Name: Nativa Polyacrilamide Gel Elettroforresis Immunoblot Analisi immunoblot di dimerazione Endogena IRF5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Impara l'analisi della dimerizzazione endogena di IRF5 tramite immunoblot su gel di poliacrilammide nativo in cellule CAL-1. Questo metodo standardizzato facilita lo studio della biologia di IRF5 in diversi contesti cellulari.

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Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dai fondi della Fondazione Croucher e della City University. Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Chow per l'aiuto con l'esperimento e la lettura critica del manoscritto.

NOT:</</c0> Il protocollo qui descritto utilizza la linea cellulare CAL-1 pDC trattata con resiquimod (R848), un agonista per TLR7/8. Questo protocollo è stato applicato ad altri tipi di cellule umane e murine, tra cui RAW 264.7 (linea di macrofagio murina), THP-1 (linea cellulare monocitica umana), BJAB (linea di cellule B umana), Ramos (linea di cellule B umane) e MUT-3 (linea di cellule dendritiche umane)23.
1. Stimolazione delle cellule CAL-1
<ol><li>Mantenere le colture cellulari CAL-1 in un flacone T75 a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 in condizioni sterili con un mezzo di 20-25 mL di RPMI 1640 contenente il siero bovino fetale 5% (FBS), 25 mHE HEPES e 11 mercaptoetanolo (cioè, RPMI 1640 medio).</li>
	<li>Trasferire le cellule in un tubo conico da 50 mL. NOT:</</c1> Le cellule CAL-1 non sono aderenti. Per i tipi di cellule aderenti, la prova standard può essere eseguita per raccogliere le cellule.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT). Rimuovere supernatante e risospendere il pellet cellulare in 8 mL del mezzo RPMI 1640 completo per ottenere una sospensione omogenea a cella singola.</li>
	<li>Contare le cellule usando un emocitometro. Semina le cellule ad una densità di 1 x 106 cellule per pozzo in una piastra 6 pozzetti con 4 mL di preriscaldato RPMI 1640 medio in ogni pozzo. Incubare per 20,24 h a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per consentire alla confluenza di raggiungere il 90%-95% (corrispondente a circa 1,5 x 106 cellule).</li>
	<li>Stimolare le cellule aggiungendo 4 luna di 1 mg/mL R848 per pozzo della piastra 6 (concentrazione finale di 1 g/mL). Impostare anche un controllo non stimolato bene con le cellule senza il trattamento R848.</li>
	<li>Assicurarsi che l'R848 sia disperso uniformemente dondolando delicatamente la piastra da un lato all'altro. Quindi, incubare le cellule per 2-16 h nell'incubatrice a 37 e 5% DI CO2.</li>
</ol>2. Estrazione di proteine cellulari
<ol><li>Trasferire le sospensioni cellulari dalla piastra 6 del pozzo in tubi di centrifuga 5 mL.</li>
	<li>Centrifuga a 200 x g per 5 min a RT. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di salina con buffer fosfato (PBS) per ottenere una sospensione omogenea a cella singola.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga di 1,5 mL.</li>
	<li>Girare brevemente verso il basso a 12.000 x g per 0,5,5 min a 4 gradi centigradi e rimuovere con cura il sovrillante.</li>
	<li>Preparare il buffer di lisi contenente 6,25 mL di 1 M Tris-HCl pH 7.4 (concentrazione finale di 25 mM), 7,5 mL di 5 M NaCl (concentrazione finale di 150 mM), 0,5 mL di 0,5 M EDTA (concentrazione finale di 1 mM), 2,5 mL di NP-40 (concentrazione finale di 1%) e 7,5 mL di glicerolo (concentrazione finale del 5%) in 250 mL di acqua deionizzata (ddH2O). Aggiungere 100x proteasi inibitore monouso cocktail ad una concentrazione finale di 1x al buffer di lisi poco prima dell'uso. Tenere il buffer di lisi preparato sul ghiaccio. NOT:</</c3> Il buffer di lisi senza proteasi può essere conservato a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare a 30 gradi di lisi ghiacciata e mescolare con il pipeting su e giù.</li>
	<li>Incuba sul ghiaccio per 15-20 min.</li>
	<li>Chiarire il lisato centrifugando a 12.000 x g per 15-20 min a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga prechilled da 1,5 mL. Tenere gli estratti sul ghiaccio in ogni momento. NOT:</</c5> I listinelladi cellulari possono essere immagazzinati a -20 o -80 gradi centigradi. Non far bollire i campioni.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di proteine utilizzando il reagente Bradford.</li>
</ol>3. Analisi della dimerizzazione IRF5 da parte di Native PAGE
