Tessuto Adiposo Umano Microframmentazione per la Fenotipizzazione Cellulare e la Caratterizzazione del Secretome

Usando questo sistema, possiamo raccogliere gli ammassi sub-millimetrici del tessuto adiposo umano, in cui l'intero microambiente delle cellule rigenerative è intatto. Anche l'intero sistema microvascolare è intatto, e quindi possiamo usare questo tipo di micro organi per il trapianto in vivo per la coltura in vitro e per l'isolamento cellulare per un'ulteriore caratterizzazione. La logica principale per l'uso del sistema nel laboratorio di ricerca è che il processo è totalmente privo di enzimi, e quindi consente la lavorazione rapida ed efficiente del tessuto adiposo umano mantenendo una micro-architettura e sarà la microvascolarizzazione del tessuto totalmente intatta.

E così possiamo studiare direttamente un prodotto di terapia cellulare che si è dimostrato già molto utile in clinica. Questa tecnologia a sistema chiuso è una tecnica facile da usare per la raccolta, la lavorazione e la reiezione del tessuto adiposo raffinato intraoperatorio e può essere applicata con successo in ortopedia cosmetica, proctologia e anche ginecologia. Questo metodo consente un ulteriore studio dell'impatto del grasso nella rigenerazione dei tessuti.

La procedura sarà dimostrata da Bianca Vezzani, borsista post-dottorato e da Mario Gomez-Salazar, dottorando. Lavorando in condizioni asettiche entro 16 ore dalla raccolta, posizionare il campione di addominoplastica sopra un panno chirurgico con la pelle rivolta verso l'alto. Utilizzare una cannula di infiltrazione tissutale usa e getta per iniettare da 50 a 100 millilitri di 37 gradi Celsius soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% nel tessuto adiposo sottocutaneo.

Collegare una siringa di blocco Luer da 10 millilitri a una cannula monouso per liposuzione e afferrare il campione nella regione cutanea vicino a un bordo del campione, introdurre con cura la cannula nel tessuto adiposo. Una volta che la cannula è all'interno del tessuto, estrarre lo stantuffo e spostare la cannula radialmente all'interno del campione di tessuto adiposo. È importante gestire saldamente il tessuto adiposo durante la lipo-aspirazione.

Se non viene raccolto abbastanza grasso, prendere in considerazione l'esecuzione di un'iniezione salina aggiuntiva. Quando la siringa è piena di lipo-aspirato, rimuovere con cura la cannula dal tessuto e sostituire la siringa completa con una nuova siringa vuota fino a quando non è stato raccolto un totale di 60 millilitri di aspirato. Per la microframmentazione del lipo-aspirato, rimuovere il dispositivo dalla confezione e verificare che l'unità principale sia collegata al sacchetto dei rifiuti.

Posizionare il sacchetto di raccolta dei rifiuti a terra e assicurarsi che le valvole siano fissate ai tappi dell'unità di processo. Perforare la porta di connessione del sacchetto per collegare il picco terminale della linea di ingresso nel sacchetto salino e posizionare il sacchetto salino più in alto dell'unità di elaborazione. Verificare che tutti e cinque i morsetti collegati ai tubi dei circuiti siano aperti, posizionare l'unità di lavorazione in posizione verticale, consentire alla soluzione salina di riempire l'unità di lavorazione e verificare che il flusso raggiunga il sacchetto di scarico.

Agitare l'unità di elaborazione per rimuovere eventuali bolle d'aria e posizionare l'unità in posizione verticale con il cappuccio blu rivolto verso l'alto. Chiudere il morsetto accanto alla linea di ingresso e collegare una siringa di lipo-aspirato alla valvola auto-occluding del tappo di ingresso blu per iniziare a iniettare il lipo-aspirato. Mantenendo l'unità di lavorazione verticale, spingere lentamente verso il basso sullo stantuffo della siringa fino a quando tutto il lipo-aspirato non è stato trasferito all'unità.

Una volta iniettato tutto il lipo-aspirato, aprire il morsetto di ingresso per ripristinare il flusso salino e scuotere vigorosamente l'unità di lavorazione per almeno due minuti, controllando regolarmente il flusso della soluzione salina nel sacchetto dei rifiuti. Quando la soluzione salina nell'unità di elaborazione diventa trasparente, posizionare l'unità con il cappuccio grigio verso l'alto e chiudere i morsetti situati sullo scarico vicino sia ai tappi blu che a quello grigio. Il tessuto lavorato galleggerà in alto.

