisi f<ol>
<li>Preparare il buffer A per lo scambio di anion -exchange (AIEX) sciogliendo 20 mM Tris, 1 mM EDTA e 1 mM di glicole etilene(2-aminoethylether)-N,N'N'N',N'-tetraacetica (EGTA) in acqua deionizzata e il pH a 8,5 con HCl. Per la dialisi preparare 2 x 5 L e per la cromatografia 2x 1 L del buffer A A IEX. NOT:</</c3> Il volume di dialisato deve essere di circa 100 volte il volume del campione. Tutti i buffer utilizzati per la cromatografia devono essere filtrati (0,45 m o più piccoli) e degassed (ad esempio, dal bagno ad ultrasuoni o dalla degassamento del vuoto).</li>
			<li>Tagliare i tubi di dialisi (peso molecolare cut-off [MWCO]: 3.5 kDa) in una lunghezza appropriata con spazio aggiuntivo per l'aria per garantire la galleggiabilità del campione sopra la barra di stirazione rotante. NOT:</</c4> Glicerolo conserva la membrana e deve essere rimosso prima dell'uso.</li>
			<li>Per ridurre la viscosità della soluzione proteica cancellata dal passaggio 1.3.2, diluire la soluzione con 25 mL di tampone A A per facilitare la successiva applicazione alla colonna di cromatografia. Fissare la prima chiusura sul tubo, caricare il campione nella membrana e fissare la seconda chiusura ad almeno 1 cm dall'estremità superiore del tubo.</li>
			<li>Mettere il contenitore 5 L con tampone A A su una piastra di agitazione, aggiungere una barra di agitazione e la membrana riempita con soluzione proteica. Regolare la velocità per ruotare il campione evitando interferenze con la barra di agitazione rotante. Dialyze per 12-24 h a 4 gradi centigradi, quindi sostituite il tampone di dialisate (tampone A A di AIEX) con una nuova preparazione pre-raffreddata e continuate per almeno 4 ore aggiuntive. Trasferire la soluzione proteica dialisata in un tubo da 50 mL e filtrare attraverso un'unità di filtro di 0,45 m. NOT:</</c5> Stoccaggio possibile.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cromatografia</li>
		<li>Avviare il sistema di cromatografia liquida (FPLC) con manutenzione generale, collegare i buffer di colonna AIEX A e AIEX B (tamponi AIEX A con 1 M NaCl) e la colonna contenente resina anion-exchange. Fare riferimento alla Tabella 1 per i parametri cromatografici generali. NOTA: le apparecchiature Buffer, colonna e FPLC devono essere eclabili alla stessa temperatura prima di iniziare la corsa (fare riferimento ai parametri cromatografici nella tabella 1, tabella 2, tabella 3, tabella 4e tabella 5).</li>
		<li>Evitare la colonna con il tampone A IIEX, caricare successivamente il campione sulla colonna ed eluire le proteine con un gradiente lineare compreso tra 0% e 100% di cuscinetto ad alto sale (AIEX B). Fare riferimento alla tabella 2 per un protocollo del metodo dettagliato.</li>
		<li>Raccogliere 2 frazioni mL durante l'eluizione e analizzare 10 l una di ogni frazione su un'elettroforesi da solfato di solfato di sodio al solfato di sodio polyacrilio (SDS-PAGE) macchiata di Coomassie. Mettere in comune le frazioni contenenti la proteina S100A12 per la dialisi. NOT:</</c13> Il peso molecolare di S100A12 è 10,575 Da.</li>
	</ol></li>
	<li>Cromatografia di interazione idrofobica (HIC) dipendente dal calcio
	<ol>
<li>dialisi f<ol>
<li>Diallyze la soluzione proteica contro 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5 seguendo la procedura descritta nella sezione 2.1.1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cromatografia<ol>
<li>Preparare 1 L di tampone cromatografia HIC A sciogliendo 20 mM Tris, 140 mM NaCl e 25 mMCaCl2 in acqua deionizzata e regolare il pH a 7.5. Per il buffer HIC B, dissolvere 20 mM Tris, 140 mM NaCl e 50 mM EDTA. Regolare il pH a 7.0 e filtrare e degas i buffer. Aggiungete CaCl2 al campione a una concentrazione finale di 25 m equilibratm e filtrate fino a 0,45 m e campionate a 4 gradi (temperatura di colonna).</li>
			<li>Avviare il sistema di cromatografia liquida con manutenzione generale, collegare i buffer di colonna HIC A e B e la colonna. Fare riferimento alla tabella 3 per ulteriori parametri cromatografici.</li>
			<li>Equilibrate la colonna, caricate il campione ed estendete il blocco "lavare il campione non legato" fino a quando il segnale UV non raggiunge nuovamente il livello di base. Quindi iniziare l'eluzione con un chelante di calcio contenente tampone (EDTA). Fare riferimento alla tabella 4 per un protocollo del metodo dettagliato. NOT:</</c8> Esperimenti precedenti hanno dimostrato che un eccesso di calcio sembra essere utile per legare S100A12 alla resina di cromatografia.</li>
			<li>Raccogliere frazioni di picco di 2 mL e analizzare 10 l di ogni frazione su un SDS-PAGE color Coomassie. Pool di frazioni S100A12 pure e diallyze contro la salina tampone di epes (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0) come descritto nella sezione 2.1.1. NOTA: Coefficiente di estinzione di monomerico S100A12 è 2980 M-1 cm-1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Rilevamento e rimozione dell'endotossina
<ol><li>
