Istituzione e caratterizzazione degli spheroeroidi del tumore intestinale piccolo intestinale
14 ottobre 2019
I tumori neuroendocrini (NET) provengono da cellule neuroendocrine della cresta neurale. Sono in crescita lenta e impegnativi per la cultura. Vi presentiamo una strategia alternativa per far crescere le piccole viscere cullandoli come sferoidi. Questi sferoidi hanno piccoli marcatori di rete intestinale e possono essere utilizzati per i test antidroga.
Le cellule SBNET ben differenziate sono a crescita lenta e difficili da propagare. Le poche linee cellulari stabilite non sono prontamente disponibili per i ricercatori. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato questo protocollo di cultura 3D.
Il vantaggio di questa tecnica rispetto al metodo tradizionale di stabilire una linea cellulare SBNET è che le colture 3D possono essere ottenute e il test dei farmaci può essere fatto entro tre settimane. Questo metodo può essere applicato ad altri tumori neuroendocrini come i tumori neuroendocrini del pancreas. Dopo aver ottenuto un campione SBNET del paziente risigillato, tagliarlo a cubetti di cinque millimetri e conservarlo in 25 millilitri di mezzo DMEM F12 in un tubo conico per il trasporto.
Incubare i tumori nel mezzo di lavaggio preparato secondo le indicazioni manoscritte per 15 minuti. Quindi trasferirli su un nuovo piatto e tritarli in pezzi di meno di un millimetro usando forbici curve sterili. Trasferire i tessuti tritati in un nuovo tubo da 50 millilitri contenente 25 millilitri di mezzo di lavaggio, quindi centrifugare il campione a 500 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 10 millilitri di mezzo di lavaggio con collagenasi e DNasi. Lasciare digerire i tumori tritati a 37 gradi Celsius con scuotimento lento per 90 minuti. È importante non digerire e più volte i campioni di tumore.
Troppi enzimi o tempi di incubazione più lunghi uccideranno le cellule SBNET. Al termine della digestione, centrifugare il tubo a 500 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 15 millilitri di mezzo di lavaggio.
Posizionare un colino a celle di 70 micrometri sopra un nuovo tubo da 50 millilitri e trasferire 10 millilitri del tampone di lavaggio attraverso il filtro. Ruotare il tampone di lavaggio all'interno del tubo per evitare che le cellule si attacchino ai lati. Quindi filtrare la sospensione cellulare attraverso il filtro.
Centrifugare le cellule a 500 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 200 microlitri di mezzo di lavaggio. Posizionare il tubo sul ghiaccio e utilizzare cinque microlitri delle cellule per il conteggio delle cellule con un emocitometro.
Calcolare il numero di cellule, quindi ripetere la centrifugazione per rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in ECM liquido ad una concentrazione di un milione di cellule per millilitro. Successivamente, trasferire da cinque a 20 microlitri di sferoidi SBNET in ECM su una piastra di pozzo da 96 e posizionare la piastra in un incubatore di 37 gradi Celsius per consentire all'ECM liquido di solidificarsi. Aggiungere 200 microlitri di mezzo di coltura SBNET a ciascun pozzo contenente sferoidi o coltura gli organoidi nei mezzi delle cellule staminali come descritto in precedenza.
Utilizzare una pipetta P1000 per trasferire gli organoidi in un tubo da 1,5 millilitri e centrifugare il tubo a 1.500 volte g per un minuto per rimuovere il supernatante. Lavare la coltura con un millilitro di PBS e centrifugare di nuovo per rimuovere il supernatante. Quindi fissare gli organoidi aggiungendo 500 microlitri di paraformaldeide e incubandoli per 15 minuti.
Dopo l'incubazione, lavare la coltura due volte con un millilitro di PBS. Aggiungere 500 microlitri di PBS con 3%BSA e 0,1%Triton X-100 per permeabilizzare la coltura. Incubare il tubo per cinque minuti, quindi lavare gli organoidi tre volte con un millilitro di PBS e 3%BSA.
Successivamente, incubare la coltura con anticorpi primari per un'ora, quindi ripetere i lavaggi con PBS e BSA. Incubare con gli anticorpi secondari e ripetere i lavaggi assicurandosi di aspirare e scartare tutti i supernatanti. Per immaginire gli sferoidi, aggiungere cinque microlitri di supporto contenente DAPI e utilizzare una pipetta P20 per trasferire cinque microlitri degli sferoidi in uno scivolo di vetro.
Sigillare lo scivolo con un coverslip e un'immagine con un microscopio a fluorescenza utilizzando gli obiettivi 10, 20 e 40X. Rompere meccanicamente l'ECM con una pipetta P1000 e trasferirlo in un tubo sterile da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 1.000 volte g a quattro gradi Celsius.
