Name: Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sullattivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Scopri la co-cultura Transwell per studiare la segnalazione paracrina tumorale e i suoi effetti immunosoppressori sui macrofagi. Questo metodo consente l'analisi dei fattori secreti senza contatto diretto tra le cellule.

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Eric Ubil è stato finanziato, in parte, dalla American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Il lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del NIH (R01-CA205398) e da un premio della Breast Cancer Research Foundation (BCRF-18-041) all'HSE.

Tutte le procedure relative alla raccolta e all'uso di macrofagi murini peritoneali sono state condotte presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill (UNC) e sono state approvate dall'UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Cultura dei Macrofafi
NOTA: questa procedura può utilizzare macrofagi peritoneali primari (descritti in dettaglio di seguito), macrofagi derivati dal midollo osseo o linee cellulari di macrofagi come J774 (ATCC) o RAW264 (ATCC).
<ol><li>Raccogliere macrofagi peritoneali come descritto in precedenza16,17 e piastra direttamente nella camera superiore (s) di un 0,4 m di membrana di poliestere inserto co-cultura 6 bene (Figura 1A). NOTA: La resa approssimativa dei macrofagi da ogni isolamento è 1 x 106 celle in totale, quindi il numero medio di celle per pozzo è di 1,5–1,6 x 105 celle in un 6 pozzetti.</li>
	<li>Cultura dei macrofagi raccolti nel Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1x penicillin/streptomycin, 20 ng/mL macrophage colonia stimolante fattore stimolante (M-CSF) per 3 giorni a 37 gradi centigradi, 5% CO2. NOTA: La camera superiore contiene 1 mL di mezzo di coltura mentre la camera inferiore è riempita con 1,5 mL. Il mezzo deve essere aggiunto ad ogni camera.</li>
</ol>2. Cocoltura di cellule tumorali con macrofagi
<ol><li>Prima dell'uso, coltura cellule tumorali disponibili in commercio nel loro rispettivo mezzo seguendo i metodi di coltura dei tessuti ATCC-raccomandato.</li>
	<li>Lavare le cellule tumorali aderenti una volta con la salina tamponata da fosfato (PBS), aggiungere 0,05% trypsin - acido etileneaminetracetraacetico (EDTA), e incubare a 37 s fino a quando le cellule si staccano. Risospendere le cellule in FBS contenenti mezzo, quantizzare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare, quindi centrifugare per 5 min a 220 x g al pellet.</li>
	<li>Durante la centrifugazione, aspirare il mezzo dalle camere superiore e inferiore delle piastre di supporto permeabili contenenti membrana contenente macrofaci e sostituire con un mezzo fresco.<ol>
<li>Per le camere inferiori in cui saranno placcate le cellule tumorali, riempire con 1 mL di mezzo invece di 1,5 mL per consentire un volume sufficiente per l'aggiunta di cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mezzo aspirato dalle cellule tumorali pelletate e resospendono le cellule in DMEM/F12 con 10% FBS, 1x penicillina / streptomiacina, e 20 ng/mL M-CSF ad una concentrazione di 3 x 105 cellule / mL.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 mL di 3 x 105 cellule /mL delle cellule tumorali alla camera inferiore dei pozzi desiderati (Figura 1B). NOTA: Le celle possono essere trattate immediatamente.</li>
</ol>3. Trattamento delle cellule cocoltivate
<ol><li>Per indurre l'espressione genica pro-infiammatoria dei macrofagi, trattare i macrofagi coscienti o co-coltivati aggiungendo 100 ng/mL IFN e 50 ng/mL LPS.<ol>
<li>Variare la durata dei tempi di trattamento in base alle esigenze. L'attivazione del macrofago avviene entro 2 h e una soppressione mediata dal tumore si verifica di 8 h. La co-cultura per 24 h produce una soppressione robusta e coerente derivata dal tumore. NOTA: In alternativa, i macrofagi possono essere indotti ad adottare un fenotipo curativo pro-ferito attraverso l'aggiunta di fattori come l'interleucina-10 (IL10) e l'effetto del ligando secreto tumorato valutato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Come controllo negativo, i macrofagi di coltura sorreggono singly e lasciano non trattati. Come controllo positivo, trattare i macrofagi coltivati in modo runzale con 100 ng/mL IFN e 50 ng/mL LPS.</li>
</ol>4. Analisi a valle delle cellule cocoltivate
<ol><li>Dopo che il tempo di incubazione desiderato è trascorso, isolare il mezzo di coltura lisiate o condizionata cellulare come desiderato, a seconda delle esigenze di test.</li>
	<li>Per isolare il lisato cellulare per l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR), aspirare i media da entrambe le camere del pozzo e lavare una volta con 2 mL di PBS. Applicare il buffer di lisi RNA alla camera superiore contenente i macrofagi. Raschiare delicatamente la membrana per rilasciare il lisato cellulare e trasferirlo in un tubo di raccolta per un'ulteriore elaborazione secondo il protocollo del produttore del kit di isolamento dell'RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li>
<li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis%3A+a+potential+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li>
<li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+%28PD-L1%29+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).</li>
<li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li>
<li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li>
<li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li>
<li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+a+mechanism+of+tumor+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li>
<li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li>
<li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages%3A+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li>
<li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
<li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+%28Taxol%29+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio di co-cultura qui presentato è una modifica dei saggi stabiliti in precedenza che consente lo studio dei fattori secreti dal tumore sull'attivazione delle cellule immunitarie. Mentre il contatto cellulare è noto per indurre cambiamenti nell'attività immunitaria, la capacità dei ligandi seminati dai tumori di modulare l'attivazione immunitaria è meno ben compresa. Descriviamo un metodo che, a differenza della cocoltura diretta, può essere usato per interrogare come i fattori secreti derivati dai tumori influisco...