Rilevamento di endotossina
	<ol>
<li>Per determinare la contaminazione da endotossina, misurare le concentrazioni di proteine diluite dal punto 2.2.2.4. (ad esempio, 1:10 e 1:100 in HBS) utilizzando un saggio di qualità dell'immunosorbent (ELISA) e/o enzimana (ELISA) basato su un saggio di rilevamento dell'endotossina (Tabella dei materiali). Eseguire questo saggio seguendo il protocollo del produttore. NOT:</</c3> Utilizzare soluzioni HBS appena preparate disciolte in acqua ultrapura deionizzata per evitare (nuova) contaminazione da endotossina dal tampone.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rimozione dell'endotossina e concentrazione di proteine
	<ol>
<li>Caricare 15 mL di campione su un 50 kDafugal filter unit e centrifugare a 3.200 x g e 10 C per circa 10 min. Trasferire il flow-through in un vaso fresco (sul ghiaccio) e ricaricare e centrifugare il tubo filtrante 50 kDa tutte le volte che è necessario. Lavare la membrana del filtro due volte con HBS per recuperare quanta più proteine possibile dopo ogni passaggio.</li>
		<li>Concentrate il flusso-attraverso S100A12 utilizzando un filtro centrifuga di 3 kDafugal fino a quando il volume non viene ridotto a un quinto fino a un decimo del volume di carico iniziale (centrifugazione a 3.200 x g, 10 gradi centigradi per circa 30 min). Riempire il filtro tutte le volte che è necessario, risciacquare la membrana e trasferire la soluzione concentrata in un nuovo tubo dopo ogni ricarica. Eliminare il flusso attraverso. Filtrare di nuovo attraverso 50 kDa come descritto sopra. NOT:</</c8> Durante questa procedura, la perdita di proteine è notevole (fino al 50%), ma la preparazione rimanente delle proteine è completamente esaurita da LPS. Questo metodo produce circa 10-15 mg di proteine dalla coltura 400 mL.</li>
		<li>Regola la soluzione proteica a 1 mg/mL con HBS privo di endotossina e misura il contenuto di LPS come descritto al punto 3.1.1. Nel caso in cui la soluzione proteica non sia ancora testata come l'uso di LPS (<0.1 EU/mL), eliminare le contaminazioni residue utilizzando una resina di rimozione dell'endotossina. NOT:</</c9> Con una concentrazione proteica di 1 mg/mL, la contaminazione di 0,1 EU/mL LPS equivale a circa 0,01 pg Proteina LPS/g.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Separazione chimica crosslink e oligomera
<ol><li>
Intercollegamento chimico
	<ol>
<li>Preparare soluzioni di stock altamente pure (endotossina-free) di 1 M CaCl2 e 100 mM snCl2 in acqua diionizzata ultrapura (Tabella dei materiali). Utilizzare questo buffer, appena fatto, per il passaggio successivo.</li>
		<li>Incubare 10 mL di S100A12 depurazione endotossina (concentrazione 1 mg/mL in HBS) per 30 min a temperatura ambiente (RT) con 25 mM CaCl2 per dimerico/tetramerico, o 25 mM CaCl2 e 1 mM snCl2 per l'esameerico/tetrame S100A12 Oligomeri.</li>
		<li>Preparare il crosslinker sciogliendo 8 mg di BS3 in 500 -L di acqua endotossina senza endotossina direttamente prima dell'uso (8 mg di crosslinker per una soluzione proteica iospiatoda da 10 mL equivale a una concentrazione finale di 1,4 mM). Mescolare il crosslinker e il campionamento con il pipettaggio e incubare per ulteriori 30 min a RT. Quench la reazione aggiungendo 1 M Tris-HCl, pH 7,5 ad una concentrazione finale di 50 mM e filtrare fino a 0,45m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cromatografia ad esclusione di dimensioni
	<ol>
<li>Eri il campione incrociato a 12-15 gradi (temperatura di colonna) e inizia il sistema di cromatografia liquida con manutenzione generale. Connettere il buffer di colonna (HBS) e la colonna size-exclusion. Per informazioni dettagliate, fare riferimento alla tabella 5.</li>
		<li>Egli la colonna in HBS, caricare il campione e raccogliere le frazioni di picco (1-2 mL) durante la corsa. Analizzate queste frazioni su un gradiente di 4,20% SDS-PAGE e raggruppate frazioni con le bande principali del complesso proteico desiderato. NOT:</</c12> L'idrolisi dei reagenti dell'esterinazione NHS come BS3 in soluzioni acquose si traduce in una forte assorbimento a 280 nm. Il crosslinker non legato (peso molecolare: 572 g/mol) si eluisce alla fine della corsa e si traduce in un forte picco.</li>
		<li>Concentrare le soluzioni utilizzando unità filtro centrifughe con MWC di 10 kDa (dimero), 30 kDa (tetramer) o 50 kDa (hexamer). Determinare la contaminazione da endotossina come descritto nella sezione 3.1. Se necessario, rimuovere gli LPS rimanenti con una resina di rimozione dell'endotossina seguendo le raccomandazioni del produttore (Tabella dei materiali).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Test funzionali sui monociti
<ol><li>Preparazione di monociti
	<ol>
<li>Isolare i monociti dai cappotti di buffy umani mediante la centrifugazione del gradiente di densità e il successivo arricchimento dei monociti utilizzando un kit magnetico di separazione del tallone (Tabella dei materiali). NOT:</</c3> Questo protocollo si tradurrà in circa 5-7 x 107 monociti (un cappotto di bufala) con una purezza di 83-95%. Poiché il numero, ma anche la reattività delle cellule dipende fortemente dal donatore, il protocollo potrebbe dover essere aumentato (a seconda del numero di cellule richiesto).</li>
