Luminescenza Lifetime Imaging di O₂ con un sistema di telecamere basato su frequenza-dominio

Come miglior accettore di elettroni, l'ossigeno gioca un ruolo cruciale nei sistemi biologici. Con questo protocollo, è possibile visualizzare la distribuzione dell'ossigeno in 2D utilizzando un optodo. Oltre alla sua elevata risoluzione spaziale e temporale, questo metodo non richiede un colorante di riferimento aggiuntivo, è estremamente robusto e consente l'acquisizione di immagini strutturali.

Questo metodo può essere applicato a vari settori di ricerca in cui l'ossigeno svolge un ruolo chiave tra cui ecologia, ricerca medica, biostam ecologica e stampa sensibile alla pressione. La fabbricazione optode può essere impegnativa in quanto la quantità di cocktail aggiunta al foglio di supporto e la velocità di trascinamento del dispositivo di rivestimento del coltello possono richiedere ottimizzazione e pratica. Con questo contributo video, vogliamo rendere questa potente tecnica accessibile ai ricercatori di altri campi di studio.

Per preparare un optodo planare all'ossigeno, utilizzare prima una pellicola d'acqua o il 70% di etanolo per fissare un foglio pet pulito senza polvere su una piastra di vetro pulita. Posizionare un dispositivo di rivestimento del coltello pulito da 120 micrometri sulla lamina e utilizzare una pipetta di vetro per applicare una linea di cocktail di sensori davanti al dispositivo. Successivamente, trascinare il dispositivo di rivestimento del coltello lentamente e uniformemente sul foglio di PET per stendere il cocktail in modo uniforme.

Quindi asciugare l'optodo planare sensibile all'ossigeno finito nell'aria ambiente per un'ora prima di asciugarsi durante la notte in un armadio riscaldato a 50-60 gradi Celsius. Entro la mattina successiva, sarà stato ottenuto uno strato spesso circa 12 micrometri. Conservare l'optodo protetto dalla luce fino a un ulteriore utilizzo.

Per preparare una camera rhizo-sandwich, utilizzare un adesivo istantaneo a base di acrilico polimerizzabile leggero per incollare vetrini al microscopio lungo i bordi di una lastra di vetro lasciando aperto un lungo bordo. Tagliare l'optodo planare nella forma e nelle dimensioni richieste per adattarsi allo spazio tra i vetrini del microscopio incollato e posizionare l'optodo all'interno della piastra di vetro anteriore con il lato rivestito verso l'alto. Fissare un bordo del foglio di optodo alla piastra di vetro e aggiungere acqua del rubinetto tra la lastra di vetro e il foglio di optodo.

Abbassare lentamente il foglio sulle goccioline d'acqua permettendo all'optodo di raddrizzare se stesso sulla superficie del vetro e utilizzare un tessuto molle per rimuovere con cura una bolla d'aria intrappolata tra l'optodo e la piastra. Quindi asciugare la piastra di vetro e rastrelare i bordi rimanenti del foglio sulla piastra. Successivamente, utilizzare una piastra di vetro piano per distribuire i sedimenti del setaccio di 0,5 millimetri uniformemente attraverso la piastra allo stesso spessore dei distanziale a scorrimento del microscopio.

Pulire con cura la superficie superiore dello scivolo del microscopio per assicurarsi che la seconda lastra di vetro sigilli correttamente la camera e applicare grasso siliconico sulla superficie di scorrimento del microscopio. Quindi coprire il sedimento con un sottile film d'acqua evitando accuratamente la formazione di bolle d'aria. Prima di posizionare un campione sul sedimento, lavare con cura un singolo germoglio di Littorella uniflora e posizionare il germoglio su un sedimento con le foglie sporgenti dal lato aperto superiore.

Quando il campione è in posizione, posizionare la lastra di vetro con l'optodo sul sedimento e applicare una pressione delicata per portare l'optodo a stretto contatto con le radici della pianta e il sedimento circostante. Utilizzare morsetti per fissare le piastre insieme e asciugare i bordi esterni con carta velina. Aggiungere ripetutamente alcune gocce d'acqua alle foglie per mantenere la pianta idratata durante l'assemblaggio del rhizo-sandwich e utilizzare nastro elettrico in vinile per stringere la camera rhizo-sandwich.