Recenti studi si sono concentrati sulla capacità delle cellule tumorali di evitare il rilevamento da parte delle cellule immunitarie, sopprimere l'attivazione immunitaria locale o di produrre un ambiente tolerogenico permissivo-permissivo nel microambiente tumorale. Sono state descritte due ampie classi di interazioni tumorali e cellulari immunitarie che facilitano questi effetti: interazioni mediate dal contatto o ligando secreti da tumore. Uno dei meccanismi più studiati e clinicamente trattabili dell'inibizione immunitaria mediata dal contatto utilizzata dai tumori è l'espressione del PD-L1, che interagisce con pd-1 sulle cellule T per inibire la loro attivazione e funzione1,2. In risposta all'interferone-gamma (IFNz), che è espresso da un certo numero di cellule immunitarie attivate, le cellule tumorali possono aumentare l'espressione della PD-L1 per indurre l'esaurimento delle cellule T attivate PD-1, impedendo così loro di sradicare efficacemente le cellule tumorali3. L'uso di anticorpi per bloccare l'interazione tra PD-L1 e PD-1 è attualmente utilizzato per trattare più tipi di cancro negli esseri umani4. Alla luce di questo successo clinico e di altri, l'identificazione e il targeting di meccanismi immunosoppressivi derivati dal tumore ha ricevuto una crescente attenzione.
Oltre alla soppressione dell'immunità adattiva, i tumori sono noti anche per secernere fattori che sopprimono le risposte pro-infiammatorie delle cellule immunitarie innate. Le secrezioni di tumore o indotte dal tumore, tra cui IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, e il fattore stimolante della colonia (CSF-1), hanno dimostrato di inibire le risposte antitumorali di cellule killer naturali (NK), granulociti e cellule dendritiche nel microambiente tumorale5,6,7. Le cellule tumorali possono anche secernere fattori che distorceno il reclutamento e la differenziazione delle cellule derivate da mieloidi nel microambiente tumorale per promuovere la soppressione dell'attivazione delle cellule T8,9.
Un tipo di cellula immunitaria innata che ha un profondo effetto sulla progressione del tumore è il macrofago. Per molti anni, la presenza di macrofagi associati al tumore (TAM) è stata utilizzata come prognostico negativo della sopravvivenza del paziente10. Il concetto che i TAM immunosoppressi smorzinano la clearance dei tumori mediata dalle cellule immunitarie è stato introdotto più di 40 anni fa11. Più recentemente, è stato dimostrato che la risposta pro-infiammatoria dei macrofafi può essere abbassata mentre un fenotipo pro-tumorale può essere indotto nel microambiente tumorale. Questi macrofagi immunosoppressivi possono contribuire a una risposta tolerogenica, spingendo la progressione del tumore e la resistenza alla chemio e all'immunoterapia12. Dato che i macrofagi sono spesso uno dei leucociti più abbondanti con il tumore, il ripristino della loro attività immunitaria specifica del tumore rappresenta un potenziale bersaglio per le terapie anticancer13.
Mentre le interazioni mediate dal contatto tra cellule tumorali e macrofagi possono essere modellate attraverso la cocultura diretta, l'uso di supporti a membrana permeabili può chiarire quali fattori sevetore sono immunomodulatori senza l'influenza potenzialmente confusa del contatto tra cellule tumorali e immuni. Utilizzando metodi in qualche modo simili, altri hanno dimostrato il potenziale di identificare i fattori secreti nelle interazioni microglia/neuronale14 così come le cellule tumorali con cellule mesoteliane15. Abbiamo anche utilizzato con successo questa tecnica di co-coltura per caratterizzare il ruolo di una proteina sepolmorale, Pros1, come soppressore dell'espressione genica pro-infiammatoria dopo la stimolazione dei macrofagi peritoneali con LPS e interferone-gamma16. Qui descriviamo una metodologia semplice che può essere utilizzata per interrogare il modo in cui i fattori secreti sul tumore possono influenzare l'attivazione dei macrofafi.