		<li>Per la centrifugazione a densità, equilibrate la soluzione di separazione (densità 1,077 g/mL) a RT e trasferite 20 mL in tubi centrifugati da 50 mL (2 tubi per cappotto di bufala). Diluire il sangue dal cappotto di bufalo umano con la soluzione di sale tampone di Hank (HBSS) per un volume totale di 60 mL e strato 30 mL di questa miscela con attenzione sulla parte superiore del mezzo di separazione. Centrifuga a 550 x g per 35 min a RT. Disattivare il freno centrifuga.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione, le cellule del sangue periferiche mononucleari (PBMC) si trovano direttamente sopra il mezzo di separazione. Trasferire queste cellule in un tubo di centrifuga fresco da 50 mL, fino a 50 mL con HBSS e centrifugare a 170 x g per 10 m. Aspirata il supernatante e rispendere il pellet cellulare in un piccolo volume di HBSS tramite pipettaggio.</li>
		<li>Riempire il tubo fino a 50 mL e centrifugare a 290 x g per 10 min. Aspirate il supernatante di nuovo, rispendere le cellule in HBSS (50 mL) e centrifuga a 170 x g per 10 min. Contare le cellule e risospende nel buffer di separazione delle celle (Tabella dei materiali. /c9>) a una concentrazione di 5 x 107 celle/mL. NOT:</</c11> Invece di HBSS, la salina (PBS) con buffer fosfato può essere utilizzata per lavare le cellule.</li>
		<li>Per l'isolamento dei monociti dai PBMC, utilizzare un kit di isolamento cellulare magnetico negativo e seguire il protocollo del produttore. Contare i monociti e risospendere in mezzo monocito (RPMI 1640, 15% siero di vitello fetale inattivato dal calore [FCS], 4 mM L-glutamina, 100 U/mL penicillina/streptomicina) ad una concentrazione di 2 x 106 cellule/mL.</li>
		<li>Ai monociti della coltura, i piatti di coltura del mantello (ad esempio, 100 mm) con pellicola idrofobica e permeabile al gas, adatti alle celle di sospensione (Tabella dei materiali). Sterilizzare le piastre utilizzando la luce UV per circa 30 min. Trasferire le cellule in queste piastre di coltura e lasciarle riposare per tutta la notte a 37 e 5% CO2. NOT:</</c15> Utilizzare 15-25 mL di sospensioni cellulari per piatto rivestito.</li>
	</ol></li>
	<li>Stimolazione monociita
	<ol>
<li>Stimolazione con S100A12 (wildtype) NOT:</</c2> Per distinguere l'S100A12 non trattato (prodotto finale dalla sezione 2.2.2) dalla proteina crosslinked, S100A12 è indicato come "wildtype".<ol>
<li>Trasferire le cellule riposate in un tubo centrifugato da 50 mL e centrifugare a 350 x g per 10 min. Aspirate il supernatante e risospendere il pellet cellulare in mezzo di stimolazione (RPMI 1640, 5% FCS inattivato dal calore, 4 mM L-glutamine, 100 U/mL penicillina/ streptomicina) ad una concentrazione di 2 x 106 cellule/mL.</li>
			<li>Per la stimolazione, utilizzare 24 piastre di sospensione ben e aggiungere 250 l di sospensione cellulare per pozzo (0,5 x 106 cellule/ pozzo). Aggiungete 50 polimyxinB ai pozzi desiderati, seguiti da LPS in concentrazioni diverse (25, 50, 100 e 200 pg/mL) o dal tipo selvaggio S100A12 (10, 20, 40, 60 g/mL). Inoltre, applicare la proteina non trattata o denaturata al calore (99 , 10 min) in diverse concentrazioni alle cellule. NOT:</</c7> Un breve trattamento termico denatura la proteina S100A12 ma non ha alcun effetto sull'LPS.</li>
			<li>Incubare piastre per 4 h a 37 e 5% DI CO2. Raccogliere le cellule trasferendo la sospensione cellulare di ogni pozzo a tubi di reazione 1,5 mL. Centrifuga a 500 x g per 10 min. Trasferire i supernatanti in tubi freschi e misurare il rilascio di TNF, in diverse diluizioni (ad esempio, 1:2, 1:5, 1:10) con un kit tNF-ELISA umano seguendo le raccomandazioni del produttore.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Stimolazione con oligomeri S100A12<ol>
<li>Preparare e semiare monociti in 24 piastre di sospensione ben come descritto sopra. Stimolare le cellule aggiungendo oligomeri S100A12 dal punto 4.2.3. in diverse concentrazioni molare (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM). NOT:</</c11> Per confrontare le capacità dei diversi oligomeri per stimolare i monociti, gli oligomeri sono stati applicati alle cellule in concentrazioni molare comparabili.</li>
			<li>Incubare per 4 h a 37 e 5% di CO2,raccogliere le cellule e misurare il rilascio di TNF, come descritto sopra.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, descriviamo l'espressione batterica priva di tag dell'uomo S100A12 e la sua purificazione, nonché la separazione in diversi oligomeri indotti dagli ioni per la stimolazione delle cellule immunitarie. Rispetto alla letteratura pubblicata sulla purificazione della proteina S100A128,23,24, l'uso dell'alto CaCl2 (25 mM) nella cromatografia di interazione idrofobica è a nostra conoscenza unica. Divers...

