Name: Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Scopri come generare modifiche genomiche definite con CRISPR-Cas9 nelle cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo crea linee isogeniche con mutazioni specifiche per studiare funzioni geniche e malattie.

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Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti del National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health attraverso sovvenzioni U01HL099656 (P.G. e D.L.F.) e U01HL134696 (P.G. e D.L.F.).

1. Progettazione e costruzione dell'RNA guida (gRNA)
NOTA: ogni gRNA è costituito da due oligonucleotidi della coppia di basi (bp) 60 che vengono anneali per generare un doppio filato (ds) oligonucleotide (Figura 1A-C). La tempistica per la progettazione, la generazione e l'efficienza di taglio dei gRNA è di circa 2 settimane (Figura 2).
<ol><li>Selezionare la regione del DNA di interesse da modificare nel genoma e identificare 3-4 23 bp sequenze che si adattano al formato, 5'-G(N19)NGG-3'. Queste sequenze devono trovarsi entro 20 bp dall'area di interesse. NOTA: il targeting può essere eseguito sul filo senso o anti-senso.</li>
	<li>Valutare le sequenze di gRNA per la ridondanza genomica e la probabilità fuori bersaglio utilizzando una risorsa come CRISPOR (http://crispor.tefor.net).</li>
	<li>Incorporare la sequenza di destinazione di 20 bp (escluso il motivo adiacente protospaziale o PAM) in due oligonucleotidi da 60 mer come mostrato (le sequenze sono da 5' a 3' e rosso e verde sono complementi inversi come mostrato nella Figura 1C).</li>
	<li>Ordinare i due oligonucleotidi da 60 bp dal fornitore di scelta. Una volta ricevuti gli oligonucleotidi, risospendere ciascuno a una concentrazione finale di 100 M in ddH2O. Fare uno stock di lavoro di 10 M.</li>
	<li>Anneal i due oligonucleotidi e generare un frammento di dsDNA di 100 bp utilizzando la polimerasi del DNA (Tabella dei materiali). Unire 5 luna di 10 M di oligonucleotide in avanti e 5 di 10 M di oligonucleotide inversa in un tubo a catena di polimerasi (PCR) e incubare a 95 gradi C per 5 min. Raffreddare la reazione per 10 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Impostare la PCR come descritto nella Tabella 1. Eseguire l'amplificazione PCR in un ciclore termico utilizzando i parametri descritti nella tabella 2.</li>
	<li>Visualizzare i prodotti PCR su un bromuro di etico (EtBr) di agarose gel elettroforizzato a 80-100 V per 40 min. Eccita la banda da 100 bp (Figura 3A), visualizzata su una scatola luminosa a LED, dal gel utilizzando una lama di rasoio e purificare con un gel kit di estrazione (Tabella dei materiali).</li>
</ol>2. Progettazione di prime rinportaCCa PCR per lo screening
<ol><li>Eseguire lo screening del DNA modificato utilizzando primer PCR in avanti e indietro progettati specificamente per amplificare una regione di 400-500 bp del gene di interesse (Tabella 2). Utilizzare il DNA isolato da qualsiasi linea iPSC di controllo per confermare un amplificatore pulito quando si esegue lo screening PCR.</li>
	<li>Visualizza i prodotti PCR su un gel 1.5% (w/v) seguendo l'elettroforesi a 80-100 V per 1 h. NOTA: la sequenza dei cloni modificati viene eseguita utilizzando un primer nidificato progettato in seguito alla conferma del set di primer di screening. I campioni vengono inviati a una fonte commerciale per il sequenziamento.</li>
</ol>3. Preparazione del plasmide vettoriale gRNA_clonazione