<table><tbody>Kit di sintesi del cDNA <tr><td>B16-F10</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 media</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco 11320033</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Millipore</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaridi da Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5293-2ML</td><td></td></tr><tr><td>Murine M-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-439</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pros1 ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS2886720</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Mouse ricombinante IFN&gamma;</td><td>Kit BioLegend</td><td>575302</td><td></td></tr><tr><td>Sensimix SYBR Low-ROX</td><td>Bioline</td><td>QT625-05</td><td></td></tr><tr><td>Supporti permeabili Transwell</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-170</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sull'attivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

La segnalazione paracrina derivata dal tumore è una componente trascurata dell'immunosoppressione locale e può portare a un ambiente permissivo per la continua crescita del cancro e la metastasi. I segnali paracrini possono coinvolgere il contatto cellulare tra diversi tipi di cellule, come PD-L1 espresso sulla superficie dei tumori che interagiscono direttamente con PD-1 sulla superficie delle cellule T, o la secrezione di ligandi da una cellula tumorale per influenzare una cellula immunitaria. Qui descriviamo un metodo di co-cultura per interrogare gli effetti dei ligandi seminati dai tumori sull'attivazione delle cellule immunitarie (macrofago). Questa procedura semplice utilizza supporti permeabili a membrana di policarbonato disponibili in commercio da 0,4 m e piastre standard per la coltura dei tessuti. Nel processo descritto, i macrofagi sono coltivati nella camera superiore e nelle cellule tumorali nella camera inferiore. La presenza della barriera di 0,4 m consente lo studio della segnalazione intercellulare senza la variabile di confusione del contatto fisico, perché i due tipi di cellule condividono lo stesso mezzo e l'esposizione ai ligandi paracrini. Questo approccio può essere combinato con altri, come alterazioni genetiche del macrofago (ad esempio, l'isolamento dai topi genetici knock-out) o tumore (ad esempio, alterazioni mediate da CRISPR) per studiare il ruolo di specifici fattori e recettori secreti. L'approccio si presta anche ad analisi biologiche molecolari standard come la reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) o l'analisi delle macchie occidentali, senza la necessità di smistamento del flusso per separare le due popolazioni cellulari. I saggi immunosorbena legati all'enzima (ELISA) possono essere utilizzati allo stesso modo per misurare i ligandi secreti per comprendere meglio l'interazione dinamica della segnalazione cellulare nel contesto del tipo di cella multipla. La durata della co-cultura può anche essere variata per lo studio di eventi regolati temporalmente. Questo metodo di co-cultura è uno strumento robusto che facilita lo studio dei segnali secreti da tumore nel contesto immunitario.

