Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden

Il bioinvecco pdECM può fornire un microambiente benefico per gli isolotti pancreatici utilizzando componenti e architettura specifici dei tessuti e ha proprietà neurologiche ottimali che riducono la morte cellulare e aumentano la loro stampabilità. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la composizione specifica del tessuto può essere preservata all'interno del bioink pdECM promuovendo un crosstalk costruttivo tra costrutti di tessuto pancreatico 3D e isolotti incapsulati. Lo sviluppo dell'incapsulamento dell'isolotto nel bioink pdECM può essere applicato alla fabbricazione di costrutti di tessuto pancreatico trapiantabili per il trattamento del diabete di tipo uno.

Questo bioink può essere utilizzato per ampliare l'applicazione di costrutti trapiantabili e modelli di tessuti in vitro per diabete, complicanze legate al diabete e cancro al pancreas. Per la decellularizzazione di un campione di tessuto pan pancreas suino congelato, utilizzare una grattugia per affettare il pancreas congelato in pezzi spessi un millimetro e trasferire 50 grammi del tessuto affettato in un contenitore di plastica da 500 millilitri. Lavare il tessuto con 300 millilitri di acqua distillata a quattro gradi Celsius su uno shaker orbitale digitale a 150 rotazioni al minuto per circa 12 ore.

Quando l'acqua torbosa scompare, sostituire l'acqua con 400 millilitri di 1%Triton-X 100 in PBS per 84 ore. Al termine del trattamento detergente, incubare il tessuto con 400 millilitri di isopropanolo per due ore per rimuovere il grasso rimanente dal pancreas, seguito da un lavaggio 24 ore su 24 in 400 millilitri di PBS. Al termine del lavaggio, sterilizzare il tessuto decellularizzato con 400 millilitri di acido peracetico allo 0,1% in etanolo al 4% per due ore prima di lavare il campione con 400 millilitri di PBS fresco per sei ore per rimuovere eventuali detergenti residui.

Alla fine del lavaggio, utilizzare le forcelle per trasferire i pezzi di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri e ricongelare il campione a meno 80 gradi Celsius per un'ora. Quindi coprire il tubo conico con una salvietta senza pelucchi fissata con un elastico e liofilizzare il tessuto decellularizzato a meno 50 gradi Celsius per quattro giorni. Per preparare il bioink, trasferire 200 milligrammi di pdECM liofilizzato in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e aggiungere 20 milligrammi di pepsina e 8,4 millilitri di acido acetico molare 0,5 al campione di tessuto.

Quindi posizionare una barra di agitazione magnetica nel tubo per un'incubazione di agitazione di 96 ore a 300 rotazioni al minuto. Al termine dell'incubazione, utilizzare un filtro cellulare da 40 micrometri e una pipetta di spostamento positivo per filtrare la soluzione in un nuovo tubo sul ghiaccio per filtrare eventuali particelle non digerite e aggiungere un millilitro di 10X PBS al tubo. Dopo il vortice, utilizzare idrossido di sodio per regolare il pH della soluzione a sette.

Per preparare il bioink per la stampa cellulare 3D di un costrutto pancreatico con una struttura a motivi geometrici, macchiare un'aliquota di bioink pdECM con 0,4%Trypan Blue e un'aliquota con soluzione bengalese rosa con un rapporto uno a 20. Quindi utilizzare una pipetta di spostamento positiva per mescolare delicatamente ogni soluzione di bioink con una soluzione di isolotto sospesa media a un rapporto tre a uno a una concentrazione finale di bioink dell'1,5% e una densità cellulare di tre volte 10 al tre isolotto equivalente per millilitro. Per la stampa cellulare 3D di costrutti di tessuto pancreatico a base multimateriale, caricare ogni miscela di isolotto bionk in singole siringhe sterilizzate dotate di ugelli calibro 25 e stampare in 3D ogni bioink in condizioni di stampa ottimizzate a 18 gradi Celsius a forma di reticolo con linee alternate di blu e rosso.

Per collegare il bioink, posizionare il costrutto stampato in un incubatore di coltura di cellule di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% per 30 minuti. Immergere quindi il costrutto stampato nel mezzo RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale al 10% e 100 unità per millilitro di penicillina e streptomicina. Dopo il processo di decellularizzazione, il 97,3% del DNA a doppio filamento viene rimosso e i componenti rappresentativi della matrice extracellulare come collagene e glicosaminoglicani rimangono rispettivamente al 1278,1% e al 96,9% rispetto a quello del tessuto pancreatico nativo.

In questa analisi rappresentativa, il bioink pdECM ha mostrato un comportamento di assottigliamento a taglio con un valore di circa 10 pascal al secondo alla velocità di taglio di uno al secondo indicando che il bioink ha dimostrato le caratteristiche reologiche appropriate per l'estrusione attraverso un ugello. Inoltre, il modulo complesso del bioink ha iniziato ad aumentare quando la temperatura ha raggiunto i 15 gradi Celsius e rapidamente è aumentato quando la temperatura è stata mantenuta a 37 gradi Celsius indicando la transizione sol-gel della soluzione. Il primo G dinamico e il doppio primo G del bioink pdECM sono stati studiati a temperature fisiologicamente rilevanti per garantirne la stabilità dopo il processo di stampa con conseguente raggiungimento di un modulo stabile nelle condizioni di sweep di frequenza.

Utilizzando un sistema di stampa multihead, vari tipi di costrutti 3D potrebbero quindi essere fabbricati come dimostrato utilizzando il pdECM sviluppato dimostrando la versatilità di pdECM ai fini della biostammpa 3D per armonizzare due o più tipi di tessuti viventi in una disposizione tissutale. Sii delicato quando mescola il bioink con le cellule per evitare la morte cellulare e la formazione di bolle poiché la presenza di bolle abbassa la risoluzione di stampa e riduce la vitalità cellulare. La funzionalità degli isolotti pancreatici incapsulati all'interno dei costrutti del tessuto pancreatico 3D può essere valutata mediante colorazione ad immunofluorescenza o un test di tolleranza al glucosio.

Questa tecnica di biovettiva pdECM e biostampa 3D può potenzialmente essere utilizzata per lo sviluppo di costrutti funzionali di tessuto pancreatico nel campo dell'ingegneria tissutale. I ricercatori devono indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati per prevenire lesioni durante la manipolazione della grattugia affilata e dei reagenti.