S100A12 è una proteina legante di calcio che è prevalentemente prodotta da granulociti umani. La proteina è sovraespressa durante l'infiammazione (sistemica) e i suoi livelli di siero, in particolare nelle malattie (auto)infiammatorie come l'artrite idiopatica giovanile sistemica (sJIA), la febbre mediterranea familiare (FMF) o la malattia di Kawasaki (KD) l'attività della malattia e la risposta alla terapia. A seconda dei recettori di riconoscimento dei modelli (PRR), come i recettori a pedaggio (TLR), il sistema immunitario innato può essere attivato da modelli molecolari associati a i patogeni (PPR) come lipopolioaccharides (LPS) o modelli molecolari associati al danno (DAMP; denominato anche "alarmins"). I DAMP sono molecole endogene come proteine cellulari, lipidi o acidi nucleici1. Le funzioni DAMP sono ben descritte per i membri della famiglia di proteine calgranulina, S100A8/A9 e S100A122, che sono anche segnalati per operare come peptides antimicrobico cheonali metallico divalenteleoni 3,4, 5,6. A seconda della forza iologica disponibile S100A12 può, come altri membri della famiglia S100, organizzare in diversi omomultime e fino a poco tempo fa l'impatto di S100A12-oligomerisation sull'interazione PRR, in particolare TLR4, era sconosciuto.
La forma monomerica della proteina (92 aminoacidi, 10,2 kDa) è costituita da due strutture eliche-loop-eliche a mano eF collegate da un linker flessibile. La mano EF -terminale Ccontiene il classico motivo di rilegatura Ca2,mentre la mano EF -terminale Npresenta una struttura a ciclo esteso specifica della proteina S100 ('pseudo-EF-hand') e rivela una ridotta affinità Ca2. Il legame di Ca2 xda parte di S100A12 può indurre un importante cambiamento conformazionale nel capolinea Cdelle proteine, che si traduce in un'esposizione di una macchia idrofobica su ciascun monomero e forma l'interfaccia di dimerizzazione. Così, in condizioni fisiologiche, la più piccola struttura quaternaria formata da S100A12 è un dimero non covalente (circa 21 kDa) in cui i singoli monomeri sono in orientamento antiparallelo. Una volta disposto come dimero, S100A12 viene segnalato al sequestro di n2 e ad altri ioni metallici divalenti, ad esempio Cu2, con alta affinità7. Questi ioni sono coordinati all'interfaccia dimero S100A12 da aminoacidi H15 e D25 di una sottounità e H85, nonché H89 dell'anti-paralleling di altre sottounità8,9,10. Mentre gli studi precedenti propongono che l'S100A12 caricato dan.2o 2 può indurre l'organizzazione della proteina in omo-tetrameri (44 kDa) e per provocare un aumento dell'affinità Ca2,12, recente titolazione metallica Gli studi6 suggeriscono che il legame Di Ca2 diS100A12 per aumentare l'affinità della proteina conn. 2. Una volta che le lancette EF S100A12 sono completamente occupate da Ca2o, si pensa che ca2 o più si leghi tra i dimeri, innescando la formazione di esamere (circa 63 kDa). L'architettura della struttura trimestrale hexamica è chiaramente diversa da quella del tetramero. Si propone che l'interfaccia tetramer è interrotta per dare origine a nuove interfacce dimer-dimer che beneficiano la formazione di esagomeri10. S100A12 è quasi esclusivamente espresso da granulociti umani dove costituisce circa il 5% di tutte le proteine citosoliche13. Nella sua funzione DAMP S100A12 è stato storicamente descritto come agonista del recettore multi-ligando per prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE), poi chiamato extracellulare proteina legante RAGE di recente identificata (EN-RAGE)14. Anche se in precedenza abbiamo segnalato biochimica S100A12-legatura sia rage e TLR415, abbiamo recentemente dimostrato monociti umani per rispondere alla stimolazione S100A12 in modo tramite TLR416. Ciò richiede la disposizione di S100A12 nella suastrutturatrimestrale hexameric indotta da Ca2/ n2.
