Name: Generazione di organoidi testicolari porcini con Architettura Specifica Testis utilizzando Microwell Culture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Scopri la generazione di organoidi testicolari porcini con architettura specifica testis utilizzando microwell culture. Questo metodo riproducibile consente di studiare la morfogenesi testicolare e screening farmacologici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da NIH/NICHD HD091068-01 alla dott.ssa Ina Dobrinski.

NOTA: I testicoli dei suinetti di 1 settimana sono stati ottenuti da un allevamento di suini commerciali come sottoprodotto della castrazione di suini commerciali. L'approvvigionamento di testicoli è stato approvato dall'Animal Care Committee dell'Università di Calgary.
1. Preparazione di soluzioni enzimatiche per la digestione tissutale
NOTA: sono necessarie tre diverse soluzioni ezimatiche, che includono due diverse soluzioni collagenase IV (soluzione A, B) e una soluzione deoxyribonuclease I (DNase I).
<ol><li>Per preparare la soluzione A, sciogliere 20 mg di collagenase IV S (Tabella dei materiali) e 40 mg di collagene IV W ( Tabella deimateriali) in 25 mL di alto glucosio Melo di Aquila modificato (DMEM). Quindi filtrare sterilizzare con un filtro 0,22 m. Aggiungere 0,4 mL di siero bovino fetale (FBS) alla soluzione A per inibire l'attività della trypsin.</li>
	<li>Per preparare la soluzione B, sciogliere 80 mg di collagenae IV W (Tabella dei materiali) in 40 mL di DMEM. Quindi filtrare sterilizzare con un filtro 0,22 m.</li>
	<li>Per preparare la soluzione DNase I (7 mg/mL), sciogliere 70 mg di DNase I in 10 mL di DMEM. Quindi filtrare sterilizzare con un filtro 0,22 m. NOTA: La concentrazione di enzimi per le soluzioni di collagenasi IV qui descritte varia dalle concentrazioni (2 mg/mL) indicate nell'articolo originale14. Il protocollo attuale produce cellule con una redditività leggermente superiore. Tuttavia, le cellule isolate da entrambi i protocolli producono organoidi con un'architettura tissutale identica.</li>
</ol>2. Testè digestione enzimatica dei tessuti
<ol><li>Raccogliere i testicoli in un becher sterile e lavare con salina tamponata da fosfato (PBS) contenente l'1% di penicillina/streptomicina (P/S). Dopo il lavaggio, trasferire i testicoli in un piatto di coltura tissutale di 100 mm con PBS contenente 1% P/S e rimuovere il tunicalis e l'epididymis utilizzando forbici autoclaved e pinze. Trasferire i testicoli isolati in un nuovo piatto da 100 mm e lavare accuratamente con PBS contenente 1% P/S.</li>
	<li>Per mantenere la sterilità, utilizzare un altro set di forbici sterili e pinze per sbucciare il parenchyma testicolare dalla tunica albuginea. Tagliare i testicoli lungo l'asse longitudinale direttamente sotto il tunica. Quindi sbucciare i testicoli dal tunica con due pinze e metterle in un nuovo piatto da 100 mm contenente 1 mL DMEM con 1% P/S.</li>
	<li>Tritate i testicoli sbucciati con forbici sterili in pezzi di tessuto da 1-2 mm. Dopo il taglio, utilizzare pinze sterili per rimuovere frammenti bianchi di tessuto connettivo.</li>
	<li>Trasferire i pezzi di tessuto macinato nella soluzione A e rifornirla fino a 50 mL con DMEM per ottenere una concentrazione di 0,4 mg/mL per la collagenae IV S (Tabella dei materiali) e una concentrazione di 0,8 mg/mL per collagenase IV W ( Tabella deimateriali). Mettere la soluzione A contenente i pezzi di tessuto in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 30 min, invertire delicatamente i tubi ogni 5 min e controllare visivamente il rilascio del DNA.<ol>
<li>Aggiungete 500 l di DNase I se si osserva il DNA galleggiante libero. Dopo 30 min, centrifugare il tubo a 90 x g con freni a 25 gradi centigradi per 1,5 min e scartare il supernatante. NOTA: il DNA apparirebbe come sostanza torbida. Quando i tubi vengono scossi, i pezzi di tessuto si depositano mentre il DNA rimane a galla.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere la soluzione B al tubo e ricaricare fino a 50 mL con DMEM per ottenere una concentrazione di 1,2 mg/mL di collagenae IV W (Tabella dei materiali). Mettete il tubo a 37 gradi centigradi per 30 min e invertete delicatamente il tubo ogni 5 min.</li>