<ol><li>Per linearizzare il vettore di clonazione, prendete un tubo di centrifuga di 1,5 mL e aggiungete 1-5 g di DNA del vettore gRNA_cloning insieme a 4 -L del buffer enzimatico di restrizione AflII e 1,5 l di Enzima di restrizione AflII. Portare la reazione a 24 : L di ddH2O. Mescolare la reazione pipetting su e giù. Incubare a 37 gradi durante la notte (O/N).</li>
	<li>Elettroforesi su un gel di agarose dell'1% a 80-100 V per 1 h e bande di accise (la dimensione prevista della banda è di 3519 bp).</li>
	<li>Estrarre e purificare come nel passaggio 1.6.</li>
</ol>4. Assemblaggio del vettore gRNA
<ol><li>Impostare le reazioni e assemblare frammenti di DNA utilizzando il kit di assemblaggio (Tabella dei materiali) a rapporti 1:5 del vettore di clonazione gRNA digerito AflII a 100 bp gel inserto purificato, come descritto nella tabella 3.</li>
	<li>Incubare la reazione a 50 gradi centigradi per 15 min. Diluire la reazione 1:3 in ddH2O e utilizzare 3 -L per la trasformazione batterica, secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Piastre su piastre kanamycin LB/agar.</li>
	<li>Scegli 3-5 colonie per gRNA. Inoculare ogni colonia in 4 mL di LB e crescere O/N a 37 gradi centigradi in un incubatore di agitazione orbitale.</li>
	<li>Purificare il DNA plasmide utilizzando un kit di isolamento miniprep plasmid e sequenziare ogni gRNA utilizzando i seguenti primer per garantire la clonazione di successo: Avanti: Forward: GTACAAAAAGCAGGCTAAGG; Inverso: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.</li>
</ol>5. Testare l'efficienza di taglio del gRNA
<ol><li>Piastra hESC su fibroblasti embrionali murini irradiati (MEF) in una piastra a 6 piani, come descritto in precedenza21. Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, preparate il mix master di trasfezione descritto nella tabella 4.</li>
	<li>Mescolare pipettando e incubare a RT per 15 min.</li>
	<li>Raccogliere le cellule per la selezione dopo 48 h.<ol>
<li>Rimuovere i MEF in modo ezymatico (Tabella dei materiali) con un'incubazione di 3 min RT.</li>
		<li>Risciacquare le celle 1x con mezzo hESC (Tabella 5) e raschiare in hESC medio - 10 - 10 - M Y-27632 dihydrochlride ( Tabelladei materiali).</li>
		<li>Cellule di pellet a 300 x g per 3 min e risospendono in 0,5 mL di hESC medio - 10 -M Y-27632 dihydrochlor.</li>
		<li>Filtrare in un tubo da 5 mL attraverso un tappo di 35 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS), cancello su cellule vive e ordinare le cellule positive di proteina fluorescente verde (GFP).</li>
	<li>Trasferire un massimo di 1,5 x 104 celle ordinate direttamente in un piatto di 10 cm2 rivestito con matrice di membrana del seminterrato 1:3 (Tabella dei materiali) e MEF irradiati in mezzo hESC ( Tabella5) contenenti Y-27632 dihydrochlor.</li>
	<li>Cambiare medio giornaliero utilizzando il mezzo hESC (Tabella 5) senza dihydrochlor Y-27632 e raccogliere manualmente i cloni dopo 10-15 giorni, quando le colonie hanno un diametro di 1 mm.<ol>
<li>Utilizzando una pipetta P200 e un microscopio, raschiare con cura un singolo clone e disegnare le cellule nella pipetta.</li>
		<li>Disperdere le cellule pipettando delicatamente 3-4x in una piastra di 96 pozzetti nel mezzo redatto con la colonia.</li>
		<li>Distribuisci in tubi a striscia PCR per lo screening e pellet le cellule per centrifugazione a 10.000 x g per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Screening dei cloni
<ol><li>Isolare il DNA incubando pellet cellulari in 20 gradi di tamponi di proteine K (Tabella 5) (1 h a 55 e 10 min a 95 gradi centigradi) e vortice vigorosamente. Centrifuga a 10.000 x g per 5 min e raccogliere il supernatante.</li>
