Determinazione dell'identità e della purezza delle cellule immunitarie utilizzando la PCR quantitativa basata sull'epigenetica
February 19th, 2020
Qui descriviamo un metodo robusto per determinare l'identità e la purezza delle cellule immunitarie attraverso firme epigenetiche rilevate utilizzando la PCR quantitativa (qPCR). La demetilazione del DNA in un locus specifico funge da identificatore univoco per un particolare tipo di cellula e consente l'identificazione delle cellule T CD8, normative o Th17.
Questo protocollo offre un metodo standardizzato per determinare l'identità e la purezza delle cellule immunitarie e affronta la limitazione della citometria del flusso come un grande requisito di campionamento, un'elevata variabilità da utente a utente e analisi soggettiva dei dati. Questo test include un modello di analisi automatizzata dei dati che consente agli utenti di valutare oggettivamente l'identità e la purezza delle cellule immunitarie. Questo, insieme ai molteplici controlli di dosaggio offre un metodo chiavi in mano e facilmente standardizzato per valutare l'identità e la purezza delle cellule immunitarie.
A dimostrare questa tecnica sarà Jerry Guzman, uno scienziato del nostro laboratorio. Dopo l'isolamento del DNA genomico dal campione di cellule ematopoietiche di interesse, utilizzare un microlitro del DNA genomico per misurare la purezza del campione su uno spettrofotometro ottenendo la densità ottica a 260, 280 e 230 nanometri. Successivamente diluire da 400 a 1200 nanogrammi di campione di DNA genomico a un volume finale di 142 microlitri con tampone di eluizione da un kit di isolamento genomico del DNA.
Aggiungere 75 microlitri del calibratore a 67 microlitri di tampone di eluizione. E diluire 1200 nanogrammi del DNA genomico di riferimento a un volume totale di 142 microlitri con tampone di eluizione. Quindi incubare i tubi per cinque minuti a 56 gradi Celsius e 900 giri al minuto in un miscelatore termico.
Per la conversione della bisolfito, aggiungere 270 microlitri di bisolfito di ammonio e 90 microlitri di THFA a tutti i tubi. E vortice i tubi per garantire una miscelazione accurata. Far girare brevemente i campioni per raccogliere il liquido e posizionare i tubi nel miscelatore termico per 45 minuti a 80 gradi Celsius e 900 giri al minuto.
Quindi far girare brevemente di nuovo i campioni e consentire loro di raffreddare a temperatura ambiente per tre o cinque minuti. Per la purificazione del DNA dopo la conversione della bisolfito, vortice le perline paramagnetiche di isolamento del DNA per 30 secondi. Aggiungere etanolo e isopropanolo ai tamponi di lavaggio in base ai volumi elencati sulle bottiglie.
Vortice di nuovo fino a quando le perline sono completamente rimescolate e a 870 microlitri di tampone legante di lysis e 105 microlitri del DNA che legano perline paramagnetiche ad ogni tubo. Vortice i tubi da mescolare prima di girare brevemente i campioni. Aggiungere 570 microlitri di 2-propanolo ad ogni tubo e mescolare con vortici.
Incubare i tubi per sette minuti a temperatura ambiente e 50 giri/min al minuto prima di far girare brevemente di nuovo i tubi e posizionarli su un rack magnetico per cinque minuti. Alla fine dell'incubazione rimuovere il supernate senza disturbare le perline. Lavare il campione con tampone 1 e vortice i tubi.
Dopo una breve centrifugazione riposizionare i tubi nel rack per tre minuti e rimuovere il supernate senza disturbare le perline. Lavare il campione due volte con tampone di lavaggio 2 e asciugare i tubi a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, aggiungere 60 microlitri buffer di evoluzione ad ogni tubo.
Dopo sette minuti di incubazione a temperatura ambiente e 1400 rotazioni al minuto, girare brevemente i tubi e riportare i tubi al magnete per due minuti. Al termine dell'incubazione trasferiscono 55 microlitri del DNA convertito in bisolfito contenente in un nuovo tubo senza disturbare le perline. Per eseguire pcr quantitativi sui campioni, assegnare a ciascuno standard lo standard di attività nel software PCR quantitativo e specificare i numeri di copia finale in base alla tabella.
Preparare diluizioni seriali del DNA standard e preparare un cocktail di master mix PCR quantitativo per il tipo di cellula target. E un cocktail mix master PCR quantitativo per GAPDH, secondo la tabella. Caricare tre microlitri del DNA del modello nei pozzi appropriati di una piastra inferiore a 96 angoli ben arrotondati seguita da sette microlitri di master mix.
Quando tutti i pozzi sono stati caricati sigillare la piastra con pellicola PCR quantitativa e ruotare brevemente la piastra prima di caricarla sullo strumento PCR quantitativo. Quindi eseguire la reazione come indicato nella tabella. Al termine dell'esecuzione, esportare i dati quantitativi pcr come file txt o xlsx.
Dopo aver purificato il DNA convertito con bisolfito con battiti paramagnetici come dimostrato, elute 25 microlitri del DNA. Trasferire il DNA convertito dalla bisolfito in un nuovo tubo e aggiungere due microlitri del campione in singoli tubi a strisce PCR. Aggiungere due microlitri d'acqua a un tubo di controllo senza modello e preparare la miscela principale di preamplificazione per tutti i campioni in base alla tabella.
