Name: Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Scopri come valutare la dinamica della mitosi e il destino cellulare mediante imaging a cellule vive. Questo metodo consente di analizzare i difetti mitotici e la formazione del fuso in risposta a farmaci anti-mitotici.

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1. Generazione di cellule hTERT-RPE-1 che esprimono stabilmente RFP-Histone 2B (RFP-H2B) e z-tubulin-EGFP (tub-EGFP)
NOTA: Tutti i passi seguono tecniche asettiche e si svolgono in un armadio di sicurezza di livello di biosicurezza II (BSL2).
<ol><li>Generare retrovirus che trasporta i geni di interesse (z-tubulina-EGFP e RFP-H2B) con la trasfezione di 293T cellule con le plasmiche lentivirali appropriate secondo le istruzioni del produttore del sistema di erogazione della trasfezione a base di lipidi.<ol>
<li>Giorno 1: Utilizzare una pastortta di vetro usa e getta per aspirare il mezzo di coltura cellulare da una piastra di cellule 293T sub-confluente e lavare via il mezzo residuo con salina tamponata fosfato (PBS) aggiungendo 5 mL di PBS. Swirl per distribuire PBS sul fondo della piastra, quindi aspirare il PBS con una pipetta pasteur in vetro usa e getta sterile.</li>
		<li>Aggiungete 2 mL di 0,05% di cipina che è stata preriscaldata a 37 gradi centigradi e riportare la piastra su un'incubatrice umidificata a 37 sC con 5% di CO2 per 2-5 min per consentire il rilascio delle cellule aderenti dalla superficie del piatto di coltura cellulare.</li>
		<li>Aggiungere 8 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina/streptomicina alla piastra contenente la trippsina.</li>
		<li>Risospendere le cellule con il tubo e trasferire delicatamente la sospensione in un tubo conico sterile da 15 mL. Posizionare il tubo conico in una centrifuga bilanciata e ruotare a 161 x g per 5 min a temperatura ambiente per spingere delicatamente le cellule.</li>
		<li>Aspirare la soluzione media/trippsina da cellule pellettate e resospendere le cellule in 10 mL di DMEM integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina. Utilizzare un emocitometro per contare le sospensioni cellulari 293T e la piastra 2 x 106 293T cellule per pozzo di un 6 pozzo.</li>
		<li>Cellule di coltura in un volume totale di 2 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrate con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina/streptomicina e mantenute in un incubatore umido a 37 gradi centigradi con 5% di CO2.</li>
		<li>Giorno 2: Pipette 7 - L di reagente di consegna trasfezione a base di lipidi e 100 l di mezzo siero ridotto in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e permettergli di incubare a temperatura ambiente per 5 min (tubo #1).</li>
		<li>In un tubo di microcentrismo da 1,5 mL separato, la pipetta 1 g di vettore di espressione RFP-H2B (o 1 g di vettore di espressione di z-tubulina-EGFP), insieme a 5 reagenti di potenziatore (come richiesto dalle linee guida del produttore), 0,5 g di pMD2.G e 1 psPAX2 e 100 medio siero (#2 tubo).</li>
		<li>Combinare il contenuto dei gradi 1.1.7 e 1.1.8 con il tubo pipettando attentamente #2 in #1 del tubo e incubare per 20 min a temperatura ambiente. NOTA: La reazione può essere scalata in base alle esigenze per la trasfezione delle cellule in pozzi aggiuntivi.</li>
		<li>Pipetta la reazione di trasfezione dropwise al pozzo desiderato contenente 293T cellule in 2 mL di media e riportare il piatto all'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi con 5% CO2. NOTA: per generare celle che esprimono sia RFP-H2B che z-tubulina-EGFP, generare virus separati per ogni costrutto di espressione (passaggi 1.1.7- 1.1.9).</li>