	<li>Dopo 30 min, centrifugare il tubo a 90 x g con freni a 25 gradi centigradi per 1,5 min. Dopo di che scartare il supernatante e lavare una volta con PBS con 1% P/S. NOTA: i supernatanti scartati delle soluzioni A e B conterranno principalmente cellule interstiziali.</li>
	<li>Ricaricare il tubo con PBS fino a 50 mL. Raccogliere con cura i tubuli dall'alto e metterli in un nuovo tubo da 50 mL. NOTA: I grandi frammenti di tessuto non digerito si depositano rapidamente nella parte inferiore, mentre i tubuli seminiferi digeriti rimarranno in sospensione. Non devono essere raccolti grandi frammenti di tessuto. Questa procedura può essere ripetuta più volte fino a quando la soluzione nel tubo originale è quasi chiara e rimangono solo frammenti di tessuto non digerito, che possono essere smaltiti.</li>
	<li>Centrifugare i tubuli a 90 x g con freni a 25 gradi centigradi per 1,5 min e scartare il supernatante. Aggiungere nuovamente pbS e centrifugare freschi. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio PBS, rimuovere il supernatante e risospendere i tubuli seminiferi in 5 mL di PBS. Quindi aggiungere 15 mL di 0.25% trypsin-etilelenediaminetraacetic acid (EDTA) ai tubuli. Collocare il tubo a 37 gradi centigradi e invertire delicatamente ogni 2 min. Se si osserva molto DNA galleggiante, aggiungere 500 L di DNase I con 5 mL di DMEM.</li>
	<li>Valutare la digestione enzimatica dei tubuli in singole cellule al microscopio (prima dopo 5 min, poi ogni 2 min). Se è possibile rilevare per lo più cellule singole, interrompere la reazione con 5 mL di FBS e filtrare attraverso una rete da 70 m e quindi attraverso una rete da 40 m. NOTA: Occorre prestare attenzione affinché i tappi sui tubi da 50 mL utilizzati per le digestione (Soluzione A, B e 0,25% trypsin-EDTA) siano serrati correttamente. Se la contaminazione nel bagno d'acqua è una preoccupazione, pellicola di paraffina può essere avvolto intorno al tappo per garantire la sterilità.</li>
	<li>Centrifugare le singole celle a 500 x g con freni a 25 s per 5 min, rimettere in rinversione nel mezzo di arricchimento (Dulbecco Modified Eagle Medium F/12 (DMEM/F12) contenente il 5% Di FBS e 1% P/S) e contare il numero di cellule vitali. Questa è la popolazione cellulare iniziale. Fissare 100 x 103 cellule ed eseguire l'immunocitochimica per il marcatore delle cellule germinali UCHL1 (Ubiquitina C-Terminal Hydrolase L1) come descritto12 e determinare la percentuale di cellule germinali in questa popolazione cellulare iniziale. NOTA: Il marcatore a cellule germinali Promielocitica di tono di zinco (PL-F)15 potrebbe anche essere utilizzato come alternativa adatta per UCHL1. Nella popolazione cellulare iniziale, la resa cellulare prevista è di circa 700-800 x 109/ g di tessuto. La percentuale di cellule germinali in questa popolazione cellulare dovrebbe essere del 4-5%.</li>
	<li>Collocare circa 20 x 106 di questa popolazione cellulare iniziale in due parabole Petri da 100 mm ultra basse (10 x 106 celle sospese in 10 mL di DMEM/F12 contenenti 1% di P/S in ogni piatto) per 2 giorni in un'incubatrice di coltura dei tessuti (37 , 5% CO2, 21% ossigeno). Eseguire l'arricchimento delle cellule germinali con le cellule rimanenti. NOTA: Per garantire una vitalità ottimale e la qualità cellulare, mentre avviene l'arricchimento delle cellule germinali e la successiva quantificazione, la popolazione cellulare iniziale viene collocata in coltura in piatti di coltura dei tessuti a bassissima attaccamento per 2 giorni.</li>
</ol>3. Arricchimento delle cellule germinali
NOTA: La procedura descritta sopra produce principalmente cellule Sertoli e cellule germinali. Diverse proprietà di adesione consentono la separazione delle cellule di Sertoli e delle cellule germinali attraverso la placcatura differenziale.
<ol><li>Seme 20-25 x 106 cellule della popolazione cellulare iniziale per 100 mm piatto di coltura dei tessuti in un volume totale di 8 mL di mezzo di arricchimento (DMEM/F12 con 5% FBS e 1% P/S) per placcatura differenziale. Posizionare le cellule in un'incubatrice (37 gradi centigradi, 5% CO2, 21% O2) e dopo 1,5 h, assicurarsi che la maggior parte delle cellule Sertoli si attacchi alla piastra.</li>