	<li>Eseguire lo screening PCR (sezione 2) in un volume totale di 20 l usando un master mix che include primer progettati per amplificare la regione di interesse e 5 l del digest della proteinasi K. Usa il DNA genomico isolato dalla linea cellulare che è stata modificata come controllo.</li>
	<li>Valutare i cambiamenti di dimensione dei prodotti PCR in base all'elettroforesi di 1 h a 70-90 V su un gel di agarose del 2,5% (w/v) (Figura 3B,C). Qualsiasi differenza di dimensioni è indicativa di scissione.</li>
</ol>7. Editing del genoma preciso nelle cellule staminali pluripotenti utilizzando il DNA oligo a singolo filamento (ssODN)
<ol><li>Progetta ssODN da 100 bp incentrati sulla sequenza di gRNA più efficiente determinata ad avere la migliore efficienza di taglio.</li>
	<li>Prevenire la riscissione dell'ODN ricombinato introducendo mutazioni silenziose nella sequenza gRNA. Una singola mutazione silenziosa nella sequenza PAM è sufficiente, ma se non è possibile, 3-4 mutazioni silenziose funzioneranno. NOTA: Per facilitare lo screening di cloni mirati, l'introduzione di un sito di restrizione entro 20 bp dalla sequenza di gRNA è ideale.</li>
	<li>Progettare un ODN con le modifiche di base desiderate per creare la mutazione di interesse e uno ODN senza le modifiche di base. NOTA: Questi cambiamenti non devono essere superiori a 20 pb dal sito di taglio CRISPR/CAS9 previsto, poiché la ricombinazione scende considerevolmente a distanze maggiori.</li>
	<li>Ordinare i due ssODN dal fornitore di scelta e resuspend in acqua per fare 1 g / l stock. Conservare le scorte a -20 gradi centigradi.</li>
</ol>8. Impostazione della trasfezione
<ol><li>Per tradurre la ssODN e la plasmidica CRISPR-CAS9, placcare la linea cellulare bersaglio in un piatto a 6 pozzetti su MEF irradiati per raggiungere il 70-80% di confluenza dopo un'incubazione O/N.</li>
	<li>Impostare la reazione di trasfezione come descritto nella tabella 6. Mescolare la reazione pipettando e incubare per 15 min a RT. Aggiungere la miscela di reazione di trasfezione dropwise alle cellule.</li>
	<li>Dopo 48 h, preparare le celle per l'ordinamento delle celle come descritto nella sezione 5.3.</li>
	<li>Raccogliere colonie 10 giorni dopo la placcatura di singole cellule utilizzando una pipetta 200 .L. Trasferire 100 l di celle in un pozzo di un 24 o 48 pozzo precedentemente rivestito con gelatina e MEF irradiati nel mezzo hESC con Y-27632 dihydrochlride. Utilizzare i restanti 100 L per l'isolamento del DNA come descritto nella sezione 6.</li>
</ol>9. Controllo delle mutazioni in colonie singole
<ol><li>Per verificare la corretta integrazione della ssODN, prendere 5 L L di DNA isolato da ogni colonia per eseguire la PCR utilizzando i primer di screening progettati nella sezione 2. Depurare i prodotti PCR (Tabella dei materiali) e preparare la digestione degli enzimi di restrizione utilizzando il sito enzimatico unico creato nella ssODN. NOTA: Questa digestione include anche il buffer enzimatico di restrizione e la concentrazione raccomandata dal produttore di enzimi di restrizione in un volume di 40 l.</li>
	<li>Mescolare la reazione pipettando e incubare alla temperatura raccomandata dal produttore per 1-3 h.</li>
	<li>Visualizza i prodotti PCR digeriti su un gel di agarose EtBr dell'1,5% (w/v) elettroforizzato a 80-100 V per 40 min. Se si è verificata un'integrazione corretta di ssODN, sequenza specifiche mutazioni utilizzando un primer annidato.</li>
</ol>