		<li>Giorno 3: Aspirata e sostituire il mezzo con 2 mL di DMEM fresco integrato con 10% FBS e 1% penicillina / streptomiacina. Riportare il piatto nell'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Giorno 4: Raccogliere il mezzo contenente particelle virali espresse, essendo cauti a non interrompere o rimuovere 293T cellule. Filtrare il mezzo contenente particelle di virus passandolo attraverso un filtro da 0,45 M collegato a una siringa da 5 mL. Virus dell'aliquota per l'immagazzinamento a breve termine a 4 gradi centigradi, o di stoccaggio a lungo termine a -80 gradi centigradi. NOTA: Le particelle virali ottenute in questo modo saranno presenti in un intervallo compreso tra 1 x 107 e 1 x 108 Unità trasduttrice/mL. Poiché le cellule e le cellule che producono virali da infettare sono entrambe coltivate nello stesso mezzo, la concentrazione virale per sostituire il mezzo non è necessaria e le particelle virali filtrate possono essere utilizzate direttamente per infettare le cellule.</li>
	<li>Seme 2 x 105 cellule hTERT-RPE-1 per pozzo di un piatto di 6 po 'in preparazione per l'infezione virale. Cellule di coltura in 2 mL di DMEM integrate con 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina e mantenere in un incubatore umidificato a 37 c con 5% CO2.</li>
	<li>Giorno 5: Aggiungere bromuro di esadimethrine (ad esempio, polibrene) alle cellule hTERT-RPE-1 ad una concentrazione finale di 8 g/mL. Infettare le cellule con una miscela di 500 l di virus diluito in 500 - L di mezzo di coltura cellulare. NOTA: La soluzione di bromuro di hexadimethrine viene preparata in acqua distillata sterile, quindi filtrata attraverso un filtro da 0,45 m.</li>
	<li>Giorno 6: Utilizzando una pipetta Pasteur di vetro usa e getta, aspirare il mezzo da pozzi contenenti le cellule infette dal virus. Sostituire il mezzo di coltura cellulare con 2 mL di DMEM contenente 10% FBS, 1% penicillina/streptomicina e concentrazioni appropriate di antibiotici da selezionare per l'integrazione e l'espressione plasmide. NOTA: Il plasmide di espressione z-tubulina-EGFP utilizzato negli esperimenti descritti porta un gene della resistenza alla fornella e il plasmide di espressione RFP-H2B porta un gene di resistenza blasticidin. Pertanto, per la selezione delle cellule hTERT RPE-1 vengono utilizzati 10 g/mL di puromycin e 2 g/mL di blasticidin, RFP-H2B. Le concentrazioni di antibiotici utilizzati per la selezione possono differire per varie linee cellulari utilizzate.</li>
	<li>Mantenere le cellule sotto selezione antibiotica per 5-7 giorni, sostituendo il mezzo ogni 3 giorni con un supporto fresco contenente reagenti di selezione appropriati. NOTA: le celle devono essere mantenute alla sottoconfluenza durante la selezione e devono essere espanse in base alle esigenze, come descritto nei passaggi da 1.1.1 a 1.1.4.</li>
	<li>Utilizzare l'imaging immunofluorescenza per confermare l'espressione dei costrutti contrassegnati. NOTA: se lo si desidera, è possibile derivare cloni di celle singole per ottenere livelli di espressione uniformi all'interno della popolazione di celle. Una volta confermati i cloni stabili, le cellule possono essere mantenute nelle condizioni di coltura standard in assenza di selezione antibiotica.</li>
</ol>2. Preparazione delle cellule per l'imaging delle cellule vive a seguito di perturbazioni del mandrino mitotico
NOTA: utilizzare tecniche asettiche ed eseguire i passaggi in un cabinet di sicurezza BSL2.