Quindi sigillare i bordi con argilla modellante e nastro elettrico aggiuntivo. Per prepararsi all'imaging, rimuovere il foglio di copertura dall'area dell'optodo dopo l'incubazione e posizionare la camera rizo-sandwich con la parete di vetro con l'optodo in posizione verticale contro la parete dell'acquario. Utilizzare un distanziale per premere la camera rhizo-sandwich contro il muro.

Posiziona la telecamera a vita in luminescenza basata sul dominio di frequenza dotata di un obiettivo di fronte all'acquario e all'area di interesse. Collegare un filtro di emissione adatto per l'imaging del colorante dell'indicatore all'obiettivo della fotocamera e fissare la guida luminosa nella sorgente di eccitazione a LED. Quindi posizionare la guida in modo che illumini uniformemente il foglio di optodo planare che copre l'area di interesse.

Nel software di imaging, selezionare la fotocamera e selezionare il LED nel software di controllo LED. Impostare l'intensità del LED in base alle esigenze e spuntare l'analogico e la sincronizzazione per confermare che il LED è attivato dalla logica transistor-transistor esterna. Mettere a fuoco manualmente la fotocamera e regolare l'apertura oggettiva e impostare la sorgente di modulazione interna, l'onda sine per la forma d'onda di uscita, il campionamento di fase aggiuntivo, i campioni a otto fasi, l'ordine di fase opposto, il lettura A B e la frequenza di modulazione di cinque kilohertz.

Regolare il tempo di esposizione fino a quando le statistiche della regione di interesse non vengono lette per l'immagine di intensità della luminescenza normalizzata nell'intervallo da 0,68 a 0,72. Quindi fare clic su riferimento di acquisizione per avviare l'acquisizione di una serie di misura di riferimento. Per calibrare l'optodo, utilizzare un dispositivo di miscelazione del gas per sciacquare l'acqua in un acquario di taratura con una miscela di gas azoto ad aria ambiente con una concentrazione di ossigeno nota che monitora la concentrazione di ossigeno con una sonda esterna con un sensore di ossigeno.

Quindi acquisire una serie di immagini a diverse concentrazioni di ossigeno nella camera di taratura per ottenere una curva adeguata adatta ai dati di calibrazione acquisiti. Una volta calibrato il sistema, spegnere le luci che applicano l'irradiazione all'impianto e a tutte le altre sorgenti luminose e regolare il tempo di acquisizione in base all'intensità dell'immagine per assicurarsi che il segnale non sia né saturo né troppo debole per un buon rapporto segnale-rumore nella determinazione della durata. Una volta acquisite tutte le immagini a vita di ossigeno, riattivare le luci per ottenere un'immagine strutturale e ottenere un'immagine con un righello nel campo visivo per consentire il successivo ridimensionamento delle immagini acquisite.

Prima di imaging del campione, l'optodo deve essere calibrato. Dopo un decadimento quasi esponenziale, la durata della luminescenza misurata diminuisce con l'aumentare della concentrazione di ossigeno. Questa relazione può anche essere descritta utilizzando il modello semplificato a due siti.

Una volta calibrato l'optodo, è possibile determinare la concentrazione di ossigeno imagingndo la durata della luminescenza osservata in queste immagini in cui la distribuzione della concentrazione di ossigeno nella rizosfera di Littorella uniflora è stata immagine dopo l'esposizione alla luce a 500 fotoni di micromoli al metro al secondo per 12 ore e dopo 12 ore nell'oscurità. Oltre alle immagini a vita, le immagini strutturali possono anche essere acquisite sotto illuminazione esterna mantenendo fissa la geometria di imaging per consentire all'imaging dell'ossigeno di essere esattamente correlato all'immagine strutturale. I profili di concentrazione di ossigeno su una singola radice, ad esempio, possono quindi essere estratti dalle immagini acquisite nell'oscurità e nella luce.

È fondamentale avere un buon contatto tra la matrice campione e l'optode per evitare artefatti non necessari. Se sei in dubbio, rifare il panino. L'acquisizione istantanea di un'immagine in modo non distruttivo consente il monitoraggio dell'ambiente dell'ossigeno.

Il metodo potrebbe anche essere combinato con altri optodi per pH o altri aaliti. Assicurati di eseguire la fabbricazione optode in una cappa aspirante poiché il cocktail del sensore contiene cloroformio. Gli optodi planari possono essere usati per identificare le comunità microbiche nei sedimenti.

E dopo l'imaging, il panino può essere aperto per campionare questi punti caldi per l'analisi microbica della comunità.