<ol><li>Preparare i buffer di elettroforesi della camera superiore (-) e inferiore. Il buffer della camera superiore è costituito da 0,3% deossicolato di sodio (NaDOC) in 1x buffer in esecuzione PAGE nativo, e la camera inferiore è costituito solo da 1x nativo PAGE buffer in esecuzione. NOT:</</c0> Preparare un nuovo buffer camera superiore per ogni nuova corsa.</li>
	<li>Sciacquare accuratamente un gel PAGE nativo del 3%-12% con acqua senza distorcere i pozzi. Mettere il gel nel serbatoio mini gel e rimuovere il pettine. Prerun il gel in una stanza fredda di 4 gradi centigradi o sul ghiaccio a 150 V per 30 min. NOT:</</c1> La pre-esecuzione rimuove l'eccessiva ammoniaca e gli ioni persofato che possono interferire con il funzionamento del gel.</li>
	<li>Durante la preesecuzione, preparare i campioni per il caricamento mescolando le proteine cellulari tenute sul ghiaccio con buffer di campione nativo 4x.</li>
	<li>Dopo la preesecuzione, caricate 10-15 g di proteine con un volume finale di 10-15 l per campione. NOT:</</c2> Il sovraccarico di proteine può causare smearing.</li>
	<li>Eseguire gel a 85 V per 30 min, quindi 150 V per 2 h. NOT:</</c3> Considerando le differenze nelle attrezzature e nelle linee cellulari utilizzate da diversi laboratori, piccole modifiche alla concentrazione di campioni di proteine, tensione e tempo di funzionamento possono essere appropriate per ottimizzare questo protocollo. Abbassare la tensione pre-esecuzione e in esecuzione aumentando il tempo di funzionamento può contribuire a migliorare la risoluzione dei dimeri e la coerenza dei risultati.</li>
	<li>Immergere il gel nel buffer di esecuzione SDS (25 mM Tris pH 8.3, 250 mM Glycine, 0.1% SDS) per 30 min a RT. NOT:</</c4> Non è richiesta alcuna agitazione. Occasionalmente, l'intensità della banda potrebbe non essere proporzionale alla quantità di proteine caricate a causa di un trasferimento inefficiente in presenza di deossicolato (DOC), che colpisce principalmente la forma monomerica di IRF5. Ammollo il gel in SDS tampone in esecuzione prima del trasferimento risolve questo problema. Il gel è fragile. Manico con estrema cura dal basso (cioè una percentuale più alta) dell'estremità del gel.</li>
</ol>4. Analisi Immunoblot di IRF5
<ol><li>Attivare la membrana di flufluoruro di polivinylidene (PDVF) immergendola nel metanolo per circa 5 min.</li>
	<li>Fare un taglio su un angolo della membrana per indicare il suo orientamento. Assemblare il panino di trasferimento in base all'ordine sequenziale dettagliato nel protocollo del produttore con particolare attenzione per garantire che all'interno non siano intrappolate bolle d'aria.</li>
	<li>Collocare la cassetta di trasferimento nel serbatoio e trasferirla a 20 V per 1 h sul ghiaccio. NOT:</</c0> Eseguire tutte le incubazioni e lava nei passaggi successivi con uno shaker a dondolo.</li>
	<li>Rimuovere la membrana dalla cassetta con pinze di plastica dopo il trasferimento è completato. Bloccare la membrana nel buffer di blocco (TBS) per 45 min a RT. NOT:</</c1> Buffer TBS con 5% BSA può essere utilizzato anche come buffer di blocco.</li>
	<li>Incubare la membrana con l'anticorpo primario elencato nella Tabella 1. Lavare la membrana con 1x TBST buffer di lavaggio (20 mM Tris, pH 7.0, 150 mM NaCl e 0.1% Tween 20) per 3 min mentre dondola. Ripetere il lavaggio 2x.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Dillutazione</td>
			<td>Buffer di diluvio</td>
			<td>Incubazione</td>
			<td>Commenti</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anticorpi primari (Anti-IRF5)</td>
			<td>1/1,000</td>
			<td>Buffer di blocco TBS</td>
			<td>Pernottamento a 4 o 2 h a RT</td>
			<td>Gli anticorpi diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservati a 4 gradi centigradi in presenza di azie di sodio dello 0,02%.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anticorpi secondari (Anti-rabbit)</td>
			<td>1/10,000</td>
			<td>Buffer di blocco TBS</td>
			<td>45 min presso RT</td>
			<td>Gli anticorpi diluiti possono essere riutilizzati più volte se conservati a 4 gradi centigradi in presenza di azie di sodio dello 0,02%.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
 NOT:</</c7> La diluizione deve essere ottimizzata in quanto varia da costruttore a altro.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Specifiche degli anticorpi utilizzati nella procedura di immunoblotting.
<ol start="6"><li>Incubare la membrana con l'anticorpo secondario elencato nella Tabella 1. Lavare le membrane per 3 min in 1x TBST buffer di lavaggio. Ripetere il lavaggio 2x.</li>
	<li>Eseguire la scansione della macchia utilizzando un sistema di documentazione gel appropriato.</li>
</ol>