<ol><li>Utilizzando una sterile pipetta Pasteur in vetro usa e getta, aspirare il mezzo dalla piastra di coltura contenente la linea cellulare che trasporta i costrutti di espressione (dal punto 1.7). Lavare brevemente le cellule con 10 mL di PBS sterile. Swirl per distribuire PBS sul fondo della piastra, quindi aspirare PBS con una pipetta Pasteur in vetro usa e getta sterile.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di 0,05% di prova alla piastra da 10 cm. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 2-5 min o fino a quando le cellule si sono staccate dalla superficie della piastra.</li>
	<li>Aggiungere 8 mL di mezzo fresco alla piastra contenente la cappina. Risospendere le cellule con il tubo e trasferire delicatamente la sospensione in un tubo conico sterile da 15 mL. Posizionare il tubo conico in una centrifuga bilanciata e ruotare a 161 x g per 5 min a temperatura ambiente per spingere delicatamente le cellule.</li>
	<li>Aspirare con attenzione il superatante e risospendere in 10 mL di PBS pipetting delicatamente con una pipetta sierologica da 10 mL. Posizionare il tubo conico in una centrifuga bilanciata e ruotare a 161 x g per 5 min a temperatura ambiente per spingere delicatamente le cellule.</li>
	<li>Aspirare con attenzione il supernatante e risospendere in 10 mL del mezzo fresco pipeting delicatamente con una pipetta sierologica da 10 mL.</li>
	<li>Contare le celle, quindi calcolare il numero di cella utilizzando un emacytometro e diluire ad una concentrazione di 1-2 x 105 cellule / mL nel mezzo di coltura cellulare. Semina 500 l della sospensione cellulare per ogni pozzo di una piastra inferiore sterile da 12 pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatrice a coltura cellulare e consentire alle cellule di aderire alla superficie della piastra. NOTA: l'imaging a celle vive richiede che le cellule siano ben aderenti in modo che rimangano associate al piano di imaging durante l'acquisizione dell'immagine. La durata del tempo necessario affinché le cellule aderiscano dopo la placcatura possono differire da una linea cellulare a quella successiva e devono essere ottimizzate per la linea cellulare in fase di studio.</li>
	<li>Fino a 30 minuti prima di inizializzare l'imaging time-lapse, aggiungere una concentrazione rilevante di un farmaco mitotico a uno o più pozzi seminato con le cellule. Per tenere conto del potenziale impatto del solvente organico sul comportamento cellulare, aggiungere lo stesso volume del diluente dell'inibitore alle cellule come controlli. Ad esempio, assicurarsi che l'aggiunta di 100 nM dell'inibitore specifico della chinasi mitotica Aurora A (ad esempio, alisertib) sia parallela a un volume uguale di DMSO, il diluente per questo farmaco, in un pozzo di controllo delle cellule. NOTA: L'analisi comparativa dei cambiamenti dinamici nella progressione mitotica richiede la preparazione di pozzi di cellule in assenza di perturbazioni per consentire l'imaging di mitosi normali in parallelo alle condizioni sperimentali.</li>
</ol>3. Microscopio impostato per l'imaging time-lapse di RFP-H2B, cellule esprimibili di z-tubulina-GFP (Figura 1, Figura 2)
<ol><li>Posizionare la piastra di coltura cellulare contenente RFP-H2B, con cellule hTERT RPE-1 che esprimono le cellule hTERT RPE-1 in un inserto di fase appropriato su un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di una fotocamera ad alta risoluzione (dimensione in pixel di 0,67 camera ambientale preriscaldata a 37 gradi centigradi, e un sistema di erogazione per umidificato 5% CO2. NOTA: sia le camere ambientali chiuse che gli inserti a fase controllata dalla temperatura possono essere appropriati a condizione che sia possibile fornire il 5% di CO2 umidificato e ottenere un controllo stabile della temperatura.</li>
	<li>Utilizzare un obiettivo d'aria 20x con un'apertura numerica di 0,5 e attrezzato per la fluorescenza ad alto contrasto e il contrasto di fase o l'imaging del campo luminoso. Visualizzare le celle con il contrasto di fase o il campo luminoso e regolare il percorso e la messa a fuoco fine sul microscopio per mettere a fuoco le cellule.</li>
	<li>Identificare e impostare i tempi di esposizione ottimali per l'acquisizione di immagini di campo luminoso, GFP e RFP selezionando il rispettivo cubo di filtro con eccitazione ed emissione appropriate per i fluorofori che verranno fotografati. In alternativa, fare clic sul pulsante di esposizione automatica per immettere un tempo di esposizione predeterminato. Se il segnale non è sufficientemente intenso, selezionare il binning dei pixel per consentire tempi di esposizione più brevi facendo clic sulla scheda binning e selezionando 2 x 2 pixel binning dal menu a discesa. NOTA: La fototossicità può compromettere la progressione mitotica e la vitalità cellulare. Il fallimento delle cellule mitotiche nelle popolazioni di controllo nel completare le mitosi normali può essere un'indicazione che i tempi di esposizione e/o la durata dell'imaging devono essere ulteriormente ottimizzati.</li>
