Name: Optocardiografia ed elettrofisiologia Studi di Ex Vivo Langendorff-perfusi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Scopri l'optocardiografia e l'elettrofisiologia su cuori di suino isolati con perfusione Langendorff. Questo metodo combina mappatura ottica del voltaggio transmembrana e calcio intracellulare per studiare la dinamica cardiaca.

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Gli autori riconoscono con gratitudine il Dr. Matthew Kay per una guida sperimentale utile, e Manelle Ramadan e Muhaymin Chowdhury per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (R01HL139472 a NGP, R01 HL139712 a NI), Dall'Istituto nazionale di ricerca per bambini, dall'Istituto Nazionale del Cuore dei Bambini e dall'Istituto Sheikh s'ayed per l'innovazione chirurgica.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Anche se i modelli di ricerca cardiovascolare vanno dai preparati cellulari ai preparati in vivo, c'è un compromesso intrinseco tra rilevanza clinica e utilità sperimentale. In questo spettro, il cuore isolato Langendorff-perfuso rimane un compromesso utile per studiare la fisiologia cardiaca48. L'intero modello cardiaco rappresenta un livello più elevato di integrazione funzionale e strutturale rispetto ai monostrati a cella singola o a tessuto, ma evita anche le complessità confuse associate ai modelli in vivo. Un grande vantaggio durante la doppia mappatura ottica è che la superficie epicardiale del cuore isolato può essere osservata, e l'imaging a fluorescenza del potenziale transmembrana e della manipolazione del calcio può essere utilizzato per monitorare la fisiologia cardiaca34.
I modelli di roditori sono più comunemente utilizzati per preparazioni cardiache isolate rispetto agli animali più grandi, in parte a causa del costo associato di up-sizing di tutti gli elementi coinvolti (ad esempio, volume della soluzione, circuito di perfusione, quantità di coloranti e disaccoppiatori meccanici) insieme a una maggiore instabilità e propensione per le aritmie in animali più grandi10,36,49. Un vantaggio dell'uso dei cuori di maiale è che assomigliano strettamente al cuore umano nella struttura, nelle dimensioni e nella velocità di contrazione, modellando quindi in modo più accurato parametri emodinamici come il flusso sanguigno coronavo e l'uscita cardiaca. Allo stesso modo, gli esseri umani e i maiali hanno una gestione simile del calcio, intervalli di elettrocardiogramma37e una morfologia potenziale di azione compresi i canali sottostanti che rappresenta12,50,51, 52. Questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per la creazione di un modello animale di grandi dimensioni riproducibile per caratterizzare in modo completo la funzione miocardio. L'imaging simultaneo della tensione transmembrana (RH237) e del calcio intracellulare (Rhod2), utilizzato in combinazione con protocolli elettrofisiologici stabiliti, offre l'opportunità di individuare i meccanismi responsabili di Funzione. La metodologia descritta può essere utilizzata per test di sicurezza preclinici, screening tossicologico e lo studio di patologie genetiche o di altro tipo. Inoltre, la metodologia descritta può essere modificata e adattata per l'uso con altri modelli cardiaci (ad esempio, canino, umano) a seconda dello specifico focus di ricerca53,54,55.
