Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

I preparati superficiali cocleari consentono la visualizzazione dell'intera lente dell'organo di Corti utilizzando immunoistochimica e imaging confocale. È stato ampiamente utilizzato per lo studio di specifiche patologie cocleari di interesse. Modificheremo il metodo della microdisezione cocleare.

Il principale vantaggio di questa tecnica è l'aderenza di un pezzo di epitelio cocleare a coverlips rotondi da 10 millimetri per la procedura di immunoetichettatura evitando la perdita di tessuto durante le molteplici fasi di lavaggio. Oltre alle patologie cocleari, la preparazione della superficie cocleare può anche essere utilizzata per l'espressione di valutazione e la rigenerazione delle cellule ciliate. Per questa tecnica sono necessarie competenze al microscopio di base e la dimostrazione visiva del metodo può aiutare a garantire che ogni passaggio sia eseguito correttamente.

A dimostrare la procedura sarà Qiaojun Fang, uno studente laureato del mio laboratorio. Per l'estrazione temporale delle ossa, tirare immediatamente la pelle anteriormente per esporre l'osso del cranio e utilizzare le forbici per tagliare l'osso dall'aspetto posteriore in avanti lungo la linea centrale del cranio. Utilizzare le forcep per rimuovere il tessuto cerebrale prima di utilizzare il pollice e l'indice per rimuovere manualmente le ossa temporali dai topi di età tre mesi o più.

Posizionare le ossa in una piastra di Petri di 30 millimetri di diametro contenente ghiaccio fresco freddo 4%PFA e PBS sotto un microscopio a dissezione e rimuovere le stapes dalla finestra ovale. Forare la membrana della finestra rotonda con pinzosa numero cinque e utilizzare un ago calibro 27 attaccato a una siringa millilitro contenente pfa fresco al 4% per fare un piccolo foro nell'apice della coclea. Perfondere delicatamente e lentamente la cochlea con una soluzione fissante attraverso le finestre rotonde e ovali fino a quando la soluzione non esce dal piccolo foro all'apice.

Quindi trasferire fino a due coclleae perfuse in singole fiale a scintillazione da 20 millilitri contenenti 10 millilitri di 4%PFA per flaconcino e agitare delicatamente i campioni per due ore a temperatura ambiente, seguita da conservazione notturna a quattro gradi Celsius su un rotatore. La mattina seguente, lavare le cochleae con tre lavaggi di cinque minuti con PBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 20 millilitri di 4%EDTA a ciascuna fiala e ruotare i campioni per 48 ore a quattro gradi Celsius con delicata agitazione.

Al termine dell'incubazione, toccare la porzione vestibolare ossea di ogni coclea con forceps per valutare l'elasticità dei campioni. Se le ossa sono elastiche piuttosto che ferme, i coclea sono stati decalcificati. Sostituire l'EDTA per ogni campione con PBS fresco.

Per la microdisezione dell'epitelio cocleare, afferrare la porzione vestibolare dell'osso temporale con le forcep e utilizzare un bisturi per tagliare la rotazione apicale con un angolo di 45 gradi. Tagliare verticalmente lungo la debole linea tra la finestra rotonda e la finestra ovale per separare la coclea dalla porzione vestibolare e orientare la porzione cocleare con la svolta basale verso il basso e il centro gira verso la parte superiore della piastra di Petri. Da questa posizione, tagliare la capsula ossea e la parete laterale della curva centrale verso l'estremità da cui è stata rimossa la sezione apicale e continuare a tagliare per separare completamente la porzione centrale dalle regioni basale e uncino.

Posizionando la porzione basale e uncino con il sito della membrana basilare orientato verso il fondo del piatto, tagliare verticalmente la medialis dalla regione del gancio per rimuovere la medialis e tagliare le regioni basali e uncino per separare la porzione di gancio. Per evitare distorsioni del tessuto, tagliare la medialis dalla regione del gancio prima della separazione della curva basale e della regione del gancio. Tagliare le porzioni relativamente grandi della capsula ossea e del tessuto della parete laterale della curva centrale e tenere la parete laterale con le forcep per allineare la capsula ossea e la parete laterale con il fondo della piastra di Petri, tagliare questi tessuti dal lato della membrana basilare.

