Name: Escrescenza glomerare come unanalisi di Ex Vivo per analizzare i percorsi coinvolti nellattivazione delle cellule epiteliali Parietali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Impara a coltivare escrescenze glomerulari ex vivo da reni di topo per analizzare l'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Questo metodo consente di studiare i meccanismi cellulari coinvolti nella formazione di tessuto cicatriziale renale e testare potenziali farmaci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questa ricerca è stata sostenuta dalla fondazione rene olandese (sovvenzione 14A3D104) e dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO VIDI grant: 016.156.363).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida del Comitato Etico Animale della Radboud University Nijmegen.
NOTA: i topi di tipo selvaggio non trattati (WT) (n - 4) e i topi cd44-/- (n - 4) sono stati sacrificati all'età di 12-16 settimane. Sono stati usati sia topi maschi che femmine. Tutti i topi erano sullo sfondo C57Bl/6.
1. Dissezione renale del topo
<ol><li>Sacrifica topi WT sani o topi geneticamente alterati dalla lussazione cervicale.</li>
	<li>Dissect interi reni di topo direttamente dopo aver sacrificato i topi. Per questo, eseguire una laparotomia mediana utilizzando forbici addominali, tagliando la pelle e poi i muscoli addominali. Rimuovere l'intestino e posizionarlo accanto al mouse.</li>
	<li>Liberare i reni dal tessuto di collegamento e tirare fuori il rene con pinze chirurgiche, tagliando l'arteria renale, vena renale e ureter con le forbici.</li>
	<li>Rimuovere le capsule renali dai reni tenendo il rene con pinze chirurgiche ed estrarre la capsula utilizzando un altro paio di pinze.</li>
	<li>Mettere i reni in una piastra di coltura a 6 cellule (2 reni/bene) preparata con 2 mL di soluzione di sale equilibrato di Hanks (HBSS) per pozzo e posto su ghiaccio.</li>
</ol>2. Isolamento del glomeruli dal rene di topo
<ol><li>Trasferire i reni in un piatto Petri da 100 mm e tritare i reni in piccoli pezzi di 1/2 mm usando due bisturi. Mantenere i pezzi di rene macinati bagnati usando 1-2 mL di HBSS.</li>
	<li>Posizionare i pezzi di rene macinati sopra un setaccio di metallo di 300 m e premere il rene attraverso il setaccio utilizzando uno stantuffo di una siringa da 20 mL. Sciacquare ripetutamente il setaccio con HBSS in mezzo e raccogliere il flusso attraverso in una piastra Petri pulita utilizzando un pipet sierologico. Raccogliere anche tutto ciò che rimane / si attacca al lato inferiore del setaccio raschiando via con il bisturi e trasferirlo al flusso-attraverso raccolto (omogeneo renale).</li>
	<li>Sciacquare l'omogenea renale attraverso un setaccio di 75 m con HBSS. Raccogliere il flusso attraverso e successivamente sciacquare questo flusso attraverso un setaccio di 53 m. Lavare entrambi i setacci utilizzando HBSS per rimuovere tutte le strutture più piccole. NOTA: In questa fase il flusso, ma non viene sciacquato solo attraverso il setaccio di 75 m e 53 m. Lavaggio con HBSS è necessario rimuovere detriti e strutture più piccole sui setacci. Pertanto normalmente vengono utilizzati in totale 200-300 mL di HBSS.</li>
	<li>Raccogliere le strutture/materiali renali che rimangono sul setaccio 75 m e 53 m lavando la superficie superiore dei setacci con il mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 20% di siero di vitello fetale (FCS) e trasferire il materiale in una micropiastra di fissaggio ultra-basso a 6 bassissimi. NOTA: Per lavare la superficie superiore del setaccio, sciacquare il setaccio in posizione inclinata (>45) e raccogliere il materiale renale sul bordo del setaccio. Il materiale raccolto è arricchito per glomeruli incapsulati e incapsulati, mostrando solo pochi frammenti tubolari. I glomeruli incapsulati sono molto appiccicosi. Per raccogliere singoli glomeruli, è quindi importante evitare che i glomeruli aderiscano alla superficie di un piatto Petri o di un piatto di pozzo. Per evitare l'aderenza, utilizzare il supporto con 20% FCS e utilizzare piastre di fissaggio ultra-basse per questo passaggio.</li>
</ol>3. Coltura di escrescenza glomerare
<ol><li>Portare la microplacca di fissaggio ultra-bassa in un microscopio luminoso invertito e raccogliere singoli glomeruli incapsulati e/o incapsulati con una pipetta da 20 l. Evitare di pipettare altre strutture e detriti. Dopo aver raccolto un singolo glomerulus nella punta della pipetta, aggiungere il nuovo supporto DMEM senza materiale renale raccolto nella stessa punta di pipetta per un volume di 20 .</li>
	<li>Trasferire il singolo glomerulus con il mezzo DMEM da 20 gradi al centro di un pozzo di una piastra di coltura cellulare a 24 pozze e incubare per 3 h a 37 oC e 5% (v/v) CO2 per consentire l'attaccamento del glomerulus al centro del pozzo. Spostare con attenzione la piastra per evitare di galleggiare del glomerulus ai bordodel.</li>
	<li>Dopo 3 h incubazione, il glomerulus è attaccato al centro del pozzo. Aggiungere con attenzione 500 l di mezzo basale endoteliale (EBM) integrato con un kit per il fattore di crescita contenente idrocortisone, fattore di crescita endoteliale umano, estratto cerebrale bovino e anfido-amphotericina b di gentamicin B (Tabella dei materiali) e ulteriore 5% (v/v) FBS e 1% (v/v) penicillina / s ptomicina (pentre) ogni beh.</li>
	<li>Cultura il singolo glomeruli per 6 giorni a 37 gradi centigradi, 5% (v/v) CO2. NOTA: Entro 6 giorni si forma la crescita costituita da cellule epiteliali parietali. Se si mira a testare gli effetti di composti specifici o farmaci sulle cellule epiteliali parietali dovrebbe essere aggiunto al mezzo entro questo periodo di sei giorni.</li>
</ol>4. Analisi della proliferazione delle cellule epiteliali parietali
<ol><li>Analizzare l'escrescenza glomerare dopo 6 giorni. Scatta immagini microscopiche utilizzando un microscopio digitale a luce rovesciata.</li>
	<li>Utilizzare un software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ/FIJI) per determinare la superficie e il diametro della crescita glomerare e il numero di cellule in crescita o glomeruli in crescita.<ol>
<li>Per determinare la superficie di escrescenza glomerare, aprire il tif. file della crescita glomerare con barra della scala in ImageJ. Disegnare una linea retta sulla barra della scala e determinare la distanza in pixel facendo clic su analizza e misura (ad esempio, 1 mm e 460 pixel).</li>
		<li>Determinare la scala facendo clic su Analizza, impostare la scala e digitare la distanza nota in pixel (ad esempio, 460), digitare anche la distanza nota (ad esempio, 1) e l'unità di lunghezza (ad esempio, 1 mm). Fare clic su OK.</li>
		<li>Determinare quali risultati verranno visualizzati nella tabella dei risultati facendo clic su Analizza e quindi impostare le misurazioni. Per determinare la superficie della crescita glomerare, attivare l'area delle opzioni e l'etichetta di visualizzazione. Fare clic su OK.</li>
		<li>Per determinare la superficie della crescita glomerare, disegnare una selezione a mano libera intorno alla crescita glomerare. Fare clic su analizza e quindi misurare, verrà visualizzata una tabella dei risultati in ImageJ che mostra la superficie di crescita della superficie nella scala determinata in precedenza (vedere il passaggio 4.4, ad esempio, mm2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Caratterizzazione della crescita della cellula glomerare
NOTA: Per valutare la composizione cellulare della escrescenza, la colorazione dell'immunofluorescenza per i marcatori specifici delle cellule viene eseguita sulle escrescenze glomeriule a t e 6 giorni.
<ol><li>Rimuovere con attenzione il mezzo e lavare delicatamente la glomeruli due volte utilizzando la salina con buffer fosfato (PBS).</li>
	<li>Fissare per 10 min a temperatura ambiente utilizzando 2% (w/v) paraformaldeide (PFA) integrato con 4% (w/v) di saccarosio in PBS e lavare con attenzione 2x utilizzando PBS.</li>
	<li>Incubare con l'anticorpo primario con adeguata concentrazione (Tabella dei materiali) diluito nell'albumina del siero PBS-ovine (BSA) 1% (v/v) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare con cura 3x con PBS.</li>
	<li>Incubazione con anticorpo secondario (Tabella dei materiali) diluito in PBS-BSA 1% (v/v) al buio per 45 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare con cura 3x con PBS e montare utilizzando 1o2 gocce di supporto di montaggio acquoso con 4,6-diamidino-2-fenilondoma (DAPI) per visualizzare i nuclei e coprire il pozzo con uno slittamento di copertura rotondo.</li>
	<li>Scatta immagini microscopiche usando un microscopio fluorescente.</li>
</ol>