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<li>Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKKbeta+is+an+IRF5+kinase+that+instigates+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).</li>
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<li>Reynolds, J. A., Tanford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Dodecyl+Sulfate+to+Proteins+at+High+Binding+Ratios+-+Possible+Implications+for+State+of+Proteins+in+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002(1970).</li>
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<li>Gratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+production+induced+by+Streptococcus+pyogenes-derived+nucleic+acids+is+required+for+host+protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345(2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto è una PAGE nativa modificata che distingue sia le forme monomeriche che dimericiche di IRF5 endogeno. Ci sono stati pochi studi che riportano il rilevamento dell'attivazione endogena IRF5 utilizzando la tecnica specializzata della citometria del flusso di immagini23,27,28,30. Questo protocollo utilizza una tecnica comune e reagenti e strumenti comuni per valutare lo ...

Il fattore regolatore dell'interferone 5 (IRF5) è un importante regolatore di trascrizione che svolge un ruolo di primo piano nella regolazione della risposta immunitaria, in particolare nel rilascio di citochine pro-infiammatorie e interferissi di tipo Ioni (IFN)1,2 ,3. La miscisazione della IRF5 è un fattore che contribuisce a numerose malattie autoimmuni, come evidente da vari polimorfismi nel locus IRF5 che sono associati con lupus erithematosos sistemico, sclerosi multipla, artrite reumatoide,ecc. 4, 5,6,7,8,9,10. Pertanto, un robusto test di rilevamento per lo stato di attivazione Endogeno IRF5 è fondamentale per comprendere i percorsi normativi e gli effetti a valle dell'IRF5 in un contesto cellulare fisiologicamente rilevante.
IRF5 è esclusivamente espresso in monociti, cellule dendritiche (DC), cellule B e macrofagi1,11. Come per altri fattori di trascrizione familiare IRF, l'IRF5 risiede nel citoplasma nel suo stato latente. Al momento dell'attivazione, IRF5 viene fosfolato e forma omodimeri, che poi si traslocano nel nucleo e si legano a specifici elementi regolatori di geni che codificano gli IFN di tipo I e le citochine pro-infiammatorie, inducendo infine l'espressione di questi geni1 ,2,11,12,13. IRF5 regola le risposte immunitarie innate a valle di vari recettori simili a pedoni (TLR), come TLR7, TLR 8 e TLR 9, che sono localizzati in endosomi e utilizzano MyD88 per la segnalazione1,11,14. Questi TLR riconoscono principalmente specie di acido nucleico estraneo come l'RNA a filamento (ssRNA) e il DNA CpG non metilato che sono sintomatici di un'infezione15,16,17,18. IRF5 ha dimostrato di regolare le risposte immunitarie contro le infezioni batteriche, virali e fungine19,20,21. Considerando il ruolo influente e diversificato della IRF5 nel sistema immunitario, migliorare o smorzare l'attività dell'IRF5 potrebbe servire come nuova strada per lo sviluppo di agenti terapeutici22. Pertanto, è fondamentale sviluppare un protocollo per monitorare lo stato di attivazione dell'IRF5 endogeno per consentire un'indagine approfondita dei percorsi e dei meccanismi che regolano l'attività IRF5 in diversi tipi di cellule.
Per quanto ne sappiamo, non è stato pubblicato alcun saggio biochimico o gel elettroforetico per l'attivazione endogena iRF5 prima dello sviluppo di questo protocollo. Il phosphorylation è stato dimostrato come un primo passo importante dell'attivazione IRF5, ed è stato sviluppato un anticorpo IRF5 fosforo specifico che ha portato alla scoperta e alla conferma di un residuo di serino importante per l'attività IRF513. Tuttavia, mentre l'anticorpo rileva chiaramente l'IRF5 fosforelare quando è immunoprecipitato o sovraespresso23, non riesce a rilevare la fosforilazione IRF5 in un'intera lisata cellulare nelle nostre mani (dati non mostrati). La dimerizzazione è il prossimo passo dell'attivazione IRF5, e molti studi importanti fino ad oggi studiando questo passo si basavano sulla sovraespressione dell'IRF5 con tag epitopi, spesso in tipi di cellule irrilevanti che normalmente non esprimono IRF511,12 ,24,25. Studi precedenti hanno dimostrato che l'IRF5 dimerizzato non sempre può traslocare nel nucleo e quindi non è necessariamente completamente attivato25,26. È stato sviluppato un saggio per la localizzazione nucleare IRFa Endogena per valutare l'attivazione di IRF5 mediante citometria del flusso di imaging27. Questo saggio è stato applicato in studi che sono stati cruciali per comprendere l'attività IRF5, soprattutto nei tipi di cellule primarie o rare28,29 e