Per determinare l'effetto dei ligandi setosecreti dal tumore sulla polarizzazione dei macrofagi, è stata utilizzata la procedura descritta. I macrofagi peritoneali coltivati in assenza di cellule tumorali sono stati utilizzati come controlli negativi (non trattati e a estrema sinistra) e positivi (IFN e LPS stimolati al2nd da sinistra)(Figura 2A). In alternativa, i macrofagi peritoneali sono stati co-coltivati con cellule tumorali del melanoma B16F10 (ATCC) (F...

Qui, presentiamo un metodo utilizzando supporti a membrana permeabili per facilitare lo studio della segnalazione paracrina senza contatto utilizzata dalle cellule tumorali per sopprimere la risposta immunitaria. Il sistema è suscettibile di studiare il ruolo dei fattori secreti sul tumore nell'smorzamento dell'attivazione dei macrofaci.

Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sull'attivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Questo metodo di co-coltura transwell viene utilizzato per studiare la segnalazione paracrina utilizzata dalle cellule tumorali per sopprimere la risposta immunitaria. Questo metodo può essere usato per scoprire nuovi ligandi secreti, così come le basi meccaniche dei loro effetti soppressivi immunitari. In precedenza abbiamo usato questo metodo per mostrare come i fattori secreti dal tumore possono smorzare la trascrizione genica pro-infiammatoria del macrofago.Crediamo che questo strumento abbia implicazioni ad ampio raggio nello studio della soppressione immunitaria derivata dal tumore. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che può essere utilizzata per studiare la segnalazione paracrina tra cellule tumorali e cellule immunitarie senza la variabile potenzialmente confusa del contatto da cellula a cellula. Questa piattaforma è anche suscettibile a una varietà di tecniche biologiche molecolari per l'analisi a valle.Dopo aver raccolto i macrofagi peritoneali, placcarli direttamente nelle camere superiori di una membrana in poliestere da 0,4 micrometri inserire co-coltura piastra a sei poggiagli. Quindi aggiunto DMEM integrato al pozzo in modo che la camera superiore contenga un millilitro e la camera inferiore contenga 1,5 millilitri. Incubare per tre giorni a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.In primo luogo, la coltura disponibile in commercio cellule tumorali nel rispettivo mezzo, seguendo i metodi di coltura tissutale raccomandati dall'ATCC. Quindi, lavare le cellule tumorali aderenti una volta con PBS. Aggiungere lo 0,05% di tripside in EDTA e incubare a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non si staccano.Quindi sospendere di nuovo le celle nei supporti contenenti FBS. Utilizzare un emocitometro o un contatore cellulare per quantificare il numero totale di cellule e centrifugare a 220 volte G per cinque minuti a pellet. Durante la centrifugazione, aspirare il mezzo dalle camere superiore e inferiore del macrofago contenente piastre di supporto a membrana permeabili e sostituirlo con mezzo fresco.Per le camere inferiori in cui verranno placcate le cellule tumorali, riempire con un millilitro di mezzo invece di 1,5 millilitri per lasciare un volume sufficiente per l'addizione cellulare. Una volta completata la centrifugazione, aspirare il mezzo dalle cellule tumorali pellettate e sospendere nuovamente le cellule in DMEM integrato ad una concentrazione di 300.000 cellule per millilitro. Aggiungere 0,5 millilitri di questa sospensione cellulare alla camera inferiore dei possedimenti desiderati.Per indurre l'espressione genica pro-infiammatoria del macrofago, trattare macrofagi singolarmente o co-coltivati aggiungendo gamma di interferone ad una concentrazione di 100 nanogrammi per millilitro e LPS ad una concentrazione di 50 nanogrammi per millilitro. Variare la durata dei tempi di trattamento in coltura in base alle esigenze. L'attivazione del macrofago avviene entro due ore e alcune soppressione mediate dal tumore si verificano di otto ore.La co-coltura per 24 ore produce