<ol><li>Fatima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parietal+epithelial+cell+activation+marker+in+early+recurrence+of+FSGS+in+the+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+CJASN%22%5BJournal%5D)">Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant.</a> Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).</li>
<li>Dijkman, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+cells+in+HIV+and+pamidronate-associated+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis+are+parietal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells.</a> Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).</li>
<li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+histological+patterns+in+glomerular+epithelial+cells+in+secondary+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).</li>
<li>Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+parietal+epithelial+cell+is+crucially+involved+in+human+idiopathic+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).</li>
<li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parietal+epithelial+cells+participate+in+the+formation+of+sclerotic+lesions+in+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).</li>
<li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+the+origin+of+glomerular+extracapillary+lesions+from+parietal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Smeets, B., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parietal+epithelial+cells+and+podocytes+in+glomerular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases.</a> Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).</li>
<li>Ryu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+leakage+through+glomerular+basement+membrane+ruptures+triggers+the+proliferation+of+parietal+epithelial+cells+and+crescent+formation+in+non-inflammatory+glomerular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury.</a> The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).</li>
<li>Eymael, J., Smeets, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+fate+of+the+regenerating+cells+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Origin and fate of the regenerating cells of the kidney.</a> European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).</li>
<li>Smeets, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+progenitor+cells+contribute+to+hyperplastic+lesions+of+podocytopathies+and+crescentic+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).</li>
<li>Eymael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+is+required+for+the+pathogenesis+of+experimental+crescentic+glomerulonephritis+and+collapsing+focal+segmental+glomerulosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis.</a> Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).</li>
<li>Roeder, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+ERK1%2F2+increases+CD44+in+glomerular+parietal+epithelial+cells+leading+to+matrix+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion.</a> Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).</li>
<li>Appel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+podocytes+from+glomerular+parietal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).</li>
<li>Yaoita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visceral+epithelial+cells+in+rat+glomerular+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture.</a> European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).</li>
<li>Kuppe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+of+Glucocorticoid+Action+in+GN%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Investigations of Glucocorticoid Action in GN.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).</li>
<li>Ohse, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+mouse+glomerular+parietal+epithelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Utilizzando il protocollo descritto in questo articolo, è possibile utilizzare glomeruli singoli incapsulati per valutare la proliferazione delle cellule epiteliali parietali che è una conseguenza dell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Questo modello ex vivo ci permetterà di studiare in dettaglio i percorsi molecolari, che sono coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Il metodo descritto si basa sul semplice concetto di dissezione renale e setacciatura per isolare e coltura incapsulato...