notevolmente avanzato la conoscenza nel campo. Tuttavia, questo saggio si basa su uno strumento specializzato che non è ampiamente disponibile per i ricercatori. Inoltre, è spesso necessario studiare le fasi iniziali dell'attivazione, sezionando i percorsi normativi IRF5 e identificando i regolatori a monte e i componenti del percorso. Questo studio fornisce un saggio biochimico robusto e affidabile per i primi eventi di attivazione dell'IRF5 che può essere eseguito in laboratori dotati di strumenti di biologia molecolare. Il protocollo qui descritto sarà molto utile per studiare i percorsi e i meccanismi delle azioni IRF5, soprattutto se combinato con saggi ortogonali come l'analisi citometrica del flusso di immagini della localizzazione nucleare IRF523, 27,28,30.
L'elettroforesi nativa del gel di poliacrilammide (nativa PAGE) è un metodo ampiamente utilizzato per analizzare i complessi proteici31,32. A differenza dell'elettroforesi gel in gel di sodio dodecylsulfate (SDS-PAGE), PAGE nativo separa le proteine in base alla loro forma, dimensione e carica. Mantiene anche la struttura originaria delle proteine senza denaturazione31,33,34,35. Il protocollo presentato sfrutta queste caratteristiche della PAGE nativa e rileva sia forme monomeriche che dimericiche di IRF5. Questo metodo è particolarmente importante per rilevare gli eventi di attivazione precoce perché non esiste un anticorpo disponibile in commercio adatto in grado di rilevare l'IRF5 fosforogeno endogeno. In precedenza, diversi studi pubblicati hanno usato PAGE nativo per valutare la dimerizzazione IRF5. Tuttavia, la maggior parte di questi studi dipendeva dalla sovraespressione dell'IRF5 con tag epitope esogeni per analizzare lo stato di attivazione2,13,24,36,37 . Questo lavoro presenta un protocollo passo-passo per l'analisi della dimerizzazione iRFosa endogena tramite una tecnica PAGE nativa modificata in una linea di cellule dendritiche plasmacitoidi umane (pDC), dove l'attività IRF5 ha dimostrato di essere cruciale per la sua funzione1, 38,39,40. Questa stessa tecnica è stata applicata ad altre linee cellulari23.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Life Technologies, HK</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>300 W/250 V alimentazione 230 V AC</td><td>Life Technologies, HK</td><td>PS0301</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-IRF5</td><td>Bethyl Laboratories, USA</td><td>A303-385</td><td></td></tr><tr><td>BIOSAN Rocker Shaker (sicuro per celle frigorifere)</td><td>EcoLife, HK</td><td>MR-12</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Buffer, pH 8, 0,5 M 4x 100 mL</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td>15575020</tr><tr><td>Glicerolo 500 mL</td><td>Life Technologies</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15527013</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-Topo IgG DyLight 800 Anticorpo coniugato</td><td>LAB-A-PORTER/Rockland, HK</td><td>610-145-002-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG DyLight 800 Anticorpo coniugato</td><td>LAB-A-PORTER/Rockland, HK</td><td>611-145-002-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi Halt (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, HK</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS)</td><td>Gene Company, HK</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>Mini Tank blot module combo; Modulo di trasferimento, accessori</td><td>Life Technologies, HK</td><td>NW2000</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% gel, kit da 10 pozzetti</td><td>Life Technologies, HK</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Running Buffer 20x</td><td>Life Technologies, HK</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Sample Buffer 4x</td><td>Life Technologies, HK</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol</td><td>Tin Hang/ Calbiochem, HK#</td><td>492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS 7.4</td><td>Life Technologies, HK</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in polivinilidene difluoruro (PVDF)</td><td>Bio-gene/Merck Millipore, HK</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine II (BSA)</td><td>Bio-Rad, HK</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen, HK</td><td>tlrl-r848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies, HK</td><td></td><td></td>61870127</tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>ThermoFisher</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodio desossicolato &ge; 97% (titolazione)</td><td>Tin Hang/Sigma, HK</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15504020</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Tin Hang/Sigma, HK</td><td>#P9416-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

