Generazione di organoidi testicolari porcini con Architettura Specifica Testis utilizzando Microwell Culture

Questo protocollo è significativo perché consente la generazione di organoidi testicolari, che possono essere utilizzati come piattaforma per lo studio della morfogenesi dei testicoli e per gli screening di farmaci e tossicità ad alto tropo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è altamente riproducibile, richiede un numero relativamente basso di cellule e può essere utilizzato per generare un gran numero di organoidi testicolari con architettura specifica del testicolo. Questo metodo può essere applicato per studiare altri sistemi, come le cellule staminali pluripotenti o le cellule isolotti pancreatiche con le ottimizzazioni necessarie.

A dimostrare la procedura di digestione enzimatica del tessuto testicolare sarà Anna Voigt, dottoranda del mio laboratorio. Raccogliere il testicolo in un becher sterile e lavare con PBS contenente 1%di streptomicina penicillina. Dopo il lavaggio trasferire il testicolo in un piatto di coltura tissutale da 100 millimetri con PBS contenente 1%di streptomicina penicillina.

Usa forbici e forcep autoclavati per rimuovere la tunica vaginale e l'epididimo. Trasferire il testicolo isolato su un nuovo piatto da 100 millimetri e lavare accuratamente con PBS contenente streptomicina all'1%penicillina. Tagliare il testicolo lungo l'asse longitudinale direttamente sotto la tunica.

Quindi sbucciare il testicolo dalla tunica usando due forcep e posizionare in un nuovo piatto da 100 millimetri contenente 1 millilitro di DMEM con streptomicina all'1%penicillina. Tritare il testicolo sbucciato con forbici sterili in pezzi di tessuto da uno a due millimetri. Dopo il taglio utilizzare forcep sterili per rimuovere i frammenti bianchi del tessuto connettivo.

Trasferire i pezzi di tessuto tritato nella soluzione A in un tubo da 50 millilitri e completarlo fino a 50 millilitri con DMEM per ottenere una concentrazione di 0,4 milligrammi per millilitro per colagenasi 4S e una concentrazione di 0,8 milligrammi per millilitro per colagenasi 4W. Posizionare il tubo contenente i pezzi di tessuto in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 30 minuti. Invertire delicatamente il tubo ogni cinque minuti.

Dopo 30 minuti, centrifugare il tubo a 90 volte G con pause a 25 gradi Celsius per 1,5 minuti. Scartare il supernatante, ad 40 millilitri della soluzione B, e ricaricare fino a 50 millilitri con DMEM per ottenere una concentrazione di 1,2 milligrammi per millilitro di colagenasi 4W. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 30 minuti e invertire delicatamente il tubo ogni cinque minuti.

Centrifugare il tubo a 90 volte G con pause a 25 gradi Celsius per 1,5 minuti. Successivamente scartare il supernatante e lavare una volta con PBS con 1%penicillina streptomicina. Raccogliere con cura i tubuli dall'alto e posizionarli in un nuovo tubo da 50 millilitri.

Ricaricare il tubo con PBS fino a 50 millilitri. Centrifuga i tubuli a 90 volte G con pause a 25 gradi Celsius per 1,5 minuti. Scartare il supernatante e aggiungere PBS fresco per lavare altre due volte.

Dopo l'ultimo lavaggio PBS rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo i tubuli seminiferi in cinque millilitri di PBS. Quindi, aggiungere 15 millilitri dello 0,25% di EDTA di tripina ai tubuli. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius e invertire delicatamente ogni due minuti.

Dopo cinque minuti valutare la digestione enzimatica dei tubuli su singole cellule al microscopio con 10 microlitri di campione su una piastra di coltura tissutale. Ogni due minuti posizionare il campione al microscopio per osservare. Se si possono rilevare per lo più singole cellule, interrompere la reazione con cinque millilitri di FBS e filtrare attraverso una rete da 70 micron e quindi attraverso una rete da 40 micron.

Centrifugare le singole cellule a 500 volte G con pause a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Sospendere di nuovo in 50 millilitri di mezzo di arricchimento e contare il numero di cellule vitali utilizzando un emocitometro. Trasferire 20 milioni di questa popolazione di cellule di partenza in ciascuna delle due piastre di Petri ultra-basse di attacco da 100 millimetri e incubare in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius, 5% anidride carbonica e 21% ossigeno per due giorni.