Le malattie glomeriari sono un importante gruppo di disturbi renali e rappresentano una delle principali cause della malattia renale allo stadio finale (ESRD). Sfortunatamente, le opzioni di trattamento specifiche sono limitate e la progressione verso l'ESRD è inevitabile. Le malattie glomerari sono definite dalla presenza di lesioni glomeriule e possono essere raggruppate in malattie infiammatorie e non infiammatorie. Anche se l'insulto iniziale è diverso, studi recenti hanno dimostrato che un meccanismo cellulare comune porta a iperplasia delle cellule epiteliali glomerale e, infine, alla glomerulosclerosi in tutte le malattie glomerari, indipendentemente dalla causa sottostante1,2,3,4.
In particolare, è stato dimostrato che le lesioni glomerulosclerotice sono composte principalmente da cellule epiteliali parietali attivate5,6. In condizioni fisiologiche, le cellule epiteliali parietali sono cellule epiteliali quiescenti piatte che riallineano la capsula del Bowman del glomerulus. Tuttavia, qualsiasi lesione glomerare dovuta a mutazioni genetiche (ad esempio, citopatie specifiche di podociti o mitocondriali), infiammazione o iperfiltrazione (ad esempio, causata da ridotta massa renale, ipertensione, obesità o mellito diabetico) può innescare l'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Le cellule epiteliali parietali attive proliferano e depositano matrice extracellulare che si traduce nella formazione di mezzalune cellulari o lesioni sclerotiche5,7,8. La progressione di questi processi comporta la perdita della funzione renale9. Pertanto, l'attivazione delle cellule epiteliali parietali è un fattore chiave nello sviluppo e nella progressione della glomerulosclerosi nelle malattie glomerari sia infiammatorie che non infiammatorie1,2,3,4,10.
I processi molecolari che mediano l'attivazione delle cellule epiteliali parietali sono ancora in gran parte sconosciuti. Recenti studi dimostrano che le cellule epiteliali parietali attivate de novo esprimono CD44, un recettore importante per l'attivazione di diversi percorsi coinvolti nella proliferazione cellulare e nella migrazione. Inoltre, l'inibizione del CD44 ha dimostrato di inibire l'attivazione delle cellule epiteliali parietali e attenuare la progressione della formazione della mezzaluna e della glomerulosclerosi nei modelli animali di malattie glomerari e infiammatorie11,12.
Poiché l'attivazione delle cellule epiteliali parietali è un attore chiave per lo sviluppo della glomerulsclerosi e della formazione della mezzaluna, l'inibizione di queste cellule potrebbe rallentare la progressione delle malattie glomerari. La chiarificazione delle vie molecolari che determinano l'attivazione delle cellule epiteliali parietali può portare allo sviluppo di interventi terapeutici specifici che attenuano la formazione delle lesioni iperplastiche e glomerulosclerotice nella malattia glomerare.
Nei modelli animali sperimentali, è spesso difficile fornire prove di un effetto diretto di un'espressione genica alterata (modelli di eliminazione o modelli murini transgenici) o di un trattamento farmacologico sulle cellule epiteliali parietali. In un topo knock-out convenzionale i cambiamenti osservati in vivo potrebbero essere spiegati da cambiamenti diretti nelle cellule epiteliali parietali. Tuttavia, poiché l'espressione genica è alterata anche in altri tipi di cellule all'interno del mouse, non si possono escludere gli effetti indiretti mediati da altri tipi di cellule. Lo sviluppo di topi condizionati cre-lox guidati da promotori attivi principalmente in cellule epiteliali parietali ha fornito una soluzione in alcuni casi13. Tuttavia, i modelli transgenici condizionali sono complessi e, anche se diventano disponibili linee più condizionali, per molte delle linee di topo convenzionali knock-out o transgeniche non esiste ancora un sostituto condizionale.
Per studiare gli effetti diretti sulle cellule epiteliali parietali, il nostro gruppo ha sviluppato un saggio ex vivo utilizzando glomeruli singoli incapsulati isolati dai reni dei topi per misurare e analizzare la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali parietali. Questo metodo ci permetterà di determinare gli effetti specifici delle cellule epiteliali parietali e di trovare vie responsabili per l'attivazione delle cellule epiteliali parietali e testare le opzioni di trattamento per inibire questa attivazione.