	<li>Raccogliere e combinare il supernatante (contenente principalmente cellule germinali) di 2 piastre a una nuova piastra da 100 mm e rimetterla nell'incubatrice. Dopo 1 h, ancora una volta combinare il supernatante di 2 piastre ad una nuova piastra da 100 mm. Rimettere le piastre nell'incubatrice per una notte. NOTA: i supernatanti combinati conterranno principalmente cellule germinali. Le cellule aderte che vengono scartate insieme alle piastre sono principalmente cellule somatiche testicolari come Sertoli e le cellule mioidi peritolare.</li>
	<li>Raccogliere le cellule germinali arricchite in due frazioni come segue. NOTA: Le cellule germinali arricchite aderiscono in modo diverso, frazione non aderente e frazione leggermente aderita. Entrambe queste frazioni insieme formano la popolazione di cellule germinali arricchite<ol>
<li>Frazione non aderente: raccogliere il super-natante.</li>
		<li>Frazione leggermente aderente: lavare delicatamente le piastre con PBS, trattare con 2 mL di 1:20 di diluizione dello 0,25% trypsin-EDTA per 5 minuti a temperatura ambiente, fermare la reazione con 2 mL di mezzo di arricchimento e raccogliere nello stesso tubo come frazione non aderente. NOTA: 0.25% Trypsin-EDTA deve essere diluito con PBS per produrre una soluzione 1:20 trypsin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contare il numero totale di cellule utilizzando un contatore cellulare, fissare 100 x 103 cellule ed eseguire l'immunocitochimica per marcatore di cellule germinali UCHL1 come descritto12 e determinare la percentuale di cellule germinali in questa popolazione cellulare arricchita. NOTA: La percentuale di cellule germinali in questa popolazione cellulare deve essere almeno 60-70%. Poiché l'immunocitochimica per la quantificazione richiederebbe 1 giorno, le cellule arricchite devono essere collocate in un attacco ultra basso 100 mm piatto Petri con DMEM/F12 integrato con 1% P/S per la durata per garantire la qualità cellulare ottimale e la vitalità.</li>
</ol>4. Preparazione delle cellule per la semina
<ol><li>Per raccogliere la preparazione cellulare di partenza, raccogliere il supernatante in un tubo da 50 mL dai piatti allegato ultra basso 100 mm. Lavare le piastre vigorosamente con PBS per raccogliere le cellule aderenti. Non è necessaria alcuna digestione ezimatica. NOTA: Alcune delle cellule testicolari, principalmente le cellule Sertoli, possono aderire leggermente alle piastre di attacco ultra basse.</li>
	<li>Combinare la preparazione cellulare iniziale e le cellule germinali arricchite per ottenere una preparazione delle cellule di lavoro contenente il 25% di cellule germinali. Centrifuga a 500 x g con freni a 25 s per 5 min, scartare il supernatante e risospendere nuovamente le cellule in mezzo di formazione organoide (DMEM/F12 integrato con insulina 10 g/mL, transferrin 5,5 g/mL, selenio 6,7 ng/mL, 20 ng/mL del fattore di crescita epiderle , 1% P/S). Regolare la densità della cella a 2,4 x 106 per mL. NOTA: Ogni pozzo nelle piastre di microwell utilizzato13 in questo protocollo conteneva 1.200 micropozzi.</li>
	<li>Utilizzare la formula seguente per calcolare il numero di celle per così come descritto di seguito. Numero di cellule per pozzo: numero di micropozzi x numero di cellule da raggruppare per ogni organoide.</li>
	<li>Per generare organoidi da 1.000 cellule ciascuna, siede ciascuna con (1.200 x 1.000 cellule ciascuna) 1,2 x 106 cellule. Regolare la densità delle celle nella sospensione cellulare in modo che le cellule vengano semiate in un volume di 0,5 mL di mezzo. Per gli organoidi formati da 1.000 cellule ciascuna, utilizzare una densità di 2,4 x 106 cellule per mL (1,2 x 106 cellule in 0,5 mL).</li>
</ol>5. Preparazione di micropozzi per la ricezione delle cellule
NOTA: Per garantire che le cellule non aderiscano alla superficie del microwell, trattare con una soluzione di risciacquo surfactant disponibile per l'acquisto da parte del produttore.
<ol><li>Aggiungere 0,5 mL di soluzione di risciacquo ad ogni pozzo. Assicurarsi che nessuna d'aria sia intrappolata nel pozzo. Per rimuovere le bolle d'aria, se presenti, centrificare la piastra a 2.000 x g con freni a 25 gradi centigradi per 2 min.</li>
	<li>Osservare la piastra al microscopio invertito a basso ingrandimento, per verificare che le bolle siano state rimosse dai micropozzi. Se si osservano bolle intrappolate, centrificare di nuovo a 2.000 x g con freni a 25 gradi centigradi per 2 minuti per rimuovere eventuali bolle rimanenti.</li>