Quindi rimuovere tutti i supernatanti e posizionare il tubo sul ghiaccio. Aggiungere da due a quattro volte il volume del nuovo ECM al pellet e mescolare il contenuto del tubo tubazione su e giù 10 volte assicurandosi di evitare l'introduzione di bolle d'aria. Trasferire da cinque a 20 microlitri della miscela ECM e SBNET su una nuova piastra da 96 pozza e consentire all'ECM di solidificarsi.
Quindi coprire l'ECM solidificato con il nuovo mezzo SBNET e mettere la piastra nell'incubatore. Se si spedono sferoidi SBNET in un altro laboratorio, trasferire gli sferoidi con il nuovo ECM in un pallone T25 e consentire all'ECM di solidificarsi. Riempire il pallone con mezzo sferoide SBNET, avvitare saldamente il cappuccio e preparare il pacco di spedizione.
Dopo aver ricevuto la cultura dello sferoide, rimuovere il mezzo di coltura e ripetere i passaggi precedenti per rimettere gli sferoidi in cultura. Il tasso di crescita dello sferoide SBNET è stato monitorato con immagini microscopiche. Ci vogliono circa 14 giorni perché gli sferoidi SBNET raddoppino quando i supporti di coltura vengono cambiati una volta alla settimana.
Dopo 14 giorni di coltura, gli sferoidi SBNET non aumentano di dimensioni. Gli sferoidi sono stati macchiati con anticorpi specifici contro la sinaptofisina, la cromogranina A e lo SSTR2 e sono stati con immagini utilizzando la microscopia ad immunofluorescenza. I dati hanno mostrato che questi marcatori sono localizzati nel citoplasma e nella membrana delle cellule SBNET.
Per garantire la specificità degli anticorpi, le stesse procedure di colorazione sono state eseguite su una linea organoide da un tumore del pancreas che non esprime sinaptofisina, cromogranina A e SSTR2 e non è stato rilevato alcun segnale verde. Il vantaggio principale dell'imaging ad immunofluorescenza è che può essere eseguito entro quattro ore e fornire informazioni di colorazione simili a quella dell'immunoistochimica. Coltivare SBNET come sferoidi è una tecnica preziosa per identificare i farmaci che possono inibire la crescita di SBNET.
Gli sferoidi sono stati trattati con rapamicina e inibitore del mTOR. Dopo cinque giorni, lo sferoide trattato con rapamicina formò una struttura simile all'uva e divenne apoptotico o necrotico. Quando si tenta questa procedura, è importante pre-bagnare il filtro cellulare e il tubo di raccolta con mezzo di lavaggio.
Ciò impedirà alle cellule SBNET di attaccarsi al filtro cellulare e al tubo di plastica. Con questo protocollo, scienziati e clinici possono stabilire colture sferoidi SBNET da tumori resected, condividerli con altri laboratori e usarli per testare i farmaci approvati dalla FDA.
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Panoramica
Questo studio presenta un nuovo protocollo di coltura 3D per la crescita di tumori neuroendocrini del tenue (SBNETs) ben differenziati a partire da campioni di pazienti. Questo metodo consente di effettuare test farmacologici entro tre settimane, superando i limiti associati all'istituzione di linee cellulari tradizionali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Tumori neuroendocrini
- Tecniche di coltura cellulare
- Metodologie di sperimentazione farmacologica
Sfondo
- I tumori neuroendocrini (NET) insorgono da cellule neuroendocrine.
- I SBNET sono a crescita lenta e difficili da coltivare.
- Le linee cellulari stabilizzate sono scarse e non ampiamente disponibili.
- Le tecniche di coltura 3D possono migliorare la propagazione e i test.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la coltura di SBNET.
- Facilitare i test farmacologici su NET coltivati.
- Fornire un protocollo applicabile ad altri tipi di tumori neuroendocrini.
Metodi Utilizzati
- I campioni di SBNET provenienti da pazienti resecati sono stati tagliati in cubi di cinque millimetri.
- I campioni sono stati conservati in mezzo DMEM F12 per il trasporto.
- È stato implementato un protocollo di coltura 3D per la crescita cellulare.
- Il test farmacologico è stato effettuato entro tre settimane dalla coltivazione.
Risultati principali
- Le colture 3D hanno espresso marcatori dei NET dell'intestino tenue.
- La sperimentazione farmacologica è stata eseguita con successo su sferoidi coltivati.
- Il metodo ha mostrato un potenziale applicativo ai NET pancreatici.
- I risultati indicano un'alternativa più rapida rispetto all'instaurazione tradizionale di linee cellulari.
Conclusioni
- Il metodo di coltura 3D è efficace per la propagazione di SBNET.
- Questo approccio può accelerare i tempi dei test farmacologici.