<table><tbody><tr><td>Piastra per colture cellulari a 24 pozzetti</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>BD Pharmingen</td><td>Marcatore cellulare endoteliale (concentrazione utilizzata 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>pollo-anti-ratto Alexa 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp;( concentrazione usata 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI-Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>Mezzo di montaggio contenente DAPI</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio digitale a luce invertita</td><td>Westburg, EVOS fl microscopio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>asino-anti-capra Alexa 568</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp;( concentrazione usata 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>asino-anti-coniglio Alexa 568</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp;( concentrazione usata 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's medium&nbsp;</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBM Medium</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBM-MV Single Quots kit</td><td>Lonza</td><td>contenente idrocortisone, hEGF, GA-1000, FBS e BBE</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Lonza</td> Siero fetale di vitello Lonza <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>capra-anti-sinaptopodin</td><td>Santa Cruz</td><td>Marcatore podocita (concentrazione utilizzata 1:200)</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>FIJI 1.51n</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Sarstedt</td><td>taglia 100</td><td></td></tr><tr><td>coniglio-anti-claudina1</td><td>Abcam</td><td>Marcatore di cellule epiteliali parietali (concentrazione utilizzata 1:100)</td><td></td></tr><tr><td>rabbit-anti-SSeCKS</td><td>Roswell Park Comprehensive Cancer Center, Buffalo, NY, USA</td><td>gentilmente fornito dal Dr. E. Gelman, marcatore di cellule epiteliali parietali</td> ratto-anti-CD44 BD Pharmingen Marcatore di cellule epiteliali parietali (concentrazione utilizzata 1:200) bisturi Dahlhausen misura 10 setacci&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Endecotts Ltd</td><td>taglia 300 & micro; m, 75 & micro; m, 53 & micro; m,</td> siringa in acciaio <td></td></tr><tr><td></td><td>BD Plastipak</td><td>formato: 20 ml</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastre ad attacco ultrabasso&nbsp;</td>Piastre <td></td><td>Corning Costar</td><td>a 6 pozzetti</td></tr></tbody></table>