	<li>Coprire la piastra con il coperchio e incubare per 30 min a temperatura ambiente. Al termine del trattamento, rimuovere la soluzione di risciacquo e lavare immediatamente la piastra con acqua sterile o PBS. Assicurarsi che la piastra non si asciughi dopo il trattamento con la soluzione di risciacquo.</li>
</ol>6. Generazione di organoidi testicolici
<ol><li>Aggiungere 0,5 mL di mezzo di formazione organoide (senza cellule) ad ogni pozzo e centrifugare a 2.000 x g con freni a 25 s per 2 min per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate. Osservare il pozzo al microscopio invertito a basso ingrandimento per verificare che le bolle d'aria siano state rimosse. Se si osservano bolle intrappolate, centrificare di nuovo a 2.000 x g con freni a 25 gradi centigradi per 2 minuti per rimuovere eventuali bolle rimanenti.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL della sospensione della cella di lavoro e mescolare delicatamente pipetting su e giù. Centrifuga a 500 x g con freni a 25 gradi centigradi per 5 min. Utilizzare un microscopio invertito per verificare che le cellule si siano raggruppate all'interno dei micropozzi.</li>
	<li>Trasferire la piastra in un incubatore di coltura cellulare e coltura per 5 giorni. Cambiare metà del mezzo ogni altro giorno.<ol>
<li>Per cambiare il mezzo senza perdere gli organoidi, toccare la punta della pipetta alla parete del pozzo e abbassare dolcemente per toccare il menisco e disegnare lentamente il mezzo. Assicurati di seguire il menisco mentre scende. Per aggiungere il mezzo fresco, toccare la punta della pipetta alla parete del pozzo sullo stesso lato del prelievo medio e aggiungere il mezzo fresco delicatamente contro la parete del pozzo, permettendogli di scorrere lentamente lungo la parete.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per recuperare gli organoidi, pipettare delicatamente il mezzo su e giù con un'ampia pipetta bocca. Questo permetterebbe agli organoidi di uscire dai micropozzi.</li>
	<li>Raccogliere gli organoidi, lavare con PBS, fissare ed eseguire l'immunocitochimica per marcatore di cellule germinali (UCH-L1), sertoli marcatore di cellule (GATA Binding Protein 4-GATA4), marcatore di cellule mioide peritubare (z-Smooth Muscle Actin-SMA) e marcatore di cellule Leydig (Cytochrome P450-CYP450) come descritto12 e visualizzare al microscopio confocale.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li>
<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li>
<li>Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+testicular+organoid%3A+a+novel+tool+for+the+study+of+human+spermatogenesis+and+gonadotoxicity+in+vitrodagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).</li>
<li>Strange, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+testicular+organoid+system+as+a+novel+tool+to+study+Zika+virus+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis.</a> Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).</li>
<li>Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+organoid+generation+by+a+novel+in+vitro+three-layer+gradient+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system.</a> Biomaterials. 130, 76-89 (2017).</li>
<li>Baert, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Testicular+Cells+Self-Organize+into+Organoids+with+Testicular+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).</li>
<li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. , (2019).</li>
<li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Large+Numbers+of+Size-controlled+Tumor+Spheroids+Using+Microwell+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), 50665(2013).</li>
<li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).</li>
<li>González, R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+Mouse+Monopoly%3A+Studying+the+Male+Germ+Line+in+Domestic+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models.</a> ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).</li>
<li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li>
<li>Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Gdnf+Gene+in+peritubular+myoid+cells+disrupts+undifferentiated+spermatogonial+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).</li>
</ol>