	<li>Utilizzare un software di acquisizione e analisi che consente di acquisire contemporaneamente l'imaging multi-coordinate e multi-pozzetto e definire i parametri per l'acquisizione dell'immagine.<ol>
<li>Selezionare e calibrare lo stadio del microscopio al piatto multi-bene, secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare il software di acquisizione delle immagini per evidenziare o selezionare in altro modo i pozze che verranno immagini facendo clic sui pozzi rilevanti nel diagramma del formato piastra che viene utilizzato.</li>
		<li>Sotto il pannello di controllo GeneratedPoints (Figura 2), definire le coordinate all'interno di ogni pozzo che verrà visualizzato facendo clic sulla scheda Posizionamento punti e selezionando il posizionamento delle coordinate predefinite o casuali da dal menu a discesa. Selezionare la scheda Area di lavoro e selezionare limitata dal menu a discesa per limitare l'area di selezione delle coordinate per escludere i contorni del pozzo. Fare clic sulle schede Conteggio e Distribuzione per selezionare rispettivamente il numero e la distribuzione dei punti da acquisire. NOTA: Il numero di coordinate che possono essere imagete per bene all'interno dell'incremento del tempo di 5 min sarà limitato dal numero di pozzi da immaginare, nonché dal tempo di esposizione per ogni canale. Tipicamente, 5-8 coordinate per pozzo sono sufficienti per osservare almeno 50 cellule in ogni condizione di progresso attraverso la mitosi entro 4 h.</li>
		<li>Selezionare e immettere l'intervallo di tempo e la durata per raccogliere le immagini facendo clic e immettendo i valori nel pannello di controllo TimeSequence. NOTA: L'acquisizione di immagini ogni 1-5 minuti è appropriata per monitorare le dinamiche della progressione mitotica. La durata complessiva dell'imaging deve riflettere l'endpoint desiderato e la velocità di proliferazione della linea cellulare. Ad esempio, 4 ore sono sufficienti per vedere molte cellule progredire attraverso la mitosi, 16 ore sono sufficienti per vedere la maggior parte delle cellule RPE-1 in una popolazione asincrona progredire attraverso la mitosi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analisi dell'immagine time-lapse per determinare la temporizzazione della metafase e il destino delle cellule mitotiche a seguito di perturbazioni del mandrino mitotico
NOTA: eseguire l'analisi delle immagini utilizzando un software di acquisizione immagini (Table of Materials), ImageJ o un software di analisi delle immagini comparabile.
<ol><li>Visualizza la cromatina etichettata RFP-H2B selezionando le immagini acquisite con il cubo del filtro RFP sul posto. Identificare una cella che entra in mitosi come indicato dalla compattazione iniziale della cromatina(Figura 2C,freccia blu) e l'inviluppo nucleare si rompe (quando la z-tubulina-EGFP non è più esclusa dal confine nucleare).</li>
	<li>Determinare la temporizzazione mitotica dell'allineamento della metafase e dell'insorgenza dell'anafase nelle singole celle: traccia reperino la cella attraverso i tempi consecutivi nel filmato acquisito per determinare il numero di punti temporali/minuti dall'immissione mitotica fino alla cromatina con etichetta RFP-H2B completa l'allineamento in corrispondenza dell'equatore cellulare durante la metafase (Figura 2C, punta della freccia gialla).</li>
	<li>Per monitorare la temporizzazione mitotica, la fedeltà mitotica e il destino delle cellule, continuare a tracciare la cella attraverso tempi consecutivi per identificare la coordinata temporale in cui è evidente la segregazione del cromosoma anaphase(Figura 2C, freccia bianca) e/o dove si è verificata la decompazione della cromatina e la riforma dell'involucro nucleare (come indicato dall'esclusione della tubulina dal nucleo). NOTA: le perturbazioni nell'assemblaggio del mandrino o nella progressione mitotica possono essere valutate in funzione del tempo necessario per ottenere un mandrino mitotico bipolare e ottenere un allineamento cromosomico completo o per completare la segregazione del cromosoma anaphase.</li>
	<li>Visualizza RFP-H2B per identificare le cellule in ogni popolazione che presentano difetti mitotici, tra cui cromosomi in ritardo e ponti cromatici durante la segregazione cromosomica anafase. NOTA: La fedeltà mitotica compromessa può anche provocare cellule figlie multinucleate o micronucleate e può essere visualizzata nelle celle dopo l'uscita mitotica, come nella Figura 3.</li>
</ol>

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<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La risoluzione temporale fornita dall'imaging time-lapse consente la visualizzazione e la valutazione degli eventi cellulari sequenziali all'interno di singole cellule. Gli approcci che fanno uso della sincronizzazione cellulare seguita dalla raccolta e dalla fissazione delle cellule nei punti temporali sequenziali sono limitati in quanto i confronti vengono infine effettuati tra popolazioni di cellule. Nei contesti in cui la risposta cellulare alle perturbazioni può essere non uniforme, o in cui il processo visualizzato...