nativa polyacrilamide gel elettroforresis immunoblot analisi immunoblot di dimerazione endogena irf5

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization

Il fattore regolatore dell'interferone 5 (IRF5) è un fattore chiave di trascrizione per la regolazione della risposta immunitaria. Viene attivato a valle del percorso di segnalazione del gene di segnalazione del gene di segnalazione 88 (TLR-MyD88) del recettore toll-like mieloide. L'attivazione dell'IRF5 comporta fosfororylazione, dimerizzazione e successiva traslocazione dal citoplasma al nucleo, che a sua volta induce l'espressione genica di varie citochine pro-infiammatorie. Un risultato di rilevamento per l'attivazione IRF5 è essenziale per studiare le funzioni IRF5 e i relativi percorsi. Questo articolo descrive un robusto analisi per rilevare l'attivazione endogena IRF5 nella linea di cellule dendriche (pDC) plasmacitoide umane CAL-1. Il protocollo consiste in un saggio di elettroforesi non denatura modificato in grado di distinguere IRF5 nelle sue forme monomeriche e dimeiche, fornendo così un approccio conveniente e sensibile per analizzare l'attivazione IRF5.

L'immunoblot (IB) con anticorpo anti-IRF5 è stato eseguito su cellule CAL-1 non stimolate o stimolate con 1 g/mL R848 per 2 h (Figura 1). Sono stati preparati glisati cellulari e la PAGE nativa è stata eseguita. Nelle cellule CAL-1 non stimolate, IRF5 è stato rilevato come una singola banda nella PAGE nativa, corrispondente alla sua forma monomerica. Dopo il trattamento delle cellule CAL-1 con R848 per 2 h, il livello di monomero IRF5 è diminuito con un aumento simultaneo dell'accumulo di un...

Viene descritto un metodo nativo western blot per l'analisi del fattore regolatore dell'interferone endogeno 5 nella linea cellulare dendritica plasmacitoide CAL-1. Questo protocollo può essere applicato anche ad altre linee cellulari.

Nativa Polyacrilamide Gel Elettroforresis Immunoblot Analisi immunoblot di dimerazione Endogena IRF5

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like ...