una soppressione robusta e costante derivata dal tumore. Come controllo negativo, la cultura macrofagi singolarmente e non trattata. Come controllo positivo, trattare macrofagi coltivati singolarmente con gamma di interferone e LPS alle stesse concentrazioni utilizzate per i campioni.Trascorso il tempo di incubazione desiderato, isolare il lisato cellulare o condizionare il mezzo di coltura come desiderato a seconda delle esigenze di test. Per isolare il lisato cellulare per l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi, aspirare il mezzo da entrambe le camere del pozzo e lavare una volta con due millilitri di PBS. Applicare il buffer di lisi dell'RNA sulla camera superiore contenente i macrofagi.Successivamente, raschiare delicatamente la membrana per rilasciare il llysate cellulare e trasferirlo in un tubo di raccolta per un'ulteriore lavorazione secondo il protocollo del produttore del kit di isolamento dell'RNA. Il metodo di co-coltura qui descritto coinvolge la coltura di macrofagi e cellule tumorali senza contatto fisico. I macrofagi peritoneali coltivati in assenza di cellule tumorali sono usati come controlli negativi e positivi.I macrofagi peritoneali co-coltivati in presenza di cellule tumorali B16F10 ma senza attivare stimoli non aumentano l'espressione dei geni associati pro-infiammatori. Ciò implica che i ligandi secreti dal tumore non sono sufficienti per indurre l'espressione genica pro-infiammatoria da soli, o se c'è l'attivazione immunitaria da secrezioni tumorali, i ligandi paracrini sono sufficienti a sopprimerlo ai suoi livelli nativi. Questo metodo di co-coltura illustra che quando i macrofagi polarizzati da gamma di interferone e LPS sono coltivati in presenza di cellule tumorali, la soppressione dell'espressione genica associata all'infiammazione è stata ridotta fino al 60%Un livello comparabile di soppressione genica pro-infiammatoria del macrofago si osserva quando la linea cellulare del macrofago murino J774 viene sostituita dai macrofagi peritoneali.Il lavoro precedente ha identificato la proteina S come un fattore secreto dal tumore che può inibire l'attivazione del macrofago, quindi il modello di co-coltura di supporto della membrana permeabile viene utilizzato in combinazione con una lysA per saggiare la concentrazione di proteina S nei mezzi condizionati dopo 24 ore. Nei mezzi condizionati da cellule di melanoma B16F10 trattate con LPS, la proteina S è espressa in una concentrazione di circa 475 nanogrammi per millilitro. I macrofagi peritoneali trattati nelle stesse condizioni hanno espresso proteine S a circa 61 nanogrammi per millilitro.È interessante notare che, quando co-coltivata, la concentrazione della proteina S nella gamma dell'interferone e nel pozzo trattato con LPS era di circa 86 nanogrammi per millilitro. Ciò suggerisce che o i macrofagi ingeriscono la proteina S secreta dal tumore o che la quantità di proteina S secreta dalle cellule B16F10 è sostanzialmente diminuita quando in presenza di macrofagi. Questi risultati evidenziano profondi cambiamenti nell'attivazione dei macrofagi e nella segnalazione paracrina quando i macrofagi sono co-coltivati con cellule tumorali.Il metodo di cocultura di Transwell può rispondere a una varietà di domande relative alla segnalazione paracrina. L'analisi western delle macchie potrebbe essere condotta per determinare come le proteine secrete dal tumore alterino varie vie di segnalazione nei macrofagi.

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Questo video mostra un test per studiare la regolazione della fagocitosi dei macrofagi da parte delle cellule staminali mesenchimali (MSC) in una co-coltura. Dopo la co-coltura di MSC con macrofagi, vengono aggiunte particelle di zimoso non opsonizzate coniugate a un fluoroforo sensibile al pH che vengono fagocitate dai macrofagi. Con l'aumento della fagocitosi, l'intensità della fluorescenza aumenta, consentendo la determinazione della regolazione dell'attività fagocitaria mediata dalle MSC.