escrescenza glomerare come un'analisi di ex vivo per analizzare i percorsi coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

L'attivazione delle cellule epiteliali parietali (PEC) è uno dei fattori chiave coinvolti nello sviluppo e nella progressione della glorulosclerosi. L'inibizione delle vie coinvolte nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali potrebbe quindi essere uno strumento per attenuare la progressione delle malattie glomerari. Questo articolo descrive un metodo per coltura e analizzare la crescita delle cellule epiteliali parietali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Dopo aver sezionato i reni di topo isolati, il tessuto viene macinato e i glomeruli vengono isolati dalla setacciatura. I glomeruli incapsulati vengono raccolti e i glomeruli singoli vengono coltivati per 6 giorni per ottenere la crescita glomerare delle cellule epiteliali parietali. Durante questo periodo, la proliferazione e la migrazione delle cellule epiteliali parietali possono essere analizzate determinando il numero di cellule o la superficie delle cellule in crescita in emigrazione. Questo saggio può quindi essere utilizzato come strumento per studiare gli effetti di un'espressione genica alterata nei topi transgenici o knockout o gli effetti delle condizioni di coltura sulle caratteristiche e la segnalazione della crescita delle cellule epiteliali parietali. Utilizzando questo metodo, è possibile studiare importanti vie coinvolte nel processo di attivazione delle cellule epiteliali parietali e, di conseguenza, nella glomerulosclerosi.

Un diagramma sistematico del metodo per eseguire l'escrescenza glomerare è illustrato nella Figura 1. Figura 2A-D mostra escrescenze glomeriul di glomeruli incapsulati in diversi punti temporali come osservato utilizzando microscopia leggera. Le escrescenze sono mostrate al giorno 2, 4 e 6 ( Figura 2B-D) nellacolturadopo l'isolamento glomerulus dal rene di topo. Al f...

Questo articolo descrive un metodo per coltivare e analizzare le escrescenze glomeriane delle cellule epiteliali glomeriali di glomeruli incapsulati isolati dal rene del topo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare i percorsi coinvolti nella proliferazione e migrazione delle cellule epiteliali parietali.

Escrescenza glomerare come un'analisi di Ex Vivo per analizzare i percorsi coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali Parietali