- Ulteriori ricerche potrebbero estenderne l'applicazione ad altri NET.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La creazione di modelli preclinici affidabili per tumori rari come i tumori neuroendocrini dell'intestino tenue (SBNETs) rappresenta un collo di bottiglia significativo nello sviluppo di farmaci oncologici, a causa della limitata disponibilità di linee cellulari derivate da pazienti e dei bassi tassi di proliferazione. Questo metodo di coltura in sferoidi 3D consente la rapida generazione di modelli di SBNET fisiologicamente rilevanti a partire da tumori resecati, sostenendo la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi entro un arco temporale di tre settimane. Preservando l'espressione dei marcatori neuroendocrini e le caratteristiche di risposta ai farmaci, l'approccio aumenta la capacità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta e supporta la priorizzazione del portafoglio per le terapie mirate ai NET.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante sferoidi di SBNET derivati da pazienti che mantengono l'espressione dei marcatori neuroendocrini (sinaptofisina, cromogranina A, SSTR2).
- Valore operativo: Fornisce un sistema di coltura 3D riproducibile per la validazione funzionale di bersagli, evitando i lunghi tempi necessari per l'istituzione di linee cellulari tradizionali.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico mantenendo condizioni simili al microambiente tumorale attraverso l'incapsulamento in matrice extracellulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera sferoidi SBNET standardizzati adatti allo screening di composti, con la possibilità di testare farmaci entro tre settimane dall'avvio della coltura.
- Output quantitativi: Permette la misurazione delle risposte citotossiche mediante modifiche strutturali (ad esempio, morfologia a grappolo) e marcatori di apoptosi/necrosi dopo trattamento con agenti come la rapamicina.
- Scalabilità e riutilizzo: I sferoidi possono essere criopreservati, trasportati in ECM e reimpiantati in laboratori riceventi, consentendo la standardizzazione del saggio tra diversi laboratori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Mantiene i principali biomarcatori SBNET nella coltura in sferoidi, supportando una continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica.
- De-risking meccanicistico: Consente la valutazione di inibitori della via mTOR in un modello 3D di NET clinicamente rilevante prima di studi in vivo.
- Avanzamento basato sul rischio: Facilita decisioni precoci di prosecuzione/cessazione basate sui profili di risposta ai farmaci nei sferoidi, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel flusso di lavoro della scoperta fornendo un modello preclinico rapido per la validazione dell'obiettivo e l'identificazione dei composti promettenti, collegando la biologia iniziale allo screening meccanicistico prima della validazione in vivo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi utilizzando sferoidi di SBNET derivati da pazienti che riflettono la biologia tumorale nativa.
- Screening: Permette la produzione di sferoidi pronti per il saggio, utili per valutare librerie di composti mediante letture quantitative della citotossicità.
- Analisi: Genera dati di immunofluorescenza e dati morfologici per valutare l'interazione con il bersaglio e le risposte fenotipiche.
- Ricerca traslazionale: Mantiene il fenotipo neuroendocrino, consentendo studi allineati ai biomarcatori che passano dai sferoidi ai modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma condivisibile e riproducibile di sferoidi SBNET applicabile tra diversi team di scoperta e collaboratori esterni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione degli obiettivi mantenendo l'identità neuroendocrina e la risposta ai farmaci in un modello tridimensionale derivato da pazienti.
- Valore operativo: Fornisce colture standardizzate e scalabili di sferoidi con cinetiche di crescita definite (raddoppio in circa 14 giorni) e compatibilità con protocolli di immunofluorescenza.
- Valore strategico: Accelera i tempi preclinici, consentendo una riduzione più rapida dei rischi meccanicistici e un miglioramento dell'efficienza del capitale nella scoperta di farmaci per tumori rari.
- Impatto sul portafoglio: Guida la priorizzazione dei candidati mirati ai tumori neuroendocrini aggiustata per il rischio, attraverso uno screening fenotipico precoce in un modello clinicamente rilevante.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel processamento sterile dei tessuti, digestione enzimatica e manipolazione della matrice extracellulare 3D.
- Dipende dall'accesso a centrifugazione, filtraggio cellulare, microscopia a fluorescenza e incubatori standard per colture cellulari.
- Necessita di una preparazione standardizzata del mezzo di lavaggio e della matrice extracellulare tra diversi siti per garantire l'integrità degli sferoidi e il mantenimento dei marcatori.
- Richiede l'ottimizzazione dei pannelli anticorpali e delle condizioni di permeabilizzazione per una rilevazione affidabile mediante immunofluorescenza dei marcatori dei SBNET.
- È limitato dalla disponibilità di tessuto SBNET fresco resecato e dalla necessità di evitare una sovradigestione durante il trattamento con collaghenasi/DNasi.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Title
0:44
Small Bowel Neuroendocrine Tumor (SBNET) Collection and Cell Dissociation
2:10
Culture of SBNET as Tumor Spheroids in ECM
4:02
Characterization of SBNET Spheroids by Immunofluorescence
5:50
Splitting SBNET Spheroids
7:23
Results: Immunofluorescence Imaging and Drug Testing of SBNET Spheroids
9:02
Conclusion