Questo protocollo utilizza una tecnica ampiamente utilizzata insieme a reagenti e strumenti che possono essere acquisiti commercialmente per valutare l'attivazione endogena di IRF5 durante i primi eventi di stimolazione. Può essere facilmente applicato per sondare la biologia IRF5 in altri contesti cellulari. Mentre la PAGE nativa è una tecnica ampiamente utilizzata, ottenere risultati chiari, robusti, interpretabili e riproducibili può essere tecnicamente impegnativo.L'utilizzo di un buffer di funzionamento commerciale e di un sistema gel aiuta a ridurre al minimo la variabilità. E prestare attenzione ai dettagli è essenziale e l'esperienza è la chiave del successo nell'ottenere buoni risultati. Questo protocollo PAGE nativo modificato comporta molti passaggi con dettagli sottili che sono fondamentali per il successo.La dimostrazione visiva può mostrare questi dettagli che sarebbero utili per i ricercatori. Mantenere la coltura cellulare CAL-1 in un pallone T75 a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, con mezzo RPMI 1640 completo. Quando sei pronto a stimolare le cellule, trasferiscile in un tubo conico da 50 millilitri e centrifugale a 200 x g per cinque minuti.Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in mezzo per ottenere una sospensione omogenea a singola cella. Quindi tenere conto delle cellule con un emocitometro, e seminarle ad una densità di 1.000.000 di cellule per pozzo in una piastra a sei pozzi con quattro millilitri di mezzo preriscaldato in ogni pozzo. Incubare le cellule per 20-24 ore per consentire alla confluenza di raggiungere il 90-95%Il giorno successivo, stimolare le cellule aggiungendo quattro microlitri di un milligrammo per millilitro R848 per pozzo, assicurandosi di lasciare un controllo bene con le cellule e nessun trattamento R848.Scuotere delicatamente la piastra da un lato all'altro per disperdere uniformemente l'R848, quindi incubare le cellule per 2-16 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo l'incubazione, trasferire le sospensioni cellulari dalla piastra in tubi di centrifuga da 5 millilitri. Centrifugare le cellule a 200 x g per cinque minuti, quindi rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di PBS.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 1,5 millilitri e farlo girare verso il basso a 12.000 x g per 30-60 secondi a 4 gradi Celsius, quindi rimuovere con cura il supernatante. Preparare il tampone di lisi secondo le indicazioni del manoscritto e tenerlo sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'uso. Sospendere di nuovo il pellet cellulare in 30 microlitri di tampone di lysis ghiacciato e pipettare su e giù per mescolare.Quindi incubare il tubo sul ghiaccio per 15-20 minuti. Chiarire il litolato centrifugando a 12.000 x g per 15-20 minuti a 4 gradi Celsius e trasferire il supernatante in un tubo pre-refrigerato da 1,5 millilitri, assicurandosi di mantenere gli estratti sul ghiaccio in ogni momento. Quindi, misurare la concentrazione proteica usando Bradford Reagent.Preparare i tamponi di elettroforesi a camera superiore e inferiore secondo le indicazioni del manoscritto e sciacquare accuratamente con acqua un gel PAGE nativo del 3-12%, senza distorcere i pozzi Prestare particolare attenzione quando si maneggia il deossicholato di sodio. I DPI per la protezione come camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e maschera sono necessari per la manipolazione della sostanza chimica. Quindi, impostare il gel nel Mini Gel Tank, rimuovere il pettine, aggiungere i tamponi di elettroforesi a camera superiore e inferiore preparati e pre-eseguito in una cella frigorifera di 4 gradi Celsius o sul ghiaccio a 150 volt per 30 minuti.Nel frattempo, preparare i campioni per il caricamento mescolando le proteine cellulari sul ghiaccio con 4X Native Sample Buffer. Una volta completata la pre-corsa, caricare da 10 a 15 microgrammi di proteine ad ogni pozzo e far funzionare il gel per 30 minuti a 85 volt, seguito da due ore a 150 volt. Quindi, immergere il gel nel tampone di corsa SDS per 30 minuti a temperatura ambiente.Attivare la membrana difluoruro di polivinilidene immergendola in metanolo per circa cinque minuti. Effettuare un taglio su un angolo della membrana per indicare il suo orientamento e assemblare il sandwich di trasferimento secondo il protocollo del produttore. Posizionare la cassetta di trasferimento nel serbatoio e trasferire a 20 volt per un'ora sul ghiaccio.Quindi rimuovere la membrana dalla cassetta con le forcep di plastica e bloccare la membrana nel tampone di blocco a temperatura ambiente per 45 minuti su uno shaker a dondolo. Successivamente, incubare la membrana con l'anticorpo primario a 4 gradi Celsius durante la notte o a temperatura ambiente per due ore e lavarla con tampone di lavaggio 1XTBST per tre minuti durante il dondolo. Quindi incubare nuovamente la membrana con l'anticorpo secondario utilizzando il tampone di lavaggio 1XTBST a temperatura ambiente per 45 minuti, ripetendo i lavaggi.Quindi scansionare la macchia utilizzando un adeguato sistema di documentazione del gel. Utilizzando questo protocollo, le cellule CAL-1 che sono state stimolate o non stimolate con R848 sono state analizzate con un immunoblot. Nelle celle CAL-1 non stimolate, IRF5 è stato rilevato come una singola banda nella PAGE nativa corrispondente alla sua forma monomerica.Per le cellule stimolate, il livello di monomero IRF5 è diminuito, mentre il livello del dimero è aumentato. Un'immunoblot con anticorpo anti-IRF5 è stata eseguita su cellule IRF5 che esprimono 293 cellule T trasfetate con vari costrutti. Nessun IRF5 è stato rilevato nel controllo non trasfetto, dimostrando la specificità dell'anticorpo anti-IRF5.Una singola banda corrispondente all'IRF5 monomerico è stata rilevata solo nelle 293 cellule T che esprimono troppo IRF5. Quando i costrutti che codificano le proteine attivanti IRF5 sono stati co-trasfetati, è apparsa una banda che migra lentamente corrispondente alla forma dimerica di IRF5. Tuttavia, NMDA5, una proteina correlata a RIG-I, non ha indotto la dimerizzazione IRF5.L'uso di gel gradiente Bis-Tris è cruciale, probabilmente a causa del pH specifico e della composizione chimica di questo gel sistemi elettroforetici che hanno permesso la separazione di forme monomeriche e dimeriche di IRF5. Inoltre, la llysing e la conservazione dei llysati cellulari nel tampone di campioni nativi non denaturanti conservano le strutture proteiche native. Qui ne abbiamo usato uno disponibile in commercio su misura per gli acidi PAGE nativi.Un metodo aggiuntivo che si complimenta molto con questo è quello di utilizzare il sistema di citometria del flusso di imaging ImageStream per valutare la traslocazione nucleare IRF5, che è la sostanza che nell'attivazione IRF5 dopo la dimerizzazione. Se combinato con il nostro protocollo, funge da altro tipo di test per convalidare i passaggi coinvolti nell'attivazione IRF5. Essendo un regolatore chiave della risposta infiammatoria, IRF5 svolge un ruolo importante nell'infezione e nell'immunità, nelle malattie autoimmuni, nel cancro e in molte altre malattie importanti per la salute umana.Ci sono anche sforzi nello sviluppo di terapie per indirizzare l'IRF5 e i relativi fattori di trascrizione. Questo protocollo consentirà ai ricercatori di diversi campi di comprendere e sondare la biologia IRF5.

