Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

Abbiamo sviluppato un metodo di montaggio per l'imaging time-lapse che consente una crescita illimitata di embrioni zebrafish fragili e allo stesso tempo li mantiene in una posizione completamente fissa. Questo metodo di montaggio è veloce, facile ed economico e funziona per l'imaging di laboratorio su qualsiasi microscopio invertito. Abbiamo sviluppato questo metodo per l'imaging di embrioni di zebrafish vivi, ma potrebbe essere modificato per l'imaging di altri piccoli modelli di animali acquatici.

Inizia allevando il pesce zebra adulto. Nel pomeriggio, posizionare il pesce in vasche da riproduzione con un rapporto maschio-femmina di uno a due. Quindi preparare una soluzione stock di agarosio a bassa fusione dell'1% nei mezzi embrionale e scioglierla riscaldandola in un forno a microonde.

Aliquota la soluzione di agarosio in tubi da 1,5 millilitri. Fare una soluzione stock di 4%tricaina in acqua distillata e conservare l'agarosio e la tricaina a quattro gradi Celsius. La tricaina è tossica e deve essere pesata e preparata in una cappa aspirante.

Dopo l'accoppiamento, raccogliere gli embrioni di zebrafish in E3 in una piastra di Petri e incubarli a 26,5 gradi Celsius per circa 28 ore prima del montaggio. Anestetizza gli embrioni con lo 0,02% di tricaina e dechorionateli al microscopio afferrandoli delicatamente e separando il corione per rilasciare l'embrione. Poco prima del montaggio, riscaldare la soluzione di agarosio a 65 gradi Celsius e quindi lasciarla raffreddare a circa 30 gradi Celsius in modo che l'embrione non sia danneggiato dal calore e aggiungere tricaina alla soluzione di agarosio.

Utilizzare piatti inferiori in vetro da 35 millimetri con un fondo in coverglass numero zero. Posizionare delicatamente un embrione dechorionato con uno dei suoi lati laterali verso il fondo del piatto con una pipetta di vetro o una micropipetta, quindi rimuovere con cura l'E3 rimanente con una micropipetta. Aggiungere la prima soluzione di agarosio al piccolo pozzo creato dal coverglass attaccato al fondo del piatto per coprire l'embrione assicurandosi che l'agarosio copra il piccolo pozzo ma non lo trabocca.

Coprire il piccolo pozzo con un coverglass per creare uno spazio stretto pieno di agarosio con l'embrione tra i due coverglass. Posizionare uno strato di soluzione di agarosio all'1% sopra il coverglass su tutto il fondo del piatto che manterrà il vetro di copertura in posizione man mano che si solidifica. Quindi riempire la porzione rimanente del piatto con E3 contenente 0,02%tricaina per mantenere il sistema idratato.

Per identificare la concentrazione ottimale di agarosio per lo strato uno, montare gli embrioni in concentrazioni crescenti di agarosio ed eseguire l'imaging time-lapse per identificare la concentrazione che riduce al minimo la distorsione e la motilità dell'embrione, quindi testare una gamma più fine di concentrazioni in base ai risultati. Il passaggio più critico di questo protocollo è identificare la concentrazione ottimale di agarosio per lo strato uno. Testa diverse nano concentrazioni di agarosio come 0,030%0,032%ecc.

per trovare la concentrazione ottimale. Per eseguire l'imaging time-lapse degli embrioni, utilizzare uno stadio di microscopio con un incubatore impostato su 28,5 gradi Celsius e un'immagine per un massimo di 55 ore. Per immagini contemporaneamente più embrioni, utilizzare un adattatore da palcoscenico che contiene più piatti e ruotare i piatti uno per uno in modo che gli embrioni siano posizionati orizzontalmente.

Selezionare un obiettivo a basso ingrandimento, quindi individuare gli embrioni utilizzando l'oculare e infine allinearli orizzontalmente ruotando i piatti. Registrare la posizione degli embrioni nel software e creare un nome di file per il salvataggio automatico dei dati. Impostare le dimensioni del foro stenopeica, la velocità di scansione, le dimensioni dell'immagine e lo zoom.