Aggiungere 23 microlitri di master mix a ciascun tubo e cappuccio, vortice e far girare brevemente i tubi. Quindi eseguire il protocollo di preamplificazione su un termociclore utilizzando un coperchio riscaldato. Al termine della corsa, far girare brevemente i tubi e trasferirli ai microlitri del DNA amplificato in nuovi tubi.
Quindi diluire i campioni con 78 micro litri di acqua a una concentrazione da uno a 40 ed eseguire una PCR quantitativa dei campioni come dimostrato. Qui vengono mostrati i dati rappresentativi di un saggio di cellule CD8+T ottenuti analizzando sia il sangue periferico, le cellule mononucleari, sia le cellule T di tre diversi donatori usando sia la citometria a flusso che i saggi di metilazione. Le tendenze tra i due metodi tra tutti i donatori in entrambi i tipi di cellule erano simili.
Questi dati rappresentativi del saggio Treg mostrano anche risultati simili tra i metodi. Tuttavia, in tutti i casi, questo saggio di metilazione ha prodotto valori più elevati sia in condizioni stimolate che non stimolate. La sensibilità e la specificità di ogni saggio sono state dimostrate dai valori limite di vuoto, limite di rilevamento e limite di quantificazione.
Poiché questo test offre un modello di analisi dei dati automatizzato, migliora l'analisi obiettiva e aumenta le capacità di standardizzazione. Questo è l'ideale per la produzione di terapia cellulare in cui i metodi standardizzati sono cruciali per la creazione di un prodotto di terapia cellulare coerente.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo standardizzato per determinare l'identità e la purezza delle cellule immunitarie utilizzando firme epigenetiche rilevate mediante PCR quantitativa (qPCR). Il metodo affronta i limiti della citometria a flusso e offre un modello di analisi dei dati automatizzato per una valutazione obiettiva.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Epigenetica
Sfondo
- I metodi tradizionali come la citometria a flusso presentano limiti come alta variabilità e grandi requisiti di campioni.
- Le firme epigenetiche possono servire come identificatori unici per specifici tipi di cellule immunitarie.
- La standardizzazione nell'analisi cellulare è cruciale per risultati coerenti nella ricerca e nella terapia.
- Questo metodo migliora l'affidabilità della caratterizzazione delle cellule immunitarie.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo robusto per identificare e valutare la purezza delle cellule immunitarie.
- Fornire un'alternativa alla citometria a flusso che minimizzi la variabilità dell'utente.
- Migliorare la standardizzazione dei saggi nella produzione di terapia cellulare.
Metodi utilizzati
- Isolamento di DNA genomico da campioni di cellule ematopoietiche.
- Conversione bisolfito per l'analisi della metilazione del DNA.
- PCR quantitativa per misurare le firme epigenetiche.
- Analisi automatizzata dei dati per una valutazione obiettiva dei risultati.
Principali risultati
- Il saggio di metilazione ha mostrato valori più elevati rispetto alla citometria a flusso attraverso diversi tipi di cellule.
- Tendenze simili sono state osservate nei saggi per cellule T CD8+ e cellule T regolatorie.
- Il saggio ha dimostrato elevata sensibilità e specificità.
- L'analisi automatizzata ha migliorato l'obiettività e la standardizzazione dei risultati.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un'alternativa affidabile per l'analisi delle cellule immunitarie.
- La standardizzazione migliora la riproducibilità dei risultati nella ricerca.
- L'approccio è vantaggioso per le applicazioni nella produzione di terapia cellulare.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Accurate immune cell identity and purity assessment is critical for cell therapy development, impacting both product consistency and regulatory compliance. This epigenetic-based qPCR method addresses the limitations of flow cytometry by enabling objective, high-throughput, and standardized quantification of immune cell subtypes. Its robust, automated analysis supports reliable in-process and product release testing, enhancing predictive confidence at key manufacturing inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables objective quantification of immune cell subtypes for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by leveraging cell-type specific epigenetic markers.
- Supports predictive confidence in immune cell-based therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated immune cell populations for downstream assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through automated data analysis.
- Enables high-throughput, quantitative assessment of cell identity and purity.
- Supports reliable evaluation of cell therapy product attributes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell characterization with translational biomarker requirements.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by standardizing cell identity assessment.
- De-risks advancement decisions by providing robust, quantitative purity data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the cell therapy pipeline from early discovery through manufacturing quality control, supporting both lead identification and product release.
- Discovery Biology: Provides quantitative, cell-type specific data for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers standardized, reproducible outputs suitable for high-throughput workflows.
- Analytics: Generates quantitative purity and identity metrics for cross-condition comparison.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized platform for immune cell analysis across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological risk in cell therapy development.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in immune cell characterization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, objective data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of cell therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genomic DNA isolation, bisulfite conversion, and qPCR analysis.
- Needs access to spectrophotometry, thermal mixers, magnetic racks, and qPCR instrumentation.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis templates.
- Adaptation may be needed for different immune cell subtypes or sample sources.
- Assay sensitivity and specificity are defined by established limits of blank, detection, and quantitation.