Qui descriviamo una procedura di purificazione per l'uomo ricombinante S100A12 e le sue oligomeri indotte dagli ioni per le stimolazioni delle cellule immunitarie16,17. Questo si basa su una strategia di cromatografia in due fasi, che inizialmente include una colonna di scambio di anioni per isolare e concentrare la proteina e rimuovere le contaminazioni sfuse (ad esempio, endotossine/lipopolysaccharides)18. Le resine di cromatografia dello scambio io-scie separano le proteine sulla base di diverse cariche nette di superficie. Per le proteine acide come S100A12 (punto isoelettrico di 5.81), un sistema di tampone con un pH di 8,5 e una forte resina di scambio di anion porta ad una buona separazione. Le proteine legate sono state eluite con un gradiente tampone ad alto contenuto di sale. Con un aumento degli ioni negativi di forza ionica nel tampone di eluizione competere con le proteine per le cariche sulla superficie della resina. Le proteine si eludono individualmente a seconda della loro carica netta e in conseguenza di ciò, i tamponi descritti qui permettono di isolare e concentrare la proteina S100A12 sovraespressa. A causa di gruppi caricati negativamente nei lipopolioaccharide, queste molecole si legano anche alle resine di scambio di anioni. Tuttavia, la loro maggiore carica netta si traduce in una successiva eluizione nel gradiente ad alto sale applicato. La seconda fase della procedura di purificazione è stata introdotta a i fini della lucidatura. Questo fa uso della capacità di legame del calcio di S100A12 e rimuove le impurità rimanenti su una colonna di interazione idrofobica. Il legame di calcio di S100A12 porta a un cambiamento conformazionale e ad un'esposizione di macchie idrofobiche sulla superficie della proteina. A tale condizione, S100A12 interagisce con la superficie idrofobica della resina. Al momento del chelante di calcio da parte di EDTA, questa interazione è invertita. In presenza di ioni, in particolare calcio e zinco, S100A12 si organizza in oligomeri ommerici. Per studiare le relazioni struttura-funzione dei diversi oligomeri, abbiamo stabilizzato la cromatoria dimericica, tetramerica e hexamcumso S100A12 con un crosslinker chimico e abbiamo separato i complessi su una colonna cromatografica di dimensioni-esclusione. Infine, per analizzare la funzionalità e l'attività biologica della proteina purificata e dei suoi oligomeri indotti dagli ioni, è possibile confrontare il rilascio di citochina del monocito stimolato S100A12 e del monocito stimolato LPS.
Finora sono stati descritti vari metodi per purificare S100A12. Jackson et al.19, per esempio, ha pubblicato un protocollo con purificazione tramite una colonna di scambio di anion e una successiva cromatografia di esclusione di dimensioni. La purificazione in una colonna di esclusione delle dimensioni porta a buoni risultati, ma, ad esempio a causa dei volumi di carico limitati, è meno flessibile in termini di scalabilità. Un approccio diverso, pubblicato da Kiss et al.20, descrive la purificazione delle proteine marcate tramite la colonna di affinità Ni2 come primo passaggio di purificazione, seguito da scissione enzimatica per rimuovere il tag e ulteriori passaggi di purificazione. In contrasto con gli studi foriciti19,20, la proteina prodotta come descritto in questo protocollo è determinata per esperimenti sulle cellule immunitarie. Pertanto, la contaminazione da endotossina residua dalla coltura batterica è una sfida. Anche se finora sono stati descritti diversi approcci per la rimozione dell'endotossina, non esiste un metodo uniforme che funzioni altrettanto bene per una determinata soluzione proteica21,22.
In sintesi, il nostro protocollo combina i vantaggi di un'espressione senza tag in un sistema batterico con un'efficiente rimozione dell'endotossina e un alto rendimento di proteine pure.