Cedere da 20 a 25 milioni di cellule della rimanente popolazione cellulare iniziale per piatto di coltura tissutale di 100 millimetri in un volume totale di otto millilitri di mezzo di arricchimento. Posizionare il piatto in un'incubatrice e dopo 1,5 ore assicurarsi che la maggior parte delle cellule sertoli siano attaccate alla piastra. Inclina leggermente due piastre per raccogliere e combinare i supernatanti in una nuova piastra da 100 millimetri e riposizionare di nuovo nell'incubatrice.

Dopo un'ora, unire nuovamente i supernatanti di due piastre a una nuova piastra da 100 millimetri. Riposizionare le piastre nell'incubatrice durante la notte. Quindi raccogliere le cellule germinali arricchite in due frazioni, frazione non aderente e frazione leggermente aderente.

Raccogliere il supernatante come frazione non aderente. Per la frazione leggermente aderente lavare delicatamente le piastre con PBS e trattare con due millilitri di una diluizione da uno a 20 dello 0,25%Trypsin EDTA per cinque minuti a temperatura ambiente. Interrompere la reazione aggiungendo due millilitri di mezzo di arricchimento e raccogliere nel tubo di frazione non aderente.

Unire la preparazione della cellula iniziale e le cellule germinali arricchite in un tubo per ottenere una preparazione cellulare funzionante contenente il 25% di cellule germinali. Centrifuga a 500 volte G con pause a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 20 millilitri di mezzo di formazione organoide per raggiungere una concentrazione di 2,4 milioni di cellule per millilitro.

In un nuovo tubo aggiungere un millilitro della soluzione contenente celle. Aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di risciacquo tensioattiva ad ogni pozzo in una micro piastra di pozzo. Assicurarsi che nessuna bolla d'aria sia intrappolata nel pozzo.

Per rimuovere le bolle d'aria centrifugare la piastra a 2.000 volte G con rotture a 25 gradi Celsius per due minuti. Osservare la piastra al microscopio invertito a basso ingrandimento per verificare che le bolle siano state rimosse dai micro pozzi. Coprire la piastra con un coperchio e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

Una volta completato il trattamento rimuovere la soluzione di risciacquo e lavare immediatamente la piastra con acqua sterile o PBS. Aggiungere 0,5 millilitri di mezzo di formazione organoide ad ogni pozzo e centrifugare a 2.000 volte G con rotture a 25 gradi Celsius per due minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate. Osservare il pozzo al microscopio invertito a basso ingrandimento per verificare che le bolle d'aria siano state rimosse.

Aggiungere 0,5 millilitri della sospensione della cella di lavoro e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Centrifuga a 500 volte G con pause a 25 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzare un microscopio invertito per verificare che le cellule si siano raggruppate all'interno dei micro pozzi.

Trasferire la piastra in un incubatore di coltura cellulare e coltura per cinque giorni. Cambia metà del mezzo a giorni nostri. Per recuperare gli organoidi utilizzare una pipetta a bocca larga per pipettare delicatamente il mezzo su e giù.

Ciò consente agli organoidi di uscire dai micro pozzi. Raccogliere gli organoidi, fissare ed eseguire l'immuno citochimica per marcatore di cellule germinali, marcatore cellulare Sertoli, marcatore di cellule mioidi peritubulari e marcatore cellulare Leydig e visualizzare al microscopio confocale. In questo studio cellule isolate da testiti suini di una settimana che sono state coltivate in micro pozzi auto-organizzati in sferoidi con compartimenti esterni e interni delineati e distinti.

I due compartimenti erano separati da una membrana basale positiva al collagene IV. Le cellule Sertoli positive GATA4 e le cellule germinali positive UCHL1 si trovavano nel compartimento esterno della membrana basale. Le cellule mioidi peri-tubolari positive dell'aSMA sono state localizzate lungo l'interno della membrana basale mentre le cellule leydig positive cyp450 erano al centro dell'interstizio.

Questa struttura è simile alle condizioni in situ, dove le cellule di Leydig, cellule mioidi peri-tubolari, si trovano nell'interstizio, nel compartimento interstiziale e nelle cellule germinali, le cellule di Sertoli si trovano nell'epitelio seminifero. È importante garantire che le cellule utilizzate per generare organoidi abbiano una qualità ottimale. Un'attenta attenzione deve essere prestata durante la fase di tripsininazione della digestione enzimatica.

Seguendo questa procedura gli organoidi possono essere coltivati a lungo termine per studiare la differenziazione germinale-cellula o analizzare per l'espressione genica e proteine o ormoni secreti. La capacità di creare organoidi con associazioni cellulari specifiche del testicolo fornisce un nuovo sistema in vitro per studiare le interazioni cellula-cellula importanti per lo sviluppo del testicolo e la funzione delle cellule germinali.