Un test per studiare la regolazione della fagocitosi dei macrofagi da parte delle cellule staminali mesenchimali

Qui presentiamo un protocollo per la co-coltura in tre dimensioni, che è utile per studiare le interazioni multicellulari e la modulazione dipendente dalla matrice extracellulare del comportamento delle cellule tumorali. In questo modello sperimentale, le cellule tumorali vengono coltivate su gel di collagene incorporati con fibroblasti umani associati al cancro.

Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

Comprendere il comportamento maligno del cancro richiede la creazione di modelli accurati di come le cellule tumorali interagiscono con i componenti del microambiente tumorale, come i macrofagi. Qui descriviamo due metodi per studiare l'interazione delle cellule di glioblastoma con i macrofagi e le microglia associati al tumore, dove viene valutato l'effetto sull'invasione del glioblastoma.

Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

Abbiamo adattato un inserto di membrana microporosa permeabile per imitare il microambiente tumorale (TME). Il modello è costituito da una coltura cellulare mista, consente la generazione semplificata di singole popolazioni cellulari altamente arricchite senza l'uso di marcature fluorescenti o di smistamento cellulare e consente di studiare la comunicazione intercellulare all'interno del TME in condizioni normali o di stress.

Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

Qui, descriviamo un metodo di coltura tridimensionale per analizzare la morfologia del primario del seno le cellule tumorali, come pure per studiare le interazioni diretta/indiretta con i monociti ed i risultati come degradazione del collagene, reclutamento delle cellule immuni, cell invasione e promozione dell'infiammazione legata al cancro.

Analizzando la comunicazione tra i monociti e le cellule di cancro al seno primario in una tabella extracellulare estrarre (ECME)-sistema tridimensionale basato su

Interazioni cellulari paracrine e juxtacrine gioca un ruolo importante in molti processi biologici, tra cui la progressione del tumore, le risposte immunitarie, angiogenesi e sviluppo. Qui, un metodo di coltura prossimale viene utilizzato per studiare segnalazione paracrina dove le concentrazioni localizzate dei fattori secreti sono mantenute, evitando il diretto contatto cellulare.

Un metodo di coltura prossimale per studiare segnalazione paracrina tra celle

Questo articolo rappresenta un utile saggio in vitro per valutare la capacità del mezzo condizionato dalle cellule tumorali per attirare i macrofagi.

In Vitro Analisi per studiare l'interazione tumora-macrophage

In questo studio è stata esaminata l'attività fagocitica dei macrofagi contro le cellule tumorali, in particolare le cellule carcinoma mammario dei topi da 4T1. Il modello di cocoltura a cellule vive è stato stabilito e osservato utilizzando una combinazione di microscopia a contrasto di interferenza fluorescente e differenziale. Questa valutazione è stata immaginata utilizzando un software di imaging per sviluppare video time-lapse multipunto.

Time-Lapse 2D Imaging dell'attività fagocitica in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Qui, presentiamo un protocollo per studiare l'interazione di macrofagi primari derivati da monociti umani con uno sferoide tumorale in una matrice di collagene I tridimensionale (3D), con la possibilità di confrontare l'impatto delle proprietà solubili e fisiche del microambiente sull'invasione cellulare.

Un test di co-invasione di macrofagi-tumori sferoidi

Dati i limitati modelli di xenotrapianto disponibili per studiare le interazioni tra CART umane e cellule mieloidi, abbiamo stabilito modelli in vitro e in vivo per comprendere l'impatto dei macrofagi umani sulle cellule CART. I risultati possono potenzialmente essere generalizzati per valutare i ruoli dei macrofagi nel microambiente tumorale e testare immunoterapie mirate ai macrofagi.

Studio delle interazioni tra cellule mieloidi e cellule CAR T in vitro e in vivo

Scopri la co-cultura Transwell per studiare la segnalazione paracrina tumorale e i suoi effetti immunosoppressori sui macrofagi. Questo metodo consente l'analisi dei fattori secreti senza contatto diretto tra le cellule.

Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sullattivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili (Video) | JoVE Journal

Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sull'attivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili

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