<ol><li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming%3A+The+Next+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations%3A+Lessons+from+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li>
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<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li>
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<li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR%2FCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li>
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<li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li>
<li>Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, l'uso di CRISPR-CAS9 insieme a due modelli di riparazione ssODN per generare specifici cambiamenti del genoma eterozigoo o omozigo è dimostrato nelle cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo ha portato alla generazione di successo di linee cellulari isogeniche che esprimono cambiamenti genomici eterozie con un'efficienza vicina al 10%. Questo protocollo è stato ottimizzato sia per le ESC umane che per gli iPSC cresciuti su MEF irradiati che supportano la crescita e la sopravvivenza delle ...

Le cellule staminali embrionali umane (HESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono strumenti preziosi per modellare le malattie umane a causa della loro capacità di rinnovamento, pur mantenendo la capacità di generare tipi di cellule di linee diverse1,2 ,3,4. Questi modelli aprono la possibilità di interrogare la funzione genica e capiscono come mutazioni e fenotipi specifici siano correlati a varie malattie5,6. Tuttavia, per capire come una specifica alterazione sia collegata a un particolare fenotipo, l'uso di un controllo isogenico accoppiato e di linee cellulari mutanti è importante controllare per la variabilità da linea a linea7,8. Le nucleasi (TALEN) e le nucleasi di dita di zinco sono state utilizzate per generare mutazioni di inserimento o delezione (indels) in diversi modelli genetici, comprese le cellule primarie; ma queste nucleasi possono essere ingombranti da usare e costosi9,10,11,12,13,14. La scoperta della nuclea a breve ripetizione palindromica corta (CRISPR)-CAS9 del cluster regolarmente interspazio ha rivoluzionato il campo grazie all'efficienza nella formazione dell'indel in praticamente in qualsiasi regione del genoma, semplicità d'uso e riduzione dei costi15 , 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19.
Una sfida nell'utilizzo della tecnologia di editing genomico basata su CRISPR-CAS9 è stata la generazione o la correzione di mutazioni specifiche in un allele senza creare una mutazione indel nel secondo allele20. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di superare questa sfida utilizzando due modelli di riparazione di oligonucleotidi a filamento singolo (ssODN) per ridurre la formazione dell'indel nel secondo allele. Entrambi gli ssODN sono progettati per contenere mutazioni silenziose per prevenire il re-taglio da parte della nucleacanda CAS9, ma solo uno contiene l'alterazione dell'interesse. Questo metodo aumenta l'efficienza di generare una specifica modifica genetica eterozigola senza indurre la formazione dell'indele nel secondo allele. Utilizzando questo protocollo, gli esperimenti di editing genico in sei luoghi genomici indipendenti dimostrano l'introduzione precisa del cambiamento genomico desiderato in un allele senza formazione dell'indele nel secondo allele e si verifica con un'efficienza complessiva del 10%. Il protocollo descritto è stato adattato da Maguire et al.21.

<table><tbody><tr><td>Provetta da 5 ml in polistirene a fondo tondo con tappo per filtro cellulare</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali in polistirene a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>AflII restrizione endonucleasi</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>VWR</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>ThermoFisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr>Apparecchio <td></td><td></td><td></td>per<td>la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel</td> Kit di assemblaggio <td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Gibson</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td></td></tr><tr><td>LB piastre di agar contenenti 50 &mu; g/ml reagente staminale per</td> lipofectamina kanamicina <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>(STEM00001)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti embrionali murini (MEF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit per l'estrazione con gel nucleospin e la pulizia della PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore con agitazione orbitale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vettore pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td></td></tr><tr><td>Provette per strisce PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà e 5&volte; Tampone Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210011</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Qiagen Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>StellarTM elettrocompetente Cellule di Escherichia coli</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>New England Biolabs</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato/inibitore di ROCK (ROCKi)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di modifiche genomiche definite utilizzando crispr-cas9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Le cellule staminali pluripotenti umane offrono un potente sistema per studiare la funzione genica e modellare mutazioni specifiche rilevanti per la malattia. La generazione di precise modifiche genetiche eterozigole è impegnativa a causa della formazione indel mediata da CRISPR-CAS9 nel secondo allele. Qui, dimostriamo un protocollo per aiutare a superare questa difficoltà utilizzando due modelli di riparazione in cui solo uno esprime il cambiamento di sequenza desiderato, mentre entrambi i modelli contengono mutazioni silenziose per prevenire il taglio e la formazione dell'indel. Questa metodologia è più vantaggiosa per la codifica genica delle regioni del DNA per generare il controllo isogenico e linee di cellule staminali umane mutanti per lo studio delle malattie umane e della biologia. Inoltre, sono state eseguite ottimizzazioni delle metodologie di trasfezione e screening per ridurre il lavoro e il costo di un esperimento di editing genico. Nel complesso, questo protocollo è ampiamente applicabile a molti progetti di editing del genoma che utilizzano il modello di cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione di gRNA e screening per indele
Ogni gRNA sarà clonato in un vettore plasmide ed espresso usando il promotore U6. L'enzima di restrizione AflII viene utilizzato per linearizzare il plasmide (addgene #41824) e si trova dopo il promotore U6. La banda di 100 bp generata dopo l'annealing delle due oligos da 60 bp viene clonata nel vettore di espressione gRNA utilizzando l'assieme DNA. Una volta generati, i plasmidi gRNA vengono trasfettati in hESC o iPSC insiem...

