Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse
October 25th, 2019
Qui, presentiamo un protocollo robusto per quantificare 40 composti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule. La miscela di sintesi senza cellule viene derivata con un'anilina per una separazione efficace utilizzando la cromatografia liquida a fase invertita e quindi quantificata dalla spettrometria di massa utilizzando standard interni etichettati isotopicamente.
La sintesi proteica senza cellule è una tecnologia emergente nei sistemi e nella biologia sintetica per la produzione in vitro di proteine. I sistemi di sintesi proteica senza cellule non hanno pareti cellulari, quindi abbiamo accesso diretto ai metaboliti. In questo protocollo, quantifichiamo le misurazioni assolute di 40 metaboliti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia, che ci consente di caratterizzare il metabolismo privo di cellule.
Il protocollo si basa sulla metastasi dei composti con anilina, che consente una migliore separazione e una maggiore risoluzione della spettrometria di massa. Inoltre, utilizziamo standard interni con un isotopico etilichettiamo l'anilina, per la quantificazione assoluta dei metaboliti. I metaboliti taggati coelute, che elimina gli effetti della soppressione del ferro.
Consentendo l'accurata quantificazione dei composti. Lavorando in una cappa, unire 550 microlitri dell'anilina, con 337,5 microlitri di acqua di grado LC-MS. E 112,5 microlitri di 12 acido cloridrico molare in un tubo di centrifuga.
Vortice bene, e conservare la soluzione di anilina molare a pH 4.5 e quattro gradi Celsius. Per preparare una soluzione di anilina a sei molari carbonio-13, a pH 4,5, combinare 250 milligrammi di anilina carbonio-13 con 132 microlitri di acqua e 44 microlitri di 12 acido cloridrico molare. Vortice bene, e memorizzare a quattro gradi Celsius.
Per preparare soluzione EDC da 200 milligrammi per millilitro, sciogliere due milligrammi di EDC in 10 microlitri d'acqua per ogni campione da etichettare. E vortice bene. Per preparare campioni, dissetare e precipitare le proteine in una reazione di sintesi proteica priva di cellule, aggiungendo un volume uguale di etanolo ghiacciato al 100% alla reazione di sintesi priva di cellule.
Centrifugare il campione a 12.000 volte g, per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante del campione in un nuovo tubo di centrifuga. Per etichettare il campione con una soluzione di anilina al carbonio-12, trasferire sei microlitri del campione in un nuovo tubo di centrifuga e portare il volume a 50 microlitri con acqua.
Aggiungere 5 microlitri da 200 milligrammi per millilitro soluzione EDC, mescolare bene la soluzione di anilina carbonio-12 e trasferire 5 microlitri nel tubo. Vortice la reazione con agitazione delicata per due ore a temperatura ambiente. Dopo due ore, rimuovere i tubi dallo shaker e trasferirli in una cappa aspirante.
Aggiungere 1,5 microlitri di trietilammina ad ogni reazione per arrestare la reazione di tagging dell'anilina e stabilizzare i composti. Centrifuga a 13.500 volte g per tre minuti. E salva il supernatante.
Per etichettare gli standard interni con soluzione di anilina carbon-13, diluire la soluzione di stock interno a 80 micromolari con un volume finale di 50 microlitri. Aggiungere cinque microlitri della soluzione EDC da 200 milligrammi per millilitro e cinque microlitri della soluzione di anilina carbon-13 ben miscelata. Vortice la reazione con agitazione delicata per due ore a temperatura ambiente.
Dopo due ore, rimuovere i tubi dallo shaker e aggiungere 1,5 microlitri di trietilammina alla reazione in una cappa aspirante. Centrifuga a 13.500 volte g per tre minuti e salva il supernatante. Per intuire lo standard interno taggato e il campione taggato, mescolare 25 microlitri di ciascuno in una fiala autocampionatore.
E analizzare con la procedura LC-MS. Quindi, per creare una curva standard per i metaboliti non registrati, in primo luogo, diluire la soluzione stock di metaboliti non registrati a diverse concentrazioni, con volume di 50 microlitri. Aggiungere cinque microlitri della soluzione EDC da 200 milligrammi per millilitro e cinque microlitri di soluzione di anilina carbonio-12 ad ogni concentrazione.
Vortice la reazione con agitazione delicata per due ore a temperatura ambiente. E procedere con il trattamento con trietilammina. E centrifugazione prima di analizzare da parte dell'LC-MS come in precedenza.
Dopo aver inizializzato LC-MS, secondo le istruzioni del produttore, iniettare cinque microlitri del campione nella colonna. E acquisire le intensità di ioni m su z appropriate per il campione etichettato di anilina carbonio-12. Quindi, iniettare di nuovo cinque microlitri dello stesso campione.
E acquisire le intensità ionici m over z per gli standard etichettati carbonio-13 anilina. In questo protocollo sono stati quantificati metaboliti che esprimono proteine fluorescenti verdi in una sintesi proteica priva di cellule a base di E.coli. 40 metaboliti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia sono stati individuati e quantificati secondo norme interne.