Quindi selezionare un ingrandimento più elevato per acquisire immagini e i canali di fluorescenza da immaginire. Per ogni canale, regolare la potenza del laser e l'alta tensione del rilevatore assicurandosi di raccogliere la migliore gamma dinamica possibile evitando la saturazione e limitando lo sbiancamento delle foto. Successivamente, per immagini l'intero embrione con un obiettivo 10X, imposta le grandi impostazioni di acquisizione dell'immagine nel software per immagini diversi campi visivo e cucirli insieme regolando la posizione dell'embrione per assicurarti che si adatti a questa grande area dell'immagine.

Configurare le impostazioni per l'acquisizione delle pile Z in base alle indicazioni del manoscritto. Al fine di mantenere la messa a fuoco di più embrioni durante l'imaging time-lapse a lungo termine, utilizzare una messa a fuoco automatizzata e regolare i singoli livelli di offset per ogni embrione per mettere a fuoco sul piano di riferimento. Quindi impostare i parametri time-lapse nel software del microscopio per l'immagine per una durata di 55 ore a intervalli di un'ora.

Ad ogni ciclo, acquisire due set di dati sugli embrioni in sequenza e salvare automaticamente i dati. Utilizzare il software al microscopio per elaborare le immagini. Se è stato immaginato più di un embrione, creare file indipendenti per ogni embrione dividendo i set di dati in base alla posizione dell'imaging.

Convertire i set di dati di tempo 3D in set di dati di tempo 2D utilizzando proiezioni di intensità massima o uno strumento simile. Infine, crea file filmato salvando come AVI e selezionando l'opzione nessuna compressione con intervalli di 200 millisecondi per una velocità di riproduzione di cinque fotogrammi al secondo. Questo metodo di montaggio stratificato consente di immagine degli embrioni di zebrafish consentendo loro di crescere ma allo stesso tempo limitandone il movimento.

Se la concentrazione di agarosio è troppo alta, gli embrioni vengono distorti. Ma se è troppo basso, si sposteranno fuori dal campo visivo durante la microscopia time-lapse. La concentrazione ottimale di agarosio è stata riscontrata tra lo 0,028 e lo 0,034%Il pesce zebra transgenico vivo che esprime la RFP nell'intero embrione e la GFP nelle cellule endoteliali della vascucolatura sono state immagini per 55 ore durante le quali si è verificato il vaso intersegementale germogliato, si è sviluppata la vascucolatura subintestinale e della testa e si è verificata la condensazione del plesso caudale della vena con estensione del tronco.

Gli embrioni che esprimono GFP e motoneuroni sono stati immagini per visualizzare lo sviluppo dei motoneuroni. Gli assoni dei motoneuroni germogliano dal tubo neurale ventrale sopra i somiti verso il lato ventrale dell'embrione. Il co-sviluppo della germogliazione dorsale degli assoni dei motoneuroni in relazione alla posizione dei vasi intersegmentali è stato immaginato usando un ingrandimento più elevato.

Ciò ha permesso di visualizzare i dettagli più fini della germogliazione dell'assone ventrale e dell'assone dorsale che germoglia dal tubo neurale. Con l'aumento del numero di somiti, anche i somiti si estendono in lunghezza e larghezza. Questo processo è stato immaginato utilizzando embrioni transgenici che esprimono GFP nei muscoli.

Poiché la concentrazione ottimale di agarosio è molto stretta, è molto sensibile alle piccole variazioni nelle misurazioni durante la preparazione della soluzione stock di agarosio e deve essere ridefinita per ogni nuovo lotto di soluzione di agarosio. È importante impostare attentamente i parametri di imaging, tra cui dimensioni e risoluzione dell'immagine, velocità di scansione, zoom, alta tensione del rivelatore e potenza laser per garantire la coerenza tra gli esperimenti e anche per ridurre la possibilità di tossicità fotografica e sbiancamento delle foto durante l'imaging time-lapse a lungo termine. Utilizzando questo metodo di montaggio per embrioni transgenici di zebrafish seguito da un'imaging prolungata time-lapse dell'intero organismo, possiamo visualizzare come i diversi tessuti si sviluppano insieme.