Questo protocollo fornisce un metodo per facilitare la generazione di cambiamenti di nucleotidi eterozio o omozigo utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Lo studio della funzione genica e delle malattie è ostacolato dalla natura di razza della popolazione umana. I diversi background genetici delle linee cellulari iPS specifiche del paziente e di controllo possono influenzare l'efficienza di differenziazione e i fenotipi trovati in un dato test funzionale. L'uso di linee geneticamente identiche o isogeniche in cui l'unica differenza è la particolare mutazione di interesse è fondamentale per superare questi problemi.Molte malattie umane sono causate da mutazioni eterozigoti, che possono essere difficili da generare con il sistema CRISPR-Cas9. Ciò è dovuto alla generazione di mutazioni indeli nell'allele non mirato che possono verificarsi ad altissima frequenza. La nostra tecnica supera questo problema utilizzando due modelli di riparazione di cui solo uno ospita la mutazione di interesse.Qualsiasi ricercatore che prova questa tecnica dovrebbe essere abile nella coltura di cellule staminali pluripotenti umane. La dimostrazione video della selezione della colonia sarà utile per mostrare le dimensioni e la morfologia corrette, nonché la tecnica utilizzata per la raccolta e lo screening. A dimostrare questa procedura sarà Leo Cardenas.Per cominciare, placcare gli ESC umani su MEF irradiati in una piastra a 6 poc. Preparare il mix di master di trasfezione. Mescolare con pipettazione e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, quindi, aggiungere la miscela master di trasfezione goccia saggia ad ogni pozzo con le cellule e incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore. Cambia il supporto ogni 24 ore. Per raccogliere le cellule, in primo luogo, incubare le cellule con Tripla E per tre minuti a temperatura ambiente per rimuovere i MEF enzimaticamente.Aggiungere 0,5 millilitri di mezzo HESC con 10 inibitori ROCK micromolari. Celle a pellet a 300 volte g per tre minuti e sospensione in 0,5 millilitri di mezzo ESC umano con inibitore ROCK micromolare 10. Filtrare la sospensione cellulare in un tubo da cinque millilitri attraverso un tappo filtrante a celle da 35 micron.Usando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, gate su cellule vive e ordinare le cellule positive alle proteine fluorescenti verdi. Successivamente, trasferire un massimo di 1,5 per 10 alle quattro cellule smistate direttamente in un piatto di 10 centimetri rivestito con matrice di membrana basale da uno a tre e MEF irradiati e mezzo ESC umano contenente inibitore ROCK. Cambiare mezzo ogni giorno utilizzando il mezzo ESC umano senza inibitore ROCK.Dopo 10-15 giorni, le colonie hanno un diametro di circa uno o due millimetri. Al microscopio, utilizzare una pipetta P200 per raschiare con cura un singolo clone e disegnare cellule nella pipetta. Disperdere le cellule in un pozzo di una piastra di 96 po 'coniando delicatamente da tre a quattro volte nel mezzo redatto con la colonia.Quindi, scegli 20 colonie per ogni RNA guida e dispensa in tubi a strisce PCR per lo screening. Pellettò le cellule per centrifugazione a 10.000 volte G per cinque minuti. Ora, incubare pellet cellulari in 20 microlitri di proteinasi K tampone per isolare vigorosamente DNA e vortice.Centrifuga a 10.000 volte G per cinque minuti. Successivamente, eseguire lo screening PCR del DNA modificato. Aggiungere nei tubi 20 microlitri di un master mix, compresi i primer avanti e indietro, progettati per amplificare la regione di