Mentre è stata sviluppata anche una curva standard per cinque dei metaboliti che non sono stati taggati con anilina. I diversi metaboliti coinvolti in queste vie erano una classe di zuccheri fosforilati, acidi fosfo-carbossilici, acidi carbossilici, nucleotidi e co-fattori. Inoltre, il metodo ha permesso la separazione di coppie di isomero strutturali, come il glucosio-sei fosfato e il fruttosio-sei fosfato in una singola corsa LC-MS.
Il passo più importante è etichettare il campione de-proteinizzato con anilina. Poiché la soluzione anilina si separa, è importante lavorare in modo rapido ed efficace, mantenendo al contempo buone pratiche di sicurezza. Questo metodo aiuta a caratterizzare il metabolismo senza cellule con la quantificazione di 40 metaboliti.
Ma, altri composti sono nella miscela priva di cellule, come gli amminoacidi che possono essere quantificati. Ciò aiuterebbe a fornire uno sguardo più completo sul metabolismo privo di cellule. Questo metodo ha rivelato che i sistemi senza cellule hanno metabolismi complessi, ancora in funzione che possono essere potenzialmente sfruttati per una migliore efficienza energetica e una resa di carbonio.
Il protocollo si basa sull'etichettatura dei composti con anilina con l'uso di EDC come catalizzatore. Entrambi questi reagenti sono pericolosi e devono essere utilizzati con cautela.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per quantificare 40 metaboliti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia durante la sintesi proteica in assenza di cellule. Utilizzando l'anilina per la derivatizzazione, il protocollo migliora la separazione nella cromatografia liquida a fase inversa e utilizza la spettrometria di massa per una quantificazione accurata.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Sintesi proteica in assenza di cellule
- Metabolomica
- Spettrometria di massa
Sfondo
- La sintesi proteica in assenza di cellule permette l'accesso diretto ai metaboliti.
- Comprendere il metabolismo centrale del carbonio e dell'energia è cruciale per caratterizzare i sistemi in assenza di cellule.
- La derivatizzazione con anilina migliora la separazione e la risoluzione nell'analisi.
- Gli standard interni marcati isotopicamente facilitano la quantificazione assoluta.
Scopo dello studio
- Quantificare i metaboliti coinvolti nel metabolismo centrale del carbonio e dell'energia.
- Migliorare la comprensione dei processi metabolici in assenza di cellule.
- Fornire un protocollo robusto per i ricercatori in biologia sintetica.
Metodi utilizzati
- Derivatizzazione dei metaboliti con anilina.
- Cromatografia liquida a fase inversa per la separazione.
- Spettrometria di massa per la quantificazione utilizzando standard marcati isotopicamente.
- Coelusione dei metaboliti marcati per minimizzare gli effetti di soppressione degli ioni.
Principali risultati
- Quantificazione con successo di 40 metaboliti.
- Miglioramento della separazione e della risoluzione nella spettrometria di massa.
- Eliminazione efficace degli effetti di soppressione degli ioni attraverso la coelusione.
- Stabilimento di un protocollo affidabile per studi futuri.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo completo per la quantificazione dei metaboliti.
- Migliora la comprensione dei percorsi metabolici nei sistemi in assenza di cellule.
- Le applicazioni future possono estendersi a vari progetti di biologia sintetica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of central carbon and energy metabolites in cell-free protein synthesis enables predictive assessment of system performance, yield, and energy efficiency. This capability supports mechanistic de-risking of cell-free platforms for just-in-time biologics manufacturing by identifying metabolic bottlenecks and cofactor limitations. The method provides translational biomarker-like metabolic readouts that inform go/no-go decisions in early discovery and preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking metabolite flux to protein synthesis output in cell-free systems.
- Operational Value: Provides quantitative metabolic profiling to de-risk target validation through pathway clarification and functional assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, reproducible quantification of 40 metabolites to support assay readiness for cell-free-based screening platforms.
- Operational Value: Facilitates high-throughput compatible LC/MS workflows with 10-minute runs, enabling scalable metabolite screening across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by characterizing metabolic continuity from discovery through preclinical validation.
- Operational Value: Generates predictive confidence in lead identification by linking metabolic efficiency to protein yield and productivity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing metabolic flux data that informs target selection and pathway optimization prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through absolute quantification of glycolysis, TCA cycle, and pentose phosphate pathway intermediates.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility via internal standard normalization and coelution-based ion suppression elimination.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (metabolite concentrations over 2-3 orders of magnitude) that allow cross-condition comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by establishing metabolic benchmarks for energy efficiency and carbon yield in cell-free systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable LC/MS-based metabolomics platform for repeated characterization of cell-free conditions across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in cell-free system performance through comprehensive metabolic mapping and reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via internal standard correction and rapid 10-minute chromatographic runs.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying metabolic constraints early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable energy metabolism and cofactor regeneration metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in metabolite derivatization, LC/MS operation, and hazardous reagent handling (aniline, EDC, HCl).
- Dependence on reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry infrastructure with electrospray ionization capability.
- Necessitates cross-team standardization of sample quenching, protein precipitation, and derivatization timing to ensure coelution and quantification accuracy.
- Adaptation considerations include extending the method to amino acids and other non-central carbon metabolites present in cell-free mixtures.
- Practical limitations include the need for careful pH control during derivatization and potential interference from complex sample matrices despite ion suppression mitigation.