L'analisi basata sull'immagine delle cellule fisse è comunemente usata per valutare i cambiamenti del livello della popolazione cellulare in risposta a varie perturbazioni. In combinazione con la sincronizzazione delle celle, seguita dalla raccolta e dall'imaging di punti temporali seriali, tali approcci possono essere utilizzati per suggerire una sequenza cellulare di eventi. Tuttavia, l'imaging a cellule fisse è limitato in quanto le relazioni temporali sono implicite per una popolazione e non dimostrate a livello di singole cellule. In questo modo, mentre l'imaging e l'analisi delle cellule fisse sono sufficienti per osservare fenotipi robusti e cambiamenti di stato costante, la capacità di rilevare cambiamenti transitori nel tempo e cambiamenti che influenzano solo una sottopopolazione delle cellule è imperfetta. Al contrario, l'imaging delle cellule vive è uno strumento eloquente che può essere utilizzato per osservare i processi cellulari e subcellulari all'interno di una singola cellula, o popolazione cellulare, nel tempo e senza l'aiuto di approcci di sincronizzazione che possono avere un impatto sul comportamento cellulare 1 : il nome del , 2 Il nome del sistema , 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6.
La formazione di un mandrino mitotico bipolare è essenziale per la corretta segregazione cromosomica durante la divisione cellulare, con conseguente due cellule figlie geneticamente identiche. I difetti nella struttura del mandrino mitotico che corrompono la progressione mitotica e compromettono la fedeltà della segregazione cromosomica possono portare a divisioni cellulari catastrofiche e a una riduzione della vitalità cellulare. Per questo motivo, i veleni mitotici che alterano la formazione del mandrino sono promettenti terapie per limitare la rapida proliferazione delle cellule tumorali7,8,9. Tuttavia, l'analisi a cellule fisse della struttura del mandrino dopo l'aggiunta di veleni mitotici è limitata nella sua capacità di valutare il processo dinamico di formazione del mandrino e non può indicare se i cambiamenti osservati nella struttura del mandrino sono permanenti o sono invece transitorio e può essere superato per consentire la divisione cellulare di successo.
In questo protocollo, descriviamo un approccio per valutare la dinamica della mitosi in seguito alle perturbazioni del mandrino mediante l'imaging delle cellule vive. Utilizzando la linea cellulare RPE-1 immortalata hTERT progettata per esprimere un Histone 2B con tag RFP per visualizzare la cromatina, insieme a una z-tubulina con tag EGFP per visualizzare i microtubuli, la tempistica dell'allineamento del cromosoma della metafase, l'insorgenza dell'anfase e, infine, l'insorgenza il destino delle cellule mitotiche viene valutato utilizzando segnali visivi di movimento cromosomico, compattazione e morfologia nucleare.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>25-510</td><td>Una serina proteasi utilizzata per rilasciare cellule aderenti da piastre di coltura</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 15 ml</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Obiettivo Fluor.</td><td>Nikon</td><td></td><td>Per l'uso nell'imaging di cellule vive per visualizzare sia il campo chiaro che la fluorescenza</td></tr><tr><td>Cellule 293T ATCC</td><td></td><td>CRL-3216</td><td>Per l'uso nella trasfezione retrovirale; utilizzato nella fase 1.1</td></tr><tr><td>a-tubulina-EGFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>vari numeri</td><td>Vettore di espressione per l'alfa tubulina fusa con un tag proteico fluorescente verde; per l'uso nella visualizzazione della tubulina nell'imaging di cellule vive: disponibile in commercio tramite addgene e altri fornitori</td></tr><tr><td>Alisertib</td><td>Selleckchem</td><td>S1133</td><td>Inibitore di piccole molecole della chinasi mitotica Aurora A. La concentrazione stock viene preparata a 10mM in DMSO e utilizzata a una concentrazione finale di 100nM.</td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Invitrogen</td><td>A11139-03</td><td>Agente di selezione antibiotica; utilizzato per selezionare le cellule che esprimono EGFP</td></tr><tr><td>C02</td><td>Airgas</td><td></td><td>Per l'uso in colture cellulari e imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3)</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td>Set di filtri a banda singola; lunghezza d'onda di eccitazione 545 nm con larghezza di banda di 25 nm ed emissione a lunghezza d'onda di 605 nm con larghezza di banda di 70 nm; per la visualizzazione di H2B-RFP</td></tr><tr><td>Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2)</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td>Set di filtri a banda singola; lunghezza d'onda di eccitazione 470 nm con larghezza di banda di 40 nm ed