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

L'attivazione delle cellule epiteliali parietali è un fattore chiave nello sviluppo del tessuto cicatriziale nel glomerulo del rene. Utilizzando questo metodo, possiamo studiare i processi cellulari coinvolti in questa attivazione e, si spera, trovare opzioni di trattamento per rallentare o addirittura fermare la progressione della malattia. Il vantaggio principale della nostra tecnica è che usiamo cellule primarie che crescono direttamente dai glomeruli isolati.Dopo aver liberato i reni, come delineato nel manoscritto testuale, tenere il rene con le forcep chirurgiche e utilizzare un altro paio di forcep per estrarre le capsule renali. Successivamente, posizionare i reni nei pozzi di una piastra di coltura di sei pozzi che contengono ciascuno due millilitri di HBSS e posizionare la piastra di coltura sul ghiaccio. In primo luogo, trasferire i reni in una piastra di Petri di 100 millimetri e utilizzare due bisturi per tritarli in piccoli pezzi che sono approssimativamente da uno a due millimetri.Mantenere i pezzi di rene tritati bagnati con HBSS. Quindi, posizionare i pezzi di rene sopra un setaccio metallico di 300 micrometri e premere il rene attraverso il setaccio usando lo stantuffo da una siringa da 20 millilitri. Risciacquare ripetutamente il setaccio con HBSS nel mezzo e utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere il flusso e trasferirlo in una piastra di Petri pulita.Usa un bisturi per raschiare tutto ciò che rimane nel fondo del setaccio e trasferirlo all'omogeneato renale raccolto. Risciacquare l'omogeneato renale attraverso un setaccio di 75 e 53 micrometri con HBSS. Quindi, lavare entrambi i setacci con HBSS per rimuovere tutte le strutture più piccole.Raccogliere le strutture renali e il materiale rimasto nei setacci lavando la superficie superiore di ciascuno con DMEM integrato con siero di vitello fetale al 20% e trasferire il materiale nei pozzi di una micropiatta di attacco sei ben ultra-bassa. Portare la micropiatta di attacco ultra-bassa su un microscopio a luce invertita e utilizzare una pipetta da 20 microliter presa raccogliere singoli glomeruli incapsulati e o decapsulati. Dopo aver catturato un singolo glomerulus nella punta della pipetta, aggiungere un mezzo DMEM fresco senza materiale renale raccolto nella stessa punta della pipetta a un volume di 20 microlitri.Trasferire il singolo glomerulus con il mezzo DMEM al centro di un pozzo di una piastra di coltura cellulare di 24 po 'e incubare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per tre ore per consentire l'attacco del glomerulus al centro del pozzo. Dopo l'incubazione, il glomerulus sarà attaccato al centro del pozzo. Aggiungere con cura 500 microlitri di mezzo basale endoteliale integrati con un kit di fattori di crescita e un ulteriore 5%FBS e 1%penicillina e streptomicina ad ogni pozzo.Cultura il singolo glomeruli a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per sei giorni. Dopo sei giorni di incubazione, utilizzare un microscopio digitale a luce invertita per scattare immagini e analizzare la crescita glomerulare. Utilizzando un software di analisi delle immagini, determinare l'area di superficie della crescita in uscita glomerulare aprendo uno dei file di immagine con una barra di scala.Disegnare una linea retta sulla barra di scala e fare clic su Analizza, quindi misurare per determinare la distanza in pixel. Per determinare la scala, fate clic su Analizza (Analyze) e imposta scala (Set Scale) e immettete la distanza nota in pixel, la distanza nota e l'unità di lunghezza. Al termine, fare clic su Ok.Fare clic su Analizza e imposta misure. Quindi, controllare le opzioni per Area ed etichetta di visualizzazione. Al termine, fare clic su Ok.Quindi, disegna una selezione a mano libera intorno alla crescita glomerulare. Fate clic su Analizza (Analyze) e misura (Measure) per visualizzare una tabella dei risultati, che contiene l'area di superficie della crescita in uscita nella scala determinata in precedenza. in questo studio, le crescita glomerulari delle cellule epiteliali parietali dei glomeruli incapsulati sono isolate dai reni del topo, coltivate e analizzate.Le immagini rappresentative della microscopia luminosa mostrano le crescita glomerulari in diversi punti temporali durante la coltura dopo che i glomerulus sono isolati dai reni del topo. Al fine di convalidare che le cellule in crescita siano cellule epiteliali parietali, anche i glomeruli decapsulati vengono isolati e coltivati per sei giorni. I glomeruli decapsulati non mostrano alcuna crescita cellulare durante questo periodo di incubazione.La colorazione immunofluorescente viene quindi eseguita per diversi marcatori cellulari epiteliali parietali, marcatori specifici del sito fotografico e marcatori cellulari endoteliali. I risultati convalidano che le cellule in crescita, infatti, sono cellule epiteliali parietali. I glomeruli associati ai topi knockout CD44 mostrano un numero ridotto di cellule in crescita, così come una superficie ridotta di crescita glomerulare rispetto ai glomeruli isolati dai topi di tipo selvatico.Ciò suggerisce un ruolo importante per il CD44 nell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Utilizzando questa tecnica, è anche possibile studiare gli effetti sui farmaci sull'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Questo può essere fatto trattando i glomeruli isolati con il farmaco di tua scelta e per analizzare le differenze nella crescita cellulare e nella migrazione cellulare.

glomerular-outgrowth-as-an-ex-vivo-assay-to-analyze-pathways-involved

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video descrive il metodo per isolare i glomeruli intatti dai reni di topo. I glomeruli incapsulati e decapsulati così ottenuti possono essere ulteriormente utilizzati per la coltura di escrescenze di cellule epiteliali parietali dal rene murino.