Ci sono alcune modifiche critiche da tenere a mente quando si passa da un modello di roditore più piccolo a un modello di maiale più grande per preparazioni isolate e intere del cuore. Durante la preparazione e la configurazione, si consiglia di aggiungere albumina al perfusate per mantenere la pressione oncotica e ridurre l'edema (più antifoam, se necessario)56,57,58,59. Inoltre, la perfusate contenente albumina può anche aiutare in studi metabolici che richiedono anche il completamento dell'acido grasso ai media60,61. A differenza dei cuori dei roditori, il cuore di maiale più grande non ha bisogno di essere immerso nei supporti caldi a causa del suo rapporto superficie-volume più piccolo e dell'aumento del volume dei supporti riscaldati che scorre attraverso i vasi coronarici che meglio mantiene la temperatura. Come notato in precedenza, abbiamo posizionato sonde di temperatura all'interno del ventricolo destro e sulla superficie epicardiale dei ventricoli destro e sinistro, osservando solo lievi fluttuazioni di temperatura di 1o2 gradi centigradi in tutte e tre le posizioni in tutto lo studio. È importante sottolineare che tali flussi più veloci possono anche aumentare la probabilità di bolle e una potenziale embolia. Per aggirare questo problema, si consiglia di utilizzare una trappola a bolle con grandi tubi di foro che conducono direttamente alla cannula aortica. Allo stesso modo, abbiamo trovato più utile avere due individui che lavorano in tandem per cannulare l'aorta su un cuore più grande (e più pesante); una persona per tenere l'aorta aperta con robusti emostati e un'altra per fissare l'aorta alla canula con nastro ombelicale. Nella metodologia descritta, abbiamo scoperto che la perfusione con cardioplegia e defibrillazione era vitale per il recupero cardiaco, il che è contrario ai preparati cardiaci dei roditori. Nella nostra esperienza, solo pochi cuori ascisi ripresero la normale attività guidata dal sino senza cardioversione.
Per migliorare gli endpoint dell'imaging ottico, una preparazione del cuore appeso ha limitato l'effetto dell'abbagliamento che può verificarsi con un cuore sommerso. Inoltre, il cuore appeso evita anche qualsiasi compressione o compromesso dei vasi coronarici sull'aspetto posteriore del cuore che può verificarsi quando si posa il cuore orizzontalmente per l'imaging verticale. Abbiamo anche scoperto che il caricamento di coloranti fluorescenti dopo la trappola a bolle (vicino alla cannula aortica) ha notevolmente migliorato la colorazione dei tessuti e i segnali ottici. Infine, per migliorare gli endpoint di elettrofisiologia cardiaca, l'uso di un elettrodo di stimolazione coassiale più grande ha facilitato il pacing atriale di successo. Anche se descriviamo l'uso di elettrocardiogrammi per identificare la cattura e la perdita di cattura per vari parametri EP, possono essere utilizzati anche cateteri intracardiaci o elettrodi di registrazione bipolari.
Il nostro studio si è concentrato sullo sviluppo di una metodologia per la doppia mappatura ottica e la valutazione elettrofisiologica cardiaca in un modello di cuore di porcina isolato e intatto. A causa di somiglianze con il cuore umano giovanile, il cuore porcina rimane un modello popolare per gli studi incentrati sulla cardiologia pediatrica o difetti cardiaci congeniti. È importante sottolineare che l'approccio descritto può essere adattato per l'uso con cuori adulti di dimensioni maggiori e/o diverse specie di interesse. Infatti, altri laboratori possono scoprire che l'uso di cuori canini o umani (donatore o malato) sono più applicabili per il loro specifico focus di ricerca53,54,55. Un'altra potenziale limitazione a questo studio è l'uso di un disaccoppiatore meccanico per ridurre l'artefatto di movimento durante l'imaging. Blebbistatin è diventato lo scollegatore di scelta nelle applicazioni di imaging cardiaco grazie ai suoi effetti minimi sui parametri ECG, l'attivazione e i periodi refrattari41,62,63. BDM è una scelta meno costosa, che può essere particolarmente importante negli studi sugli animali di grandi dimensioni che richiedono maggiori volumi di perfusate e uncoupler meccanico, ma è noto per avere un maggiore impatto sulle correnti di potassio e calcio che possono alterare il potenziale di azione morfologia64,65,66,67. Se si utilizza BDM, si noti che l'accorciamento APD aumenta la vulnerabilità dei cuori agli arrythmias68indotti da urti . Al contrario, la principale limitazione all'uso della blebbistatin è la sua fotosensibilità e fototossicità, anche se formulazioni alternative che hanno ridotto questi effetti69,70,71. Infine, la metodologia descritta utilizza un unico sistema di telecamere per la doppia mappatura ottica, ma è importante notare che gli studi di ricerca si sono concentrati sulla fibrillazione ventricolare e/o sul tracciamento delle onde elettriche attraverso la superficie epicardiale dovrebbe modificare questo approccio per includere l'imaging panoramico tridimensionale, come descritto dagli altri15,19,72,73,74,75 .

Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di malattia e morte in tutto il mondo. Come tale, un obiettivo di ricerca primaria è quello di ottimizzare le metodologie che possono essere utilizzate per studiare la fisiologia cardiaca normale e meccanismi sottostanti che possono contribuire alla morbilità e mortalità negli esseri umani. La ricerca cardiovascolare di base si è tradizionalmente affidata a piccoli modelli animali, tra cui roditori e conigli1,2,3, a causa della disponibilità di specie geneticamente modificate4,5, minore costo, ingombro sperimentale più piccolo e una maggiore produttività. Tuttavia, l'uso di un modello di suina ha il potenziale per fornire dati più rilevanti dal livello clinico6. Infatti, studi precedenti hanno documentato somiglianze nell'elettrofisiologia cardiaca (EP) tra esseri umani e suini, tra cui correnti ioniche simili7, forma potenziale di azione8e risposte ai test farmacologici9. Inoltre, il cuore porcina ha cinedi contrattili e relax che sono più paragonabili agli esseri umani di roditori o conigli10. Rispetto a un modello canino, l'anatomia coronaria porcina assomiglia più da vicino a un cuore umano11,12 ed è il modello di scelta per studi incentrati sullo sviluppo del cuore, cardiologia pediatrica e/o difetti cardiaci congeniti 13.Anche se ci sono differenze tra il maiale e il cuore umano8, queste somiglianze rendono il cuore di porcina un modello prezioso per la ricerca cardiovascolare14.
La perfusione retrograda del cuore è diventata un protocollo standard per lo studio delle dinamiche cardiache ex vivo15 dalla prima fondazione da Oskar Langendorff16. Di conseguenza, Langendorff-perfusione può essere utilizzato per sostenere un cuore isolato e intatto in assenza di influenze autonome. Questo modello è uno strumento utile per confrontare direttamente l'elettrofisiologia cardiaca e la contrattilità tra cuori sani e non sani. Poiché le dinamiche cardiache sono complesse sia dal tempo che dallo spazio, una leggera alterazione in una regione può influenzare drammaticamente la capacità dell'intero cuore di funzionare come sincitio17. Pertanto, l'imaging spatiotemporale elevato di coloranti sensibili ai parametri è uno strumento utile per monitorare la funzione cardiaca sulla superficie del cuore18,19. Infatti, la doppia imaging simultanea di sonde fluorescenti sensibili alla tensione e al calcio consente la valutazione dell'attività elettrica, la manipolazione del calcio e l'accoppiamento di contrazione di eccitazione a livello tissutale20,21, 22,23,24,25,26,27,28. Le tecniche di mappatura langendorff-perfusione e/o ottica sono state precedentemente utilizzate per documentare il declino delle prestazioni cardiache dovuto all'invecchiamento o alle mutazioni genetiche e per valutare la sicurezza degli agenti farmacologici o delle esposizioni ambientali29 ,30,31,32,33.
In ambito clinico, uno studio di elettrofisiologia cardiaca invasivo viene spesso utilizzato per studiare disturbi del ritmo cardiaco, identificare patologie e individuare possibili opzioni di trattamento. Allo stesso modo, descriviamo un protocollo EP che può essere utilizzato per valutare la funzione del nodo del seno, misurare la conduzione atrioventricolare e identificare la refrattanza del tessuto miocardico. Lo studio EP descritto può essere eseguito in combinazione con la mappatura ottica, o optocardiografia34, per caratterizzare completamente la fisiologia cardiaca nei cuori isolati. Nel protocollo descritto, l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione spatiotemporale è stato eseguito con una combinazione di coloranti di tensione (RH237) e calcio (Rhod-2AM) in una configurazione a doppia emissione. Inoltre, i parametri di elettrofisiologia cardiaca sono stati monitorati sia sotto il ritmo del sinusale che in risposta alla stimolazione elettrica programmata.