emissione a lunghezza d'onda di 525 nm con larghezza di banda di 50 nm; per la visualizzazione di</td></tr><tr><td>pipette Pastuer in vetro monouso GFP-tubulina, sterilizzate&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Per l'uso in celle di aspirazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>11965-084</td><td>Terreno di coltura cellulare per la crescita di cellule RPE-1 e 293T</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>10438-026</td><td>Integratore di terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 e p3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000-015</td><td>Reagente di trasfezione a base di lipidi per la trasfezione di plasmidi; utilizzato in 1.1.4</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali multipozzetto</td><td>Corning</td><td>vari</td><td>per l'uso in colture cellulari, trasfezione/infezione e imaging di cellule vive</td></tr><tr><td>Microscopio Nikon Ti-E</td><td>Microscopio</td><td>a epifluorescenza invertito Nikon per l'uso nell'imaging di cellule vive</td>NIS Elements HC&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Versione 4.51</td><td>Software di acquisizione e analisi delle immagini; utilizzato nelle sezioni 3 e 4</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>31985-070</td><td>Terreno sierico ridotto per la trasfezione cellulare; utilizzato nella fase 1.1.3</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>15140-122</td><td>antibiotico utilizzato in colture cellulari</td></tr> soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato medio (PBS)</td><td>Caisson labs</td><td>PBP06-10X1LT</td><td>soluzione salina sterile per l'uso con colture cellulari</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Costrutto di espressione dell'involucro VSV-G lentivirale; utilizzato nel passaggio 1.1.4</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>Polimero cationico utilizzato per migliorare l'efficienza dell'infezione virale; utilizzato nel passaggio 1.1.10</td></tr><tr><td>psPAX</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>plasmide di confezionamento lentivirale di 2a generazione; utilizzato nel passaggio 1.1.4</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pr-1</td><td>Agente di selezione antibiotica; utilizzato per selezionare per RFP-H2B che esprimono cellule RFP-H2B</td></tr><tr><td>RFP- Istone 2B (H2B)</td><td>Addgene</td><td>vari numeri</td><td>Vettore di espressione per l'istone 2B marcato con proteina fluorescente rossa; per l'uso nella visualizzazione della cromatina nell'imaging di cellule vive: disponibile in commercio tramite Addgene e altri fornitori</td></tr><tr><td>RNAi Max</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>Reagente di trasfezione a base di lipidi per la trasfezione di cellule RPE-1 costrutti siRNA</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td>Linea cellulare epiteliale pigmentata retinica umana</td></tr><tr><td>Piatto di coltura tissutale 100x20mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>353003</td><td>per l'uso nella coltura di cellule aderenti</td></tr><tr><td>Zyla sCMOS camera&nbsp;</td><td>Fotocamera Nikon</td><td></td><td>collegata al micrscopio, utilizzata per catturare immagini di cellule</td></tr></tbody></table>

live cell imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

L'imaging time-lapse delle cellule vive è uno strumento importante nella biologia cellulare che fornisce informazioni sui processi cellulari che potrebbero altrimenti essere trascurati, fraintesi o mal interpretati dall'analisi a cellule fisse. Sebbene l'imaging e l'analisi delle celle fisse siano robuste e sufficienti per osservare lo stato costante cellulare, può essere limitata nella definizione di un ordine temporale di eventi a livello cellulare ed è mal equipaggiata per valutare la natura transitoria dei processi dinamici, tra cui progressione mitotica. Al contrario, l'imaging delle cellule vive è uno strumento eloquente che può essere utilizzato per osservare i processi cellulari a livello di singola cellula nel tempo e ha la capacità di catturare le dinamiche dei processi che altrimenti sarebbero scarsamente rappresentati nell'imaging di cellule fisse. Qui descriviamo un approccio per generare cellule che trasportano marcatori fluorescenti etichettati di cromatina e microtubuli e il loro uso in approcci di imaging a cellule vive per monitorare l'allineamento del cromosoma metafase e l'uscita mitotica. Descriviamo tecniche basate sull'imaging per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica, compresa l'identificazione delle cellule in varie fasi della mitosi, l'identificazione e il monitoraggio dei difetti mitotici, nonché l'analisi delle dinamiche del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo il trattamento con inibitori mitotici.