Isolamento dei glomeruli: una tecnica per ottenere glomeruli intatti dal rene murino

La ghiandola lacrimale (LG) è un organo di ramificazione che produce i componenti acquose di lacrime necessarie per il mantenimento della visione e la salute oculare. Qui si descrive murino LG dissezione ed ex vivo le tecniche di coltura di decifrare vie di segnalazione coinvolte nello sviluppo di LG.

Manipolare il murino Ghiandola lacrimale

Questo protocollo descrive la decellularizzazione dei reni di ratto Sprague Dawley mediante perfusione anterograda di detergenti attraverso il sistema vascolare, producendo matrici extracellulari renali acellulari che fungono da modelli per il ripopolamento con cellule epiteliali renali umane. La ricellularizzazione e l'uso del saggio di perfusione della resazurina per monitorare la crescita vengono eseguiti all'interno di bioreattori di perfusione appositamente progettati.

Ripopolamento cellule epiteliali e preparazione di roditori matrice extracellulare Ponteggi per lo sviluppo del tessuto renale

Questo protocollo descrive un work-up completo del rene che deve essere eseguito in modelli murini di malattia glomerulare. I metodi consentono di dettagliate analisi funzionali, strutturali e meccanicistiche della funzione glomerulare, che può essere applicato a tutti i modelli murini di malattia glomerulare.

Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare

L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di isolare in modo efficiente culture vitale primaria glomeruli con contaminanti minimale per l'uso in una varietà di applicazioni a valle. Glomeruli isolati mantengono relazioni strutturali tra tipi di componenti delle cellule e possono essere coltivate ex vivo per un breve periodo.

Un metodo efficiente di setacciatura per isolare i Glomeruli intatti dal rene di ratto adulto.

Qui presentiamo un protocollo per l'etichettatura dei Murina in vivo delle proteine di superficie delle cellule glomerulari con biotina. Questo protocollo contiene informazioni su come irrorare i reni del mouse, isolare i glomeruli ed eseguire immunoprecipitazione endogena della proteina di interesse.

Isolamento dei Glomeruli e In Vivo di etichettatura delle proteine di superficie delle cellule glomerulari

Qui viene presentato un protocollo chimicamente definito per la derivazione di podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte ad alta efficienza (&gt;90%) e indipendenti da manipolazioni genetiche o selezione di sottopopolazioni. Questo protocollo produce il tipo di cellula desiderato entro 26 giorni e potrebbe essere utile per i test di nefrotossicità e la modellazione della malattia.

Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite

Presentato qui è un protocollo per progettare un sistema organo-on-a-chip personalizzato che ricapitola la struttura e la funzione della barriera di filtrazione glomerulare renale integrando cellule endoteliali epiteliali e vascolari geneticamente abbinate differenziate dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane. Questo sistema bioingegnerizzato può far progredire la medicina di precisione renale e le applicazioni correlate.

Chip glomerulo renale isogenico ingegnerizzato da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Questo manoscritto descrive un protocollo in due fasi per generare podociti specifici del paziente dai fibroblasti dermici attraverso la riprogrammazione episomiale in cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) e la successiva differenziazione in podociti.

Generazione di podociti derivati dal paziente da biopsie cutanee

Qui, presentiamo protocolli che descrivono in dettaglio le istruzioni per l'implementazione di colture cellulari 3D utilizzando matrici di collagene e collagene-agarosio in un sistema microfisiologico. Questi protocolli supportano la co-coltura del tubulo prossimale renale e degli sferoidi del carcinoma a cellule renali, simulando condizioni in vivo e consentendo un'indagine avanzata sulle interazioni tra le cellule tumorali del rene.

Co-coltura microfluidica dell'epitelio renale sano e tumorale per modellare la progressione del cancro del rene

Impara a coltivare escrescenze glomerulari ex vivo da reni di topo per analizzare l'attivazione delle cellule epiteliali parietali. Questo metodo consente di studiare i meccanismi cellulari coinvolti nella formazione di tessuto cicatriziale renale e testare potenziali farmaci.

Escrescenza glomerare come unanalisi di Ex Vivo per analizzare i percorsi coinvolti nellattivazione delle cellule epiteliali Parietali (Video) | JoVE Journal

Escrescenza glomerare come un'analisi di Ex Vivo per analizzare i percorsi coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali Parietali

Esplora altri video