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560-5MG</td><td>Disaccoppiatore meccanico</td></tr><tr><td>2,3-Butandione monoxime (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753-100G</td><td>Disaccoppiatore meccanico</td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Interfaccia segnale analogico</td><td>emka Technologies</td><td>itf16USB</td><td></td></tr><tr><td>Antischiuma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5758-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Emulsione antischiuma Y-30</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A5758</td><td></td></tr><tr><td>Cannula aortica, 5/16"</td><td>Cole-Parmer</td><td>45509-60</td><td></td></tr><tr><td>Trappola a bolle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641U-100EA</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>C77-500</td><td></td></tr><tr><td>Camera, sCMOS</td><td>Andor Technology</td><td>Zyla 4.2 PLUS</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo di stimolazione coassiale (atri)</td>Defibrillatore <td>Harvard Apparatus</td><td>73-0219</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zoll</td><td>Serie</td><td></td>M</tr><tr><td>Specchio dicroico</td><td>Tecnologia Chroma</td><td>T660lpxrxt-UF2</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore differenziale</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-304A</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione, calcio</td><td>Chroma Technology</td><td>ET585/40m</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione, tensione</td><td>Chroma Technology</td><td>ET710lp</td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore EP (Bloom)</td><td>Fisher Medical</td><td>DTU-215B</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione</td><td>Chroma Technology</td><td>CT510/60bp</td><td></td></tr><tr><td>Luci di eccitazione</td><td>Thorlabs</td><td>SOLIS-525C</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>McMaster-Carr</td><td>8147K52</td><td></td></tr><tr><td>Cartuccia filtrante, polipropilene</td><td>Pentair</td><td>PD-5-934</td><td></td></tr><tr><td>Alloggiamento filtro</td><td>McMaster-Carr</td><td>9979T21</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore</td><td>di flusso Transonic</td><td>ME6PXN</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>Serpentina di riscaldamento</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Emofiltro</td><td>Hemocor</td><td>HPH 400</td><td></td></tr><tr><td>Pinze emostatiche</td><td>World Precision Instruments</td><td>501326</td><td></td></tr><tr><td>Image Splitter</td><td>Cairn Research</td><td>OptoSplit II</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>423-316</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di grande diametro, ID 3/8"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-169-7H</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo 50 mm, 0,95 f-stop</td><td>Navitar</td><td>DO-5095</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Allineamento dell'immagine</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>Detergente Mucasol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z637181-2L</td><td></td></tr><tr><td>Na Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ</td><td>S-233</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi ad ago 29 G, 2 mm</td><td>AD Instruments Inc.</td><td></td><td></td>MLA1204</tr><tr><td>Eliminatore di rumore</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td>Pompa</tr> di <tr><td>perfusione</td><td>PolyStan</td><td>A/S 1481</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore di pressione</td><td>World Precision Instruments</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio, 2 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-34541-07</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21480</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2-AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo di stimolazione (ventricolo)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0160</td><td></td></tr><tr><td>Sutura