Quindi, riempire una siringa di blocco Luer da 10 millilitri con soluzione salina e collegare la siringa alla valvola di carico del cappuccio blu. Collegare una siringa di blocco Luer vuota da 10 millilitri con lo stantuffo completamente inserito nella valvola del cappuccio grigio. Iniettare saldamente la soluzione salina nell'unità di lavorazione dal cappuccio blu, verificando che la siringa collegata alla valvola grigia venga di conseguenza riempita con il tessuto lavorato.

Quando tutta la salina è stata iniettata, rimuovere con cura entrambe le siringhe e ripetere l'infusione salina fino a quando tutto il tessuto lavorato non è stato raccolto. Al termine della lavorazione, rimuovere tutte le siringhe, chiudere tutti i morsetti, staccare il sacchetto salino e smaltire il dispositivo secondo i protocolli locali. Una volta raccolto tutto il tessuto lavorato, trasferire il tessuto adiposo micro-frammentato in un contenitore sterile e aggiungere un volume uguale di mezzo di digestione al contenitore.

Posizionare il contenitore sigillato in un bagno d'acqua tremante di 37 gradi Celsius, impostato su 120 rotazioni al minuto per 45 minuti, fermando la digestione con lo stesso volume di soluzione di blocco alla fine dell'incubazione. Filtrare in sequenza il campione, prima attraverso un filtro a celle da 100 micrometri seguito dalla filtrazione attraverso un filtro a celle da 70 micrometri e centrifugare la sospensione filtrata per cinque minuti a 200 volte g. Sospendiamo il pellet in circa 5 millilitri di tampone di lisi degli etitrociti per 15 minuti a temperatura ambiente.

Interrompere la lisi con lo stesso volume di soluzione di blocco e filtrare la soluzione attraverso un filtro a celle da 40 micrometri. Quindi raccogliere le cellule tissutali adipose micro-frammentate mediante centrifugazione e sospendiamo il pellet in soluzione di blocco fresco con miscelazione di farine per il conteggio. Dopo la dissociazione e la colorazione degli anticorpi, le cellule adipose micro-frammentate possono essere portate nel citometro del flusso per l'analisi cellulare e/o lo smistamento.

La dissociazione meccanica delle lipo-aspirati manuali si traduce nella produzione di tessuto adiposo micro-frammentato che consiste in un aggregato di adipociti che avvolgono una rete microvascolare. L'analisi dell'immunofluorescenza della gelatina incorporata nel tessuto adiposo micro-frammentato criofissa evidenzia la struttura, mostrando la rete vascolare contrassegnata dal marcatore cellulare endoteliale Ulex Europaeus Agglutinin 1 e costituita principalmente da piccoli vasi capillari. In particolare, i periciti che esprimono l'antigene gliale neuronale 2 o il recettore beta del fattore di crescita derivato dalle piastrine sono normalmente distribuiti, ensheathing cellule endoteliali.

Escludendo le cellule ematopoietiche positive CD31 e CD45 positive, la presenza di periciti negativi CD34 positivi CD146 e cellule avventiziali negative CD146 e CD34 positive può essere identificata all'interno del MAT. La lipo-aspirazione manuale è una parte critica della procedura e deve essere eseguita in condizioni sterili non più di 16 ore dopo l'addominoplastica. Il tessuto adiposo micro-frammentato può essere ulteriormente elaborato mediante colorazione immunoistochimica, coltura in vitro o analisi del secretome per ottenere una visione più approfondita della biologia dei tessuti adiposi.

Questa tecnica consente lo studio di tessuti diversi nella loro disposizione naturale, nativa e tridimensionale come una sorta di piccoli organoidi, che sono abbastanza piccoli da essere trapiantati nei topi o da essere mantenuti in coltura a lungo termine. E usiamo questo sistema principalmente per affrontare sperimentalmente i diversi microambientati specifici degli organi. I nostri donatori di tessuti adiposi non sono noti come portatori di infezioni trasmissibili.

Tuttavia, in assenza di ulteriori screening, tutti i tessuti umani dovrebbero essere considerati potenzialmente contaminati e trattati di conseguenza.