Dr. Ungrin ha un interesse finanziario nella tecnologia AggreWell come inventore.

Abbiamo stabilito un metodo semplice che permette la generazione coerente e ripetibile di un gran numero di organoidi testicolari con architettura tissutale che è simile a testis in vivo12. Mentre l'approccio è stato sviluppato utilizzando cellule testis porcine, è più ampiamente applicabile anche al topo, al primate non umano e al testicolo umano12. Un certo numero di metodi diversi sono stati segnalati per la produzione di organoidi testicolari8<su...

Negli ultimi anni, c'è stata una rinascita di interesse per gli organoidi tridimensionali (3D). Diversi organi come intestino1, stomaco2, pancreas3,4, fegato5, e cervello6 sono stati derivati con successo in sistemi organoidi 3D. Questi organoidi hanno somiglianze architettoniche e funzionali con gli organi in vivo e sono più biologicamente rilevanti per lo studio del microambiente tissutale rispetto ai sistemi di coltura monostrato7. Di conseguenza, gli organoidi testicolari hanno iniziato a raccogliere interesse anche8,9,10,11,12. La maggior parte dei metodi riportati finora sono complessi, non-alto throughput10 e richiedono l'aggiunta di proteine ECM8,10. Questa complessità porta anche a problemi di riproducibilità. È necessario un metodo semplice e riproducibile che consenta la generazione di organoidi testicolari con associazioni cellulari che sono come testis in vivo.
Recentemente abbiamo segnalato un sistema per soddisfare questi requisiti12. Utilizzando il maiale come modello, abbiamo impiegato un approccio di aggregazione forzata centrifuga nel sistema del microwell. Nel sistema di microwell, ogni pozzo contiene un gran numero di micropozzi più piccoli identici13. Questo permette la generazione di numerosi sferoidi di dimensioni uniformi. Il sistema di microwell ha permesso la generazione di un gran numero di organoidi uniformi con un'architettura specifica per i testicoli. Il sistema è semplice e non richiede l'aggiunta di proteine ECM.

<table><tbody><tr><td>Piastra per coltura tissutale a bassissimo attacco da 100 mm</td><td>Corning</td><td>#CLS3262</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale da 100 mm</td><td>Corning</td><td>#353803</td><td></td></tr><tr><td>Aggrwell 400</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#34411</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di risciacquo antiaderente</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo IV da Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5138</td><td>nota come Collagenasi IV S</td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo IV Worthington</td><td>Worthington-Biochem</td><td>#LS004189</td><td>nota come Collagenasi IV W</td></tr><tr><td>Deossiribonucleasi I dal pancreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium/F12</td><td>Gibco</td><td>#11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Glucosio medio - alto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D6429</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich#D8537</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fattore di crescita epidermico</td><td>R& D Systems</td><td>#236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per celle Falcon 70 &micro; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>Filtri cellulari per falco 40 &micro; m</td><td>FisherScientific</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-transferrina-selenio</td><td>Gibco</td><td>#41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4333</td><td></td></tr><tr><td>Tessuto testicolare suino</td><td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Unità di filtraggio superiore sterile per provette da centrifuga</td><td>Millipore</td><td>#SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>#T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di organoidi testicolari porcini con architettura specifica testis utilizzando microwell culture

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

Gli organiidi sono strutture tridimensionali composte da più tipi di cellule che sono in grado di ricapitolare l'architettura del tessuto e le funzioni degli organi in vivo. La formazione di organoidi ha aperto diverse vie di ricerca di base e traslazionale. Negli ultimi anni, gli organoidi testicolari hanno suscitato interesse nel campo della biologia riproduttiva maschile. Gli organoidi testicolari consentono lo studio delle interazioni cellula-cellula, dello sviluppo dei tessuti e del microambiente di nicchia delle cellule germinali e facilitano lo screening dei farmaci e della tossicità ad alto consumo. È necessario un metodo per generare in modo affidabile e riproducibile organoidi testicolari con architettura tissutale specifica di testicoli. Il sistema di coltura dei micropozzi contiene una vasta gamma di micropozzi a forma di piramide. Le cellule testicolari derivate da testicoli pre-puberali sono centrizzate in questi micropozzi e coltivate per generare organoidi testicolari con architetture tissutali specifiche per testicoli e associazioni cellulari. Migliaia di organoidi omogenei possono essere generati attraverso questo processo. Il protocollo qui riportato sarà di ampio interesse per i ricercatori che studiano la riproduzione maschile.

Celle isolate da testicoli porcini di 1 settimana che sono stati coltivati nei micropozzi auto-organizzati in sferoidi (Figura 1A, Figura 2), con esterno delineato e distinto (epitelio seminiferous) e compartimenti interni ( interstizio) (Figura 1B, Figura 2). I due compartimenti sono stati separati da una membranaseminterrato...