Valutazione della progressione mitotica in presenza di perturbazioni del mandrino La regolazione della messa a fuoco del mandrino è un passo essenziale nella corretta formazione del mandrino bipolare. Interruzione in questo processo attraverso l'esaurimento delle proteine, inibizione dei farmaci, o alterazioni nel numero centroso centroso struttura del mandrino corrotto e ritardare o arrestare la progressione mitotica10,<sup class="xr...

Qui presentiamo un protocollo per valutare la dinamica della formazione del mandrino e della progressione mitotica. La nostra applicazione di imaging time-lapse consente all'utente di identificare le cellule in varie fasi della mitosi, monitorare e identificare i difetti mitotici e analizzare la dinamica del mandrino e il destino delle cellule mitotiche dopo l'esposizione a farmaci anti-mitotici.

Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

L'imaging cellulare vivo consente l'osservazione di processi cellulari dinamici nel tempo all'interno di una singola cellula. Questi approcci sono potenti per valutare le condizioni che hanno un impatto sul processo dinamico di divisione cellulare e rivelare gli impatti che i difetti della mitosi hanno sulla proliferazione e sulla vitalità delle cellule figlie. La fototossicità che deriva dall'esposizione alla luce durante l'imaging rappresenta una sfida significativa associata a questo protocollo.Pertanto, i tempi di esposizione e l'intervallo e la durata dell'imaging dovrebbero essere ottimizzati. Utilizzando la tecnica aseptica e un armadio di sicurezza di livello due di biosicurezza, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro monouso sterile per aspirare il mezzo dalla piastra di coltura contenente la linea cellulare che porta il costrutto di espressione di interesse. Lavare brevemente le cellule con 10 millilitri di PBS sterile con vorticoso e trattare le cellule con due millilitri dello 0,05% di tripside.Dopo due o cinque minuti a 37 gradi Celsius, aggiungere otto millilitri di mezzo fresco alla piastra per fermare la reazione e rimostrare le cellule staccate con una delicata pipettazione. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo sterile da 15 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Rimorsi il pellet in 10 millilitri di PBS e centrifugare di nuovo le cellule.Resostigliere il pellet in 10 millilitri di mezzo per contare e diluire le cellule a una o due volte 10 alla 5a cella per millilitro di concentrazione media di coltura cellulare. Quindi seminare 500 microlitri di cellule in ogni pozzo di una piastra inferiore sterile da 12 porsi e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per consentire alle cellule di aderire alla superficie della piastra. Non più di 30 minuti prima dell'imaging, aggiungere una concentrazione rilevante di un farmaco mitotico a uno o più pozzi e aggiungere un volume uguale del diluente inibitore allo stesso numero di pozzi dei controlli.Per preparare il microscopio per l'imaging, posizionare la piastra sullo stadio di un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di una telecamera ad alta risoluzione, una camera ambientale preriscaldata a 37 gradi Celsius e un sistema di erogazione per l'anidride carbonica umidificata al 5%. Selezionare un obiettivo aria 20 volte superiore con un'apertura numerica di 0,5 e attrezzato per la fluorescenza ad alto contrasto e il contrasto di fase, o l'imaging a campo luminoso e visualizzare le celle per regolare il corso e trovare messa a fuoco per mettere a fuoco le cellule. Per impostare i tempi ottimali di esposizione per l'acquisizione di immagini di campo luminoso, GFP e RFP, selezionare i rispettivi cubi di filtro con l'eccitazione e l'emissione appropriate per i fluorofori che verranno immaginati e fare clic su Riproduci.Se il segnale non è sufficientemente intenso, regolare l'esposizione automatica e in ogni canale del fluorofore selezionare il binning appropriato dal menu a discesa Formato. Selezionare e calibrare lo stadio del microscopio sul piatto multi-pozzo secondo le istruzioni del produttore e utilizzare il software di acquisizione delle immagini per evidenziare o selezionare in altro modo i pozzi che verranno