<table><tbody><tr><td>pET11b vettore</td><td>Novagen</td><td>&nbsp; </forte></td><td><forte>&nbsp; </td></tr><tr><td>BL21(DE3) competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527</td><td>&nbsp; </forte></td></tr><tr><td><forte>&nbsp; </forte></td><td><forte>&nbsp; </forte></td><td><forte>&nbsp; </forte></td><td><forte>&nbsp; </td></tr><tr><td>100x Aminoacidi non essenziali</td><td>Merck</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>25% HCl</td><td>Carl Roth</td><td>X897.1</td><td></td></tr><tr><td>4&minus; 20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td><td>BioRad</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Carl Roth</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio Dihydrat</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Soluzione decolorante</td><td>BioRad</td><td>1610438</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Soluzione colorante</td><td>BioRad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit per l'arricchimento di monociti umani</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td>Kit di isolamento cellulare magnetico negativo</td></tr><tr><td>EDTA sale disodico diidrato</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>EndoLISA</td><td>Hyglos</td><td>609033</td><td>Rilevamento di endotossine saggio</td></tr><tr><td>Acqua ultrapura senza endotossine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-011-A Acqua</td><td>ultrapura per la preparazione di tamponi privi di endotossine</td></tr><tr><td>EndoTrap rosso</td><td>Hyglos</td><td>321063</td><td>Resina per la rimozione delle endotossine</td></tr><tr><td>FBS (inattivata termicamente)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, senza calcio, senza magnesio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Carl Roth</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (alta qualità, testetto di endotossine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>hTNF-alfa - OptEia ELISA Set</td><td>BD</td><td>555212</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-szlig;-D-tiogalattopiranosid)</td><td>Carl Roth</td><td>CN08.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina (200 mM)</td><td>Merck</td><td>K 0282</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaridi da E. coli O55:B5</td><td>Merck</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, umano</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td>Soluzione di separazione (centrifugazione a gradiente di densità)</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Merck</td><td>A 2212</td><td></td></tr><tr><td>Fenil Sefarosio ad alte prestazioni</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1082-01</td><td>Resina per cromatografia di interazione idrofobica</td></tr><tr><td>Polimixina B</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pmb</td><td></td></tr><tr><td>Compresse di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>Resina per cromatografia a scambio anionico</td></tr><tr><td>Tampone RoboSep</td><td>Stemcell</td><td>20104</td><td>Tampone di separazione cellulare (sezione 5.1.4)</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Merck</td><td>F 1215</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Carl Roth</td><td>P031.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Carl Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di zinco</td><td>Carl Roth</td><td>T887</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 &micro; m filtro per siringa</td><td>Merck</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>14 mL provette a fondo tondo</td><td>BD</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>2 L Pallone Erlenmyer</td><td>Carl Roth</td><td>LY98.1</td><td></td></tr><tr><td>24 pozzetti piastre di sospensione</td><td>Greiner</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>5 L misurino</td><td>Carl Roth</td><td>CKN3.1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL provette da centrifuga coniche</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga ad alta velocità da 50 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3,01,22,178</td><td></td></tr><tr><td>Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-15 MWCO 3 kDa Unità</td> di filtro centrifugo <td>Merck</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 MWCO 50 kDa Merck</td><td></td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura (100 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Chiusure per tubi per dialisi</td><td>Spettro</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Magnete EasySep 'The Big Easy'Stemcell</td><td></td> <td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Provette per collettore di frazioni 5 mL</td><td>Greiner</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>pellicola Lumox, 25 &; micro; m, 305 mm x 40 m</td><td>Sarstedt</td><td>94,60,77,316</td><td>Film per piastre di coltura di monociti</td></tr><tr><td>Membrana per dialisi Spectra/Por (3,5 kDa)Unità filtrante Spectra/Por</td> <td>132724</td><td></td> <td>Spectrum</td></tr><tr><td>Merck</td><td>Merck</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Incubatore (con agitazione)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Purificatore KTA UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC System</td></tr><tr><td>Raccoglitore di frazioni</td><td>GE Healthcare</td><td>Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga (con rotore A-4-81)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso</td><td>Eppendorf</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Brandelin</td><td>UW2070</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di fluorescenza</td><td>Tecan</td><td>M200PRO</td><td></td>infinito</tr><tr><td>pHmetro</td><td>Knick</td><td>765</td><td></td></tr></tbody></table>

purificazione di human s100a12 e delle sue oligomeri indotte dallo ione per la stimolazione cellulare immunitaria

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

In questo protocollo, descriviamo un metodo per purificare la proteina che lega il calcio umano S100A12 e i suoi oligomeri indotti dagli oligomeri di Escherichia coli per la stimolazione delle cellule immunitarie. Questo protocollo si basa su una strategia di cromatografia in due fasi, che comprende la pre-purificazione delle proteine su una colonna di cromatografia di scambio di anioni e un successivo passo di lucidatura su una colonna di interazione idrofobica. Questa strategia produce proteine S100A12 ad alta purezza e resa a costi gestibili. Per i test funzionali sulle cellule immunitarie l'eventuale contaminazione da endotossina residua richiede un attento monitoraggio e ulteriori passaggi di pulizia per ottenere proteine prive di endotossina. La maggior parte delle contaminazioni da endotossina può essere esclusa dalla cromatografia di scambio di anioni. Per esaurire le contaminazioni residue, questo protocollo descrive una fase di rimozione con filtri centrifughi. A seconda della forza io-resistenza disponibile S100A12 può organizzare in diversi omomultimer. Per studiare il rapporto tra struttura e funzione, questo protocollo descrive ulteriormente il trattamento io-io della proteina S100A12 seguito dal crosslinking chimico per stabilizzare gli oligomeri S100A12 e la loro successiva separazione per dimensione-esclusione Cromatografia. Infine, descriviamo un saggio basato sulle cellule che conferma l'attività biologica della proteina purificata e conferma la preparazione senza LPS.