Qui, presentiamo un protocollo per la generazione riproducibile di organoidi testicolari porcini con testicoli specifici architettura tissutale utilizzando il sistema di coltura microwell disponibile in commercio.

Generazione di organoidi testicolari porcini con Architettura Specifica Testis utilizzando Microwell Culture

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

Questo protocollo è significativo perché consente la generazione di organoidi testicolari, che possono essere utilizzati come piattaforma per lo studio della morfogenesi dei testicoli e per gli screening di farmaci e tossicità ad alto tropo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è altamente riproducibile, richiede un numero relativamente basso di cellule e può essere utilizzato per generare un gran numero di organoidi testicolari con architettura specifica del testicolo. Questo metodo può essere applicato per studiare altri sistemi, come le cellule staminali pluripotenti o le cellule isolotti pancreatiche con le ottimizzazioni necessarie.A dimostrare la procedura di digestione enzimatica del tessuto testicolare sarà Anna Voigt, dottoranda del mio laboratorio. Raccogliere il testicolo in un becher sterile e lavare con PBS contenente 1%di streptomicina penicillina. Dopo il lavaggio trasferire il testicolo in un piatto di coltura tissutale da 100 millimetri con PBS contenente 1%di streptomicina penicillina.Usa forbici e forcep autoclavati per rimuovere la tunica vaginale e l'epididimo. Trasferire il testicolo isolato su un nuovo piatto da 100 millimetri e lavare accuratamente con PBS contenente streptomicina all'1%penicillina. Tagliare il testicolo lungo l'asse longitudinale direttamente sotto la tunica.Quindi sbucciare il testicolo dalla tunica usando due forcep e posizionare in un nuovo piatto da 100 millimetri contenente 1 millilitro di DMEM con streptomicina all'1%penicillina. Tritare il testicolo sbucciato con forbici sterili in pezzi di tessuto da uno a due millimetri. Dopo il taglio utilizzare forcep sterili per rimuovere i frammenti bianchi del tessuto connettivo.Trasferire i pezzi di tessuto tritato nella soluzione A in un tubo da 50 millilitri e completarlo fino a 50 millilitri con DMEM per ottenere una concentrazione di 0,4 milligrammi per millilitro per colagenasi 4S e una concentrazione di 0,8 milligrammi per millilitro per colagenasi 4W. Posizionare il tubo contenente i pezzi di tessuto in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 30 minuti. Invertire delicatamente il tubo ogni cinque minuti.Dopo 30 minuti, centrifugare il tubo a 90 volte G con pause a 25 gradi Celsius per 1,5 minuti. Scartare il supernatante, ad 40 millilitri della soluzione B, e ricaricare fino a 50 millilitri con DMEM per ottenere una concentrazione di 1,2 milligrammi per millilitro di colagenasi 4W. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 30 minuti e invertire delicatamente il tubo ogni cinque minuti.Centrifugare il tubo a 90 volte G con pause a 25 gradi Celsius per 1,5 minuti. Successivamente scartare il supernatante e lavare una volta con PBS con 1%penicillina streptomicina. Raccogliere con cura i tubuli dall'alto e posizionarli in un nuovo tubo da 50 millilitri.Ricaricare il tubo con PBS fino a 50 millilitri. Centrifuga i tubuli a 90 volte G con pause a 25 gradi Celsius per 1,5 minuti. Scartare il supernatante e aggiungere PBS fresco per lavare altre due volte.Dopo l'ultimo lavaggio PBS rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo i tubuli seminiferi in cinque millilitri di PBS. Quindi, aggiungere 15 millilitri dello 0,25% di EDTA di tripina ai tubuli. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius e invertire delicatamente ogni due minuti.Dopo cinque minuti valutare la digestione enzimatica dei tubuli su singole cellule al microscopio con 10 microlitri di campione su una piastra di coltura tissutale. Ogni due minuti posizionare il campione al microscopio per osservare. Se si possono rilevare per lo più singole cellule, interrompere la reazione con cinque millilitri di FBS e filtrare attraverso una rete da 70 micron e quindi attraverso una rete da 40 micron.Centrifugare le singole cellule a 500 volte G con pause a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Sospendere di nuovo in 50 millilitri di mezzo di arricchimento e contare il numero di cellule vitali utilizzando un emocitometro. Trasferire 20 milioni di questa popolazione di cellule di partenza in ciascuna delle due piastre di Petri ultra-basse di attacco da 100 millimetri e incubare in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius, 5% anidride carbonica e 21% ossigeno per due giorni.Cedere da 20 a 25 milioni di cellule della rimanente popolazione cellulare iniziale per piatto di coltura tissutale di 100 millimetri in un volume totale di otto millilitri di mezzo di arricchimento. Posizionare il piatto in un'incubatrice e dopo 1,5 ore assicurarsi che la maggior parte delle cellule sertoli siano attaccate alla piastra. Inclina leggermente