interesse, così come cinque microlitri del digest Proteinase K.Utilizzare DNA genomico isolato dalla linea iPSC di controllo per confermare un'amplicon pulita durante l'esecuzione della PCR di screening. Valutare le variazioni di dimensione dei prodotti PCR dopo un'ora di elettroforesi a 70-90 volt con un peso del 2,5% in volume in gel di agarosio. Qualsiasi differenza di dimensione è indicativa della scissione.Per trasfetto il DNA dell'oligo a singolo filamento e i plasmidi CRISPR-Cas9, placcare la linea cellulare bersaglio in un piatto da 6 po 'su MEF irradiati per raggiungere la confluenza dal 70 all'80% dopo un'incubazione durante la notte. Impostare la reazione di trasfezione come descritto. Mescolare la reazione con pipettazione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Quindi, aggiungere la miscela di reazione di trasfezione cadere saggiamente alle cellule. Dopo 48 ore, preparare le celle per l'ordinamento delle celle come in precedenza. Circa 10 giorni dopo aver placcato singole cellule, utilizzare una pipetta da 200 microliter per raccogliere colonie in tubi di strisce PCR e in un pozzo di una piastra da 12 pozzetti pre-rivestita con gelatina e MEF.Trasferire 100 microlitri delle cellule in ogni pozzo di una piastra da 24 o 48 porri, precedentemente rivestita con gelatina e MEF irradiati nel mezzo ESC umano con inibitore ROCK. Utilizzare i restanti 100 microlitri per l'isolamento del DNA. Per verificare la riuscita integrazione del DNA dell'oligo a singolo filamento, prendere cinque microlitri di DNA isolati da ogni colonia per eseguire la PCR utilizzando i primer di screening precedentemente progettati.Purificare i prodotti PCR e preparare i 40 microlitri della digestione enzimatica di restrizione utilizzando l'esclusivo sito enzimatico creato nel DNA dell'oligo a singolo filamento. Mescolare la reazione con pipettazione e incubare alla temperatura raccomandata dal produttore per una o tre ore. Quindi, visualizzare i prodotti PCR digeriti aggiunti con un colorante di carico su un gel di agaro al bromuro di etidio dell'1,5% in volume, elettroforescente a 80-100 volt per 40 minuti.Se si è verificata un'integrazione riuscita del DNA dell'oligo a singolo filamento, sequenziare mutazioni specifiche usando un primer annidato. In questo studio, per la costruzione dell'RNA guida, una banda di 100 coppie di basi è stata asportata da un gel di agarosio dell'1,5%. Dopo la trasfezione cellulare, la convalida del taglio dell'RNA guida è stata visualizzata utilizzando un gel di agarosio al 2,5%.Un prodotto PCR a 180 coppie di basi mostrava un controllo non tagliato e diversi cloni con turni di banda che indicavano la formazione di indele. Diverse RNA guida avevano diverse efficienze di taglio. Per evitare il ritaglio CRISPR-Cas9 degli alleli modificati, la sequenza PAM è stata modificata usando una mutazione silenziosa da G a A.Una mutazione silenziosa nella sequenza PAM ha generato un sito di restrizione univoco, che aiuta a schermare per un'integrazione riuscita in uno o due alleli. Le linee di cellule staminali modificate dal genoma possono essere utilizzate nelle differenziazioni a valle e nei saggi funzionali per studiare l'effetto di una data mutazione sullo sviluppo umano e sulle malattie. Questa metodologia consente la generazione di linee cellulari isogeniche con specifiche mutazioni eterozigoti o omozigoti, implicate in un'ampia varietà di malattie umane.Questi modelli di malattia aprono la strada allo sviluppo di nuove terapie cellulari e offrono piattaforme per la scoperta di farmaci.