In seguito alla pre-purificazione sulla colonna AIEX (Figura 1A-C) e al successivo HIC dipendente dal calcio (Figura 2A,B), sono state ottenute proteine altamente pure (Figura 2C). Inoltre, le misurazioni dell'endotossina hanno rivelato un successo della rimozione degli LPS. Il contenuto LPS seguito all'AIEX è stato misurato in una diluizione 1:10 superiore al limite di rilevamento degli saggi, vale...

Questo protocollo descrive un metodo di purificazione per la proteina ricombinante di legame del calcio senza tag S100A12 e i suoi oligomeri indotti dagli ioni per i saggi di stimolazione monocite umana.

Purificazione di Human S100A12 e delle sue Oligomeri indotte dallo ione per la stimolazione cellulare immunitaria

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Questo protocollo descrive una procedura di purificazione completa per la proteina legante il calcio umano, S100A12, e in particolare, per i diversi oligomeri indotti dagli ioni per implicazioni di ricerca a valle. Con questa tecnica, siamo in grado di mantenere l'alta resa di proteine molto pure ed endotossine. Il cross-linking chimico e la separazione sulla colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni è un metodo convincente per generare proteine omo-oligomeriche per ulteriori test funzionali.La nostra tecnica ci consente di aspetti meccanicistici di S100A12 come ligando del recettore del riconoscimento dei modelli e informazioni artistiche per sviluppare idealmente nuovi interventi mirati e migliorare i test diagnostici. Oltre a guardare questo video, consigliamo un'attenta lettura del protocollo, poiché descriviamo una procedura complessa in più step. Per iniziare, tagliare un tubo di dialisi in una lunghezza appropriata, circa 30 centimetri, con spazio aggiuntivo per l'aria.Immergere la membrana in acqua deionizzata per 15-30 minuti per rimuovere il glicerolo. Per ridurre la viscosità della soluzione proteica cancellata, diluire la soluzione con 25 millilitri di tampone AIEX A.Attaccare la prima chiusura sul tubo. Caricare il campione nella membrana e fissare la seconda chiusura ad almeno un centimetro dall'estremità superiore del tubo.In una stanza raffreddata a quattro gradi Celsius, posizionare il contenitore con tampone AIEX A su una piastra di agitazione, aggiungere una barra di agitazione e la membrana piena di soluzione proteica. Regolare la velocità per ruotare il campione in modo che non vi siano interferenze con la barra di agitazione rotante. Dializzare per 12-24 ore a quattro gradi Celsius, quindi sostituire il buffer dializzato con tampone libero pre-raffreddato A e continuare per almeno quattro ore aggiuntive.Trasferire la soluzione proteica dializzata dal tubo in un tubo da 50 millilitri attraverso un'unità filtrante da 0,45 micron. Avviare l'FPLC con manutenzione generale. Collegare i buffer di colonna AIEX A e AIEX B alle valvole tampone e alla resina di scambio ionico contenente colonna alle porte delle colonne dell'FPLC.Regolare di conseguenza i parametri cromatografici generali. Avviare il programma AIEX nel software FPLC e scegliere il volume di equilibrazione per il buffer A.Successivamente, caricare il campione sulla colonna ed elutare le proteine con un gradiente lineare dallo 0% al 100% di buffer di sale alto. Raccogliere due frazioni di millilitro durante l'eluizione.Analizzare le frazioni eluizzate dopo aver terminato la corsa. Per questo, caricare 10 microlitri di ogni frazione su una pagina Coomassie macchiata al 15%SDS e identificare le frazioni contenenti S100A12. Mettere in comune questi S100A12 contenenti frazioni per la dialisi in salina tamponata da TRIS.Per continuare la purificazione proteica, dopo la dialisi proteica, aggiungere un cloruro di calcio al campione a una concentrazione finale di 25 millimolare, che faciliterà il legame di S100A12 alla resina nella fase successiva. Quindi, filtrare il campione attraverso un filtro con una dimensione di versamento di 0,45 micron. Equilibrare i buffer HIC e i campioni a quattro gradi Celsius.Collegare quindi i buffer di colonna HIC A e B e la colonna al sistema e regolare i parametri. Avviare il metodo per equilibrare la colonna con uno o due volumi di colonna di buffer HIC A e caricare il campione e il blocco campione non associato di lavaggio con un segnale UV raggiunge nuovamente il livello di base. Quindi iniziare l'eluizione con un chelatore di calcio contenente EDTA tampone.Raccogliere due millilitri di frazioni di picco durante l'eluizione. Dopo aver analizzato 10 microlitri di ogni frazione su una pagina Coomassie macchiata del 15%SDS, identificare frazioni S100A12 pure. Mettere in comune queste frazioni e dializzare contro HBS.In primo luogo, caricare 15 millilitri di campione su un'unità filtrante centrifuga da 50 kilodalton. Centrifuga a 3200 volte g a 10 gradi Celsius per circa 10 minuti. Trasferire il flusso filtrato in un recipiente fresco, sul ghiaccio.Ora, utilizzare un millilitro di HBS per risciacquare la membrana filtrante e per diluire la soluzione concentrata nella punta del filtro. Centrifugare di nuovo per