due piastre per raccogliere e combinare i supernatanti in una nuova piastra da 100 millimetri e riposizionare di nuovo nell'incubatrice.Dopo un'ora, unire nuovamente i supernatanti di due piastre a una nuova piastra da 100 millimetri. Riposizionare le piastre nell'incubatrice durante la notte. Quindi raccogliere le cellule germinali arricchite in due frazioni, frazione non aderente e frazione leggermente aderente.Raccogliere il supernatante come frazione non aderente. Per la frazione leggermente aderente lavare delicatamente le piastre con PBS e trattare con due millilitri di una diluizione da uno a 20 dello 0,25%Trypsin EDTA per cinque minuti a temperatura ambiente. Interrompere la reazione aggiungendo due millilitri di mezzo di arricchimento e raccogliere nel tubo di frazione non aderente.Unire la preparazione della cellula iniziale e le cellule germinali arricchite in un tubo per ottenere una preparazione cellulare funzionante contenente il 25% di cellule germinali. Centrifuga a 500 volte G con pause a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 20 millilitri di mezzo di formazione organoide per raggiungere una concentrazione di 2,4 milioni di cellule per millilitro.In un nuovo tubo aggiungere un millilitro della soluzione contenente celle. Aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di risciacquo tensioattiva ad ogni pozzo in una micro piastra di pozzo. Assicurarsi che nessuna bolla d'aria sia intrappolata nel pozzo.Per rimuovere le bolle d'aria centrifugare la piastra a 2.000 volte G con rotture a 25 gradi Celsius per due minuti. Osservare la piastra al microscopio invertito a basso ingrandimento per verificare che le bolle siano state rimosse dai micro pozzi. Coprire la piastra con un coperchio e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Una volta completato il trattamento rimuovere la soluzione di risciacquo e lavare immediatamente la piastra con acqua sterile o PBS. Aggiungere 0,5 millilitri di mezzo di formazione organoide ad ogni pozzo e centrifugare a 2.000 volte G con rotture a 25 gradi Celsius per due minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate. Osservare il pozzo al microscopio invertito a basso ingrandimento per verificare che le bolle d'aria siano state rimosse.Aggiungere 0,5 millilitri della sospensione della cella di lavoro e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Centrifuga a 500 volte G con pause a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzare un microscopio invertito per verificare che le cellule si siano raggruppate all'interno dei micro pozzi.Trasferire la piastra in un incubatore di coltura cellulare e coltura per cinque giorni. Cambia metà del mezzo a giorni nostri. Per recuperare gli organoidi utilizzare una pipetta a bocca larga per pipettare delicatamente il mezzo su e giù.Ciò consente agli organoidi di uscire dai micro pozzi. Raccogliere gli organoidi, fissare ed eseguire l'immuno citochimica per marcatore di cellule germinali, marcatore cellulare Sertoli, marcatore di cellule mioidi peritubulari e marcatore cellulare Leydig e visualizzare al microscopio confocale. In questo studio cellule isolate da testiti suini di una settimana che sono state coltivate in micro pozzi auto-organizzati in sferoidi con compartimenti esterni e interni delineati e distinti.I due compartimenti erano separati da una membrana basale positiva al collagene IV. Le cellule Sertoli positive GATA4 e le cellule germinali positive UCHL1 si trovavano nel compartimento esterno della membrana basale. Le cellule mioidi peri-tubolari positive dell'aSMA sono state localizzate lungo l'interno della membrana basale mentre le cellule leydig positive cyp450 erano al centro dell'interstizio.Questa struttura è simile alle condizioni in situ, dove le cellule di Leydig, cellule mioidi peri-tubolari, si trovano nell'interstizio, nel compartimento interstiziale e nelle cellule germinali, le cellule di Sertoli si trovano nell'epitelio seminifero. È importante garantire che le cellule utilizzate per generare organoidi abbiano una qualità ottimale. Un'attenta attenzione deve essere prestata durante la fase di tripsininazione della digestione enzimatica.Seguendo questa procedura gli organoidi possono essere coltivati a lungo termine per studiare la differenziazione germinale-cellula o analizzare per l'espressione genica e proteine o ormoni secreti. La capacità di creare organoidi con associazioni cellulari specifiche del testicolo fornisce un nuovo sistema in vitro per studiare le interazioni cellula-cellula importanti per lo sviluppo del testicolo e la funzione delle cellule germinali.

generation-porcine-testicular-organoids-with-testis-specific

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Mostriamo un metodo per la necropsia e la dissezione dei modelli di cancro alla prostata del topo, concentrandosi sulla dissezione del tumore alla prostata. Viene inoltre presentato un protocollo passo-passo per la generazione di organoidi tumorali della prostata del topo.