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Descriviamo l'isolamento della matrice extracellulare cardiaca da topi di controllo C57Bl/6J, topi con pelle stretta e topi con pelle stretta trattati con il peptide inibitorio IRF5. Descriviamo anche gli studi di vasodilatazione sui vasi isolati da C57Bl/6J, topi con pelle stretta e topi con pelle stretta trattati con il peptide inibitorio IRF5.

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Presentato qui sono due tecniche di ricerca di interazione proteina-proteina anticorpo-basato: immunofluorescenza e immunoprecipitazione. Queste tecniche sono adatte per lo studio delle interazioni fisiche tra le proteine per la scoperta di nuovi componenti delle vie di segnalazione cellulare e per la dinamica di proteina di comprensione.<br...

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Integrasi retrovirale recombinante e oligomeri del DNA che imita le estremità del DNA virale possono formare un complesso enzimaticamente attivo conosciuto come un intasome. Intasomes possono essere utilizzati per studi biochimici, strutturali e cinetici. Questo protocollo i dettagli di come assemblare e purificare prototipo schiumoso virus intasomes.

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Descritto è un flusso di lavoro proteomico per identificare i partner di interazione delle proteine da una frazione subcellulare nucleare utilizzando l'arricchimento dell'immunoaffinità di una determinata proteina di interesse e la spettrometria di massa priva di etichette. Il flusso di lavoro include frazionamento subcellulare, immunoprecipitazioni, preparazione dei campioni assistiti dal filtro, pulizia offline, spettrometria di massa e una pipeline bioinformatica a valle.

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Impara l'analisi della dimerizzazione endogena di IRF5 tramite immunoblot su gel di poliacrilammide nativo in cellule CAL-1. Questo metodo standardizzato facilita lo studio della biologia di IRF5 in diversi contesti cellulari.

Nativa Polyacrilamide Gel Elettroforresis Immunoblot Analisi immunoblot di dimerazione Endogena IRF5

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