recuperare quanta più proteina possibile nel flusso. Per filtrare la soluzione, ripetere il carico del campione e la centrifugazione tutte le volte che è necessario.Successivamente, per concentrare l'S100A12 contenente il flusso, caricarlo in un filtro centrifugo a tre kilodalton e centrifugare a 3200 volte g, 10 gradi Celsius per circa 30 minuti. Ora il volume è ridotto a 1/5 fino a 1/10 del volume di carico iniziale. Trasferire la soluzione concentrata in un nuovo tubo.Ripetere il passaggio di concentrazione tutte le volte che è necessario. Dopo il cross-linking chimico, secondo il manoscritto, eseguire la cromatografia ad esclusione delle dimensioni. Equilibrare la colonna in HBS, caricare il campione e raccogliere frazioni di picco da uno a due millilitri durante la corsa.Dopo aver analizzato queste frazioni su una pagina SDS dal 4 al 20%, le frazioni di pool con le bande principali del complesso proteico desiderato. Quindi concentrare le soluzioni come fatto in precedenza. Per isolare i monociti dai cappotti buffy umani per centrifugazione gradiente di densità, equilibrare prima la soluzione di separazione a temperatura ambiente.Trasferire 20 millilitri in tubi di centrifuga da 15 millilitri, due tubi per strato buffy. Diluire il sangue dal mantello di buffy umana con HBSS a un volume totale di 60 millilitri e strato 30 millilitri di questa miscela con attenzione sopra il mezzo di separazione. Centrifuga a 550 volte g per 35 minuti a temperatura ambiente.Spegnere il freno della centrifuga. Dopo la centrifugazione, le cellule del sangue periferiche mononucleari si trovano direttamente sopra il mezzo di separazione. Con una pipetta, trasferire queste cellule in un tubo di centrifuga fresco da 50 millilitri.Riempire il tubo con HBSS a 50 millilitri e centrifugare a 170 volte g per 10 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un piccolo volume di HBSS pipettando. Quindi, riempire il tubo fino a 50 millilitri e centrifugare a 290 volte g per 10 minuti.Aspira di nuovo il supernatante. Rimospendare le cellule in 50 millilitri di HBSS e centrifugare a 170 volte g per 10 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in un piccolo volume di un millilitro di tampone di separazione, contare le cellule e aggiungere tampone a una concentrazione di cinque volte 10 alle sette cellule per millilitro.Per l'isolamento dei monociti dalle cellule del sangue periferiche mononucleari, utilizzare un kit di isolamento cellulare negativo magnetico e seguire il protocollo del produttore. Utilizzare un contatore di celle automatizzato per contare i monociti e il resuspend in mezzo monocito a una concentrazione di due volte 10 alle sei cellule per millilitro. Per coltura dei monociti, stendere un piatto di coltura cellulare con un film permeabile al gas idrofobico adatto alle celle di sospensione.Posizionare le piastre sotto la luce UV per circa 30 minuti per la sterilizzazione. Trasferire da 15 a 25 millilitri della sospensione cellulare a queste piastre di coltura e lasciarli riposare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo la pre-purificazione sulla colonna AIEX e la successiva HIC dipendente dal calcio, è stata ottenuta una proteina altamente pura.Come ulteriore controllo, i monociti umani sono stati stimolati con l'LPS e hanno prodotto proteine di tipo selvatico. L'esposizione proteica a diversi ioni si traduce in una disposizione di diversi oligomeri S100A12. L'aumento delle concentrazioni di zinco induce la disposizione di S100A12 in tetrameri ed esameri al momento della separazione sulla pagina SDS macchiata da quattro a 20%Coomassie.Quando un eccesso di ioni è stato applicato prima del collegamento incrociato, ha indotto uno spostamento pronunciato dell'equilibrio oligomero. S100A12 è stato incrociato in presenza di calcio 25 millimolare o 25 millimolare di calcio e uno zinco millimolare. Dopo il collegamento incrociato nel tampone HBS con cloruro di calcio millimolare e un cloruro di zinco millimolare, esamero e tetramero sono stati separati.Tetramero e dimero sono stati separati in tampone HBS con cloruro di calcio millimolare da 25 millimolare. Un esempio di oligomeri raggruppati e concentrati dopo la separazione su una pagina SDS sfumato da quattro a 15% mostra dimero, tetramero ed esamero. La stimolazione monocitare con esamerico S100A12 ha provocato un rilascio alfa TNF pronunciato.Dopo la rimozione dell'endotossina, è importante non reintrodurre la contaminazione nei campioni durante la successiva generazione e purificazione degli oligomeri. L'analisi a valle di qualsiasi processo relativo all'oligomerizzazione S100A12 è concepibile. Allo stesso modo, possono essere analizzati gli amminoacidi e le condizioni ioniche che influenzano il processo di oligomerizzazione stesso.Attualmente stiamo usando oligomeri S100A12 separati secondo il protocollo descritto per sviluppare ligandi peptidici specifici e anticorpi per bloccare la segnalazione della proteina attraverso TLF4 e per sviluppare e migliorare i test diagnostici.

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