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Questo video dimostra una tecnica di editing del genoma basato sulla nucleasi a dita di zinco in cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). Poiché le hPSC possono potenzialmente essere differenziate in vari tipi di cellule, questa tecnologia è utile per studi patologici e farmacologici in vitro in modo paziente-specifico.

Editing del genoma basato sulla nucleasi a dita di zinco: una tecnica per modificare il genoma nelle cellule staminali pluripotenti umane mediante meccanismo di riparazione dipendente dall'omologia a doppio filamento

Gli strumenti di editing del genoma come il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) hanno notevolmente migliorato l'efficienza del targeting genico nelle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Questo manoscritto descrive un protocollo per la generazione di reporter hiPSC specifici per il lignaggio utilizzando la ricombinazione omologa assistita dal sistema CRISPR/Cas.

Generazione efficiente di reporter knockin specifici per il lignaggio neurale hiPSC utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e Cas9 Double Nickase

L'editing del genoma delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) può essere fatto in modo rapido ed efficiente. Qui viene presentata una robusta procedura sperimentale per l'ingegneria genetica delle hPSC, come esemplificato dalla modifica del locus safe harbor AAVS1 per esprimere EGFP e introdurre resistenza agli antibiotici.

Istituzione di Genome-cura pluripotenti umane Linee di cellule staminali: Da Targeting per isolamento

Protocolli per generare linee mutanti HPSC che utilizzano la piattaforma iCRISPR e di differenziare hPSCs in cellule beta-come il glucosio-reattiva sono descritti. La combinazione di tecnologia di editing genoma con differenziazione HPSC-diretto fornisce una piattaforma potente per l'analisi sistematica del ruolo dei determinanti lignaggio nello sviluppo umano e la progressione della malattia.

Genome Editing e di differenziazione Regia di hPSCs per interrogare determinanti Lineage in Sviluppo Umano del pancreas

Questo protocollo descrive in dettaglio la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte privo di impronta (iPSCs) da cellule pancreatiche umane in condizioni prive di alimentatore, seguito da editing con CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine e caratterizzazione del modificati cloni unicellulari.

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Un protocollo per la veloce rottura CRISPR/Cas9-mediata del gene nel topo ed emopoietici umani primari è descritto in questo articolo. Cas9-sgRNA ribonucleoproteine vengono introdotti tramite elettroporazione con sgRNAs generato tramite trascrizione in vitro e commerciale Cas9. Alta efficienza di editing si ottiene con tempo limitato e costi finanziari.

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Descritto qui è un protocollo per l'etichettatura in modo endogeno espresse proteine con tag fluorescente in cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando CRISPR/Cas9. Celle putativamente modificate sono arricchite da ordinamento di attivate la fluorescenza delle cellule e linee clonali della cellula vengono generate.

Proteina endogena Tagging in umani hanno indotto le cellule staminali pluripotenti utilizzando CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas è una potente tecnologia per progettare i complessi genomi delle piante e degli animali. Qui, dettagliamo un protocollo efficiente modificare il genoma umano usando diverse endonucleasi di Cas. Evidenziamo considerazioni importanti e parametri di progettazione per ottimizzare l'efficienza di editing.

Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'editing genetico senza soluzione di continuità nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase Cas9. Due mutazioni puntiformi sono state introdotte nell'esone 8 del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti nelle cellule staminali embrionali umane (hESC).

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Il metodo presentato descrive la generazione di un knockout genico mediato da CRISPR nella linea H9 di cellule staminali embrionali umane (hESC), che esprime stabilmente sgRNA che hanno come bersaglio il gene L2HGDH utilizzando un sistema di rilascio genico lentivirale mediato altamente efficiente.

Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

Il protocollo descrive i metodi per l'editing dell'epigenoma basato su CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) in linee cellulari umane utilizzando la trasfezione del DNA plasmidico e la nucleofecazione dell'mRNA.

Editing dell'epigenoma CRISPR nelle cellule umane mediante trasfezione del DNA plasmidico e consegna della nucleofecazione dell'mRNA

Scopri come generare modifiche genomiche definite con CRISPR-Cas9 nelle cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo crea linee isogeniche con mutazioni specifiche per studiare funzioni geniche e malattie.

Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

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