Quindi, appiattire il campione per orientare il lato della superficie sensoriale della cellula capillare verso l'alto e tagliare via il resto della capsula ossea e della parete laterale. Quindi utilizzare le forcelle per rimuovere la membrana tectoriale per separare completamente la regione centrale e rimuovere la capsula ossea, il tessuto della parete laterale e le regioni tectoriali delle curve rimanenti come appena dimostrato. Una volta sezionate tutte le curve cocleari, stendere 0,5 microlitri di adesivo cellulare e tissutale al centro di un coperchio rotondo di 10 millimetri e lasciare asciugare l'adesivo per tre o cinque minuti a temperatura ambiente.

Posizionare le coverlips essiccate nella piastra di Petri e attaccare tutti e quattro i pezzi di ogni campione di epitelio sensoriale su un coperchio. Quindi utilizzare le forcep per afferrare un bordo di ogni coverlip per trasferire i campioni in singoli pozzi di un piatto di coltura cellulare a quattro pozzi per l'immunoetichettatura. Per l'immunoetichettatura dei preparati di sinapsi cocleare superficiale, lavare ogni epitelio sensoriale tre volte per cinque minuti in PBS fresco per lavaggio, seguito dal trattamento di ciascun campione con due millilitri del 2% di tensioattivo non ionico per 30 minuti a temperatura ambiente su un rotatore.

Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione tensioattiva da ogni pozzo e bloccare qualsiasi legame non specifico con 100 microlitri di soluzione di blocco per bene per un'ora sul rotatore con delicata agitazione a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di blocco, lavare i campioni tre volte con PBS come dimostrato sotto delicata agitazione prima di etichettare ogni epitelio con 100 microlitri degli anticorpi primari di interesse per 24 ore a 37 gradi Celsius protetti dalla luce. Il giorno successivo, lavare i campioni tre volte con PBS fresco e agitazione delicata per lavaggio ed etichettare i campioni con 100 microlitri degli anticorpi secondari appropriati di interesse per due ore a 37 gradi Celsius protetti dalla luce.

Al termine dell'incubazione, lavare i campioni con tre lavaggi di cinque minuti in PBS fresco per lavaggio prima di posizionare ogni coverlip su singoli vetrini al microscopio di vetro con i campioni rivolti verso l'alto. Successivamente, aggiungere con cura otto microlitri di un mezzo di montaggio appropriato al centro di ogni coverlip e utilizzare le forcep per montare un altro coverslip di 10 millimetri su ciascun campione. Quindi sigillare i lati di ogni sandwich di coverlip con smalto chiaro, posizionare i campioni in una cartella di diapositive di cartone e conservare le diapositive a quattro gradi Celsius.

Sebbene la dissezione delle cocleae di topo adulte per i preparati superficiali non sia semplice, i ricercatori nuovi alla tecnica dovrebbero essere in grado di imparare il metodo dopo aver praticato con 10-15 orecchie. L'immunoetichettatura dei preparati superficiali di topi CBAJ non trattati di 10-12 settimane con CTBP2 e GluA2 dimostra che sia i nastri presnaptici che i terminali postsinaptici si trovano rispettivamente sotto i nuclei interni delle cellule ciliate e sono giustapposti indicando sinapsi funzionali. L'immunoetichettatura per la miosina 7A e la contromanifestazione con phalloidina e DAPI rivela la presenza di cellule ciliate sensoriali tra cui le cellule ciliate esterne e le cellule ciliate interne e i loro nuclei.

L'immunoetichettatura per la miosina 7A e la contromanifestazione con phalloidina non mostra differenze nell'immunoreattività o uniformità con o senza l'uso di adesivo cellulare e tissutale. Inoltre, la microscopia elettronica a scansione di preparati superficiali da topi C57 black 6 non trattati di sei-otto settimane dimostra una stereocilia ben organizzata a forma di V delle cellule ciliate esterne in tre file del campione. Ricordarsi di riempire il cocleare con soluzione fissante delicatamente e lentamente attraverso le finestre rotonde e ovali fino a quando la soluzione non esce dal piccolo foro all'apice.

Prima di separare la regione del gancio dalla curva basale, fare attenzione a tagliare la medialis fuori dalla regione del gancio per facilitare la rimozione della medialis.