Generazione di organidi tumorali da modelli murini geneticamente ingegnerizzati del cancro alla prostata

La ghiandola mammaria è una struttura bistrato, che comprende cellule epiteliali mitraeliliali ed interne interne. Presentato è un protocollo per preparare gli organoidi utilizzando la prova differenziale. Questo metodo efficiente consente ai ricercatori di manipolare separatamente questi due tipi di cellule per esplorare le domande riguardanti i loro ruoli nella forma e nella funzione della ghiandola mammaria.

Generazione di organoidi mammari mosaici per provepsinizzazione differenziale

Qui vengono descritti quattro metodi per generare organoidi testicolari da cellule testicolari murine neonatale primarie, cioè matrice extracellulare (ECM) e ambienti di coltura 2D e 3D senza ECM. Queste tecniche hanno molteplici applicazioni di ricerca e sono particolarmente utili per studiare lo sviluppo testicolare e la fisiologia in vitro.

Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

Questo documento presenta un protocollo di fabbricazione per un nuovo tipo di substrato di coltura con centinaia di microcontenitori per mm2, in cui gli organoidi possono essere coltivati e osservati utilizzando la microscopia ad alta risoluzione. Anche i protocolli di semina cellulare e immunocolorazione sono dettagliati.

Una piattaforma ad alto rendimento per la coltura e l'imaging 3D di organoidi

Qui, descriviamo un protocollo per la coltura di organoidi intestinali 3D di maiale da cripte epiteliali crioconservate. Descriviamo anche un metodo per stabilire monostrati cellulari derivati da organoidi 3D, consentendo l'accesso al lato apicale delle cellule epiteliali.

Coltura di organoidi intestinali 3D di maialino da cripte epiteliali crioconservate e creazione di monostrati cellulari

Questo protocollo presenta un metodo per generare organoidi vascolari utilizzando cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione di organoidi vascolari da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Questo studio delinea un protocollo per la generazione di monostrati 2D di organoidi suini derivati dall'intestino tenue e crasso. La crescita di questi monostrati è contrassegnata da valori TEER crescenti, che indicano una robusta integrità epiteliale. Inoltre, questi monostrati mostrano risposte secretorie fisiologiche negli esperimenti della camera di Ussing dopo l'applicazione della forskolina.

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

Questo studio presenta una metodologia economica ed efficiente per generare strutture cellulari 3D utilizzando un sistema basato su timbri per creare micropozzetti in stampi di agarosio. Il sistema promuove la formazione di sferoidi/organoidi uniformi, migliorando così le interazioni cellulari. Questo approccio riduce la variabilità sperimentale e supporta le applicazioni nei test sui farmaci e nell'ingegneria tissutale.

Generazione di sferoidi/organoidi tridimensionali da colture cellulari bidimensionali utilizzando un nuovo dispositivo di timbro

Descriviamo metodi per isolare cellule somatiche ovariche di topo da una frazione arricchita di stroma dell'ovaio e per generare organoidi somatici ovaricos di topo utilizzando un approccio senza impalcatura.

Indagine del microambiente ovarico: metodi per l'isolamento, la coltura 2D e la coltura organoide delle cellule somatiche ovariche del topo

Cellule staminali pluripotenti (hPSCs) hanno il potenziale per trattare una miriade di diverse malattie. L'utilità di queste cellule risiede nel fatto che essi possono differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula del corpo. Qui si descrive il saggio teratoma, che viene utilizzato per dimostrare l'pluripotence di hPSCs.

Generation teratoma nella Capsule Testicolo

Scopri la generazione di organoidi testicolari porcini con architettura specifica testis utilizzando microwell culture. Questo metodo riproducibile consente di studiare la morfogenesi testicolare e screening farmacologici.

Generazione di organoidi testicolari porcini con Architettura Specifica Testis utilizzando Microwell Culture

Esplora altri video