imageati. Aprite il pannello di controllo punti generati e in Area di lavoro selezionate Limitato (Restricted) e Bordo (Border) per limitare l'area di selezione delle coordinate per escludere i limiti del pozzo.Nel menu a discesa Restrizione area (Area Restriction), selezionate Intera area (Whole Area) e selezionate un posizionamento casuale dei punti. Impostare il conteggio su sei e fare clic su Randomize per selezionare rispettivamente il numero e la distribuzione dei punti da catturare per pozzo. Quindi fare clic e immettere i valori nel pannello di controllo della sequenza temporale per selezionare e inserire l'intervallo di tempo e la durata per la raccolta delle immagini.Per visualizzare la cromatina etichettata RFP-H2B, selezionare le immagini acquisite con il cubo filtrante RFP in posizione e identificare una cellula che entra nella mitosi come indicato dalla compattazione iniziale della cromatina e dalla rottura dell'involucro nucleare per determinare la tempistica mitotica dell'allineamento della metafase e dell'esordio di anafase nelle singole cellule. Traccia la cella di interesse attraverso punti di tempo consecutivi nel filmato acquisito per determinare il numero di punti di tempo o minuti dall'ingresso mitotico fino a quando la cromatina etichettata RFP-H2B completa l'allineamento all'equatore cellulare durante la metafase. Per monitorare la tempistica mitotica, la fedeltà mitotica e il destino cellulare, continuare a tracciare la cellula attraverso punti temporali consecutivi per identificare la coordinata temporale in cui la segregazione cromosomica anafase è evidente e /o quando si è verificata la decomposizione della cromatina e la riforma dell'involucro nucleare.Quindi visualizzare RFP-H2B per identificare le cellule in ogni popolazione che presentano difetti mitotici, inclusi cromosomi in ritardo e ponti di cromatina durante la segregazione cromosomica dell'anafase. Visualizzando alfa tubulina-EGFP, si può osservare che le cellule che sperimentano l'interruzione del mandrino subiscono cambiamenti dinamici man mano che si ottiene la messa a fuoco del mandrino e si forma un mandrino mitotico bipolare in preparazione alla divisione cellulare. In concomitanza con l'assemblaggio del mandrino, il movimento cromosomico può essere visualizzato con RFP-H2B per valutare l'allineamento cromosomico e la fedeltà alla segregazione.Utilizzando approcci di imaging a cellule vive, questi risultati rappresentativi mostrano che le cellule con un normale contenuto di centrosoma sono in grado di procedere dalla rottura dell'involucro nucleare attraverso l'allineamento della metafase e l'insorgenza dell'anafase per ottenere una divisione bipolare in meno di 30 minuti. In presenza di centrisomi extra, quasi il 50% delle cellule è in grado di superare un mandrino mitotico multipolare transitorio e di formare un mandrino bipolare in completa divisione cellulare. Le cellule rimanenti non sono in grado di ottenere un mandrino bipolare e, di conseguenza, escono dalla mitosi attraverso una divisione multipolare.Indipendentemente dal fatto che si ottiene il bipolarismo del mandrino, le cellule con centrosomi extra mostrano una durata significativamente maggiore della mitosi rispetto alle cellule con due centrosomi. Indicando che la dinamica della progressione mitotica può essere alterata anche quando i cambiamenti nel risultato mitotico non sono evidenti. Quando si definiscono i tempi di esposizione per i canali fluorescenti, ottimizzare i tempi di esposizione per limitare la fototossicità.È inoltre possibile selezionare il binning dei pixel della fotocamera per consentire l'uso di tempi di esposizione inferiori. Questa procedura ha applicazioni in screening farmacologici, invasione e analisi della migrazione. Questi approcci possono anche essere utilizzati per esaminare l'efficacia dei trattamenti farmacologici o la dinamica della motilità cellulare.

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Live Cell Imaging per valutare la dinamica della temporizzazione metafase e del destino delle cellule a seguito di perturbazioni mitotiche del mandrino (Video) | JoVE Journal

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