chirurgica</td><td>McKesson Medico-Chirurgico</td><td>890186</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore amplificatore</td> World <td>Precision Instruments</td><td>TBM4M</td><td></td></tr><tr><td>Console di flusso per tubi</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Nastro ombelicale</td><td>Jorvet</td><td>J0025UA</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria/circolatore</td><td>VWR</td><td>89400-970<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Strumenti chirurgici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici per bende</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8448</td><td>Lister Forbici per bende, angolate, smussate/smussate, lunghezza lama 42,0 mm, 17,0 cm</td></tr><tr><td>Elettrocauterizzazione</td><td>Dalwha Corp. Ltd.</td><td>Modello BA2ALD001</td><td>: 200</td></tr><tr><td>Emostatico</td> di base <td>Roboz</td><td>RS-7476</td><td>Pinza occludente a tubo St Vincent Pinze</td></tr><tr><td>emostatiche</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>72-8960</td><td>Pinza emostatica Hartmann, curva, seghettata Larghezza punta 2,2 mm, emostatici 9,5 cm</td></tr><tr><td></td><td>Apparato Harvard</td><td>72-8985</td><td>Pinze emostatiche Halstead-Mosquito Curve, seghettate, punta 2 mm</td></tr><tr><td>Forbici Mayo</td> da 14 cm<td>WPI</td><td>501749</td><td>14,5 cm, forbici Metzenbaum diritte</td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>501747</td><td>11,5 cm,</td></tr><tr><td>pinze per zanzare</td> dritte <td>Apparecchio Harvard</td><td>72-8980</td><td>Pinze emostatiche Halstead-Mosquito Dritte, lisce, larghezza punta 2 mm 12 cm</td></tr><tr><td>Porta aghi</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>72-8828</td><td>Portaaghi Webster, dritto, liscio, lunghezza totale 13,0 cm</td></tr><tr><td>Croce pediatrica morsetto</td><td>Roboz</td><td>RS-7660</td><td>Cooley-Derra Morsetto 6,25" 5 mm Calibrazioni</td></tr><tr><td>Pinze ad angolo retto</td><td>WPI</td><td>501240</td><td>Baby Mixter Pinze emostatiche, 14 cm, bisturi ad angolo retto</td></tr><tr><td></td><td>Ted Pella</td><td>549-4</td><td>Manico per bisturi n. 4, 13,7 cm in acciaio inossidabile e 10 lame n. 22</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8380</td><td>Forbici operative, dritte, smussate/smussate, lama da 42 mm, 12 cm</td></tr><tr><td>Pinza seghettata dritta</td><td>WPI</td><td>500363</td><td>Pinza per medicazione 15,5 cm</td></tr><tr><td>Pinza per asciugamani</td><td>WPI</td><td>501700</td><td>Pinza per asciugamani Backhaus, 13 cm, curva, maniglia di bloccaggio,</td></tr><tr><td>divaricatore SS Weitlaner</td><td>WPI</td><td>501314</td><td>divaricatore Weitlanger, autobloccante, 10,2 cm, 2x 3 rebbi affilati</td></tr><tr><td><forte>monouso</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-0 prolene sutura</td><td>Fornitori vari Fornitori</td><td>vari Loop</td><td></td></tr><tr><td>per vasi</td><td>Aspen surgical</td><td>011001PBX</td><td>Sterion&reg; Ansa per vasi, 0,8 mm x 406 mm</td></tr><tr><td>Cardioplegia (Plegisol)</td><td>Pfizer</td><td>00409-7969-05</td><td>Plegisol; Soluzione per cardioplegia cristalloide St Thomas 20 mL/kg</td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Fornitori vari</td><td>Fornitori vari</td><td>300 U/kg</td></tr><tr><td>Siringa e ago</td><td>Fornitori vari Fornitori</td><td>vari</td><td>60 mL e 18 G rispettivamente</td></tr><tr><td>Nastro ombelicale</td><td>Ethicon</td><td>U12T</td><td></td></tr></tbody></table>

optocardiografia ed elettrofisiologia studi di ex vivo langendorff-perfusi

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

I modelli animali di piccole dimensioni sono più comunemente utilizzati nella ricerca cardiovascolare a causa della disponibilità di specie geneticamente modificate e dei costi inferiori rispetto agli animali più grandi. Eppure, i mammiferi più grandi sono più adatti per domande di ricerca traslazionale relative alla fisiologia cardiaca normale, alla fisiofisiologia e ai test preclinici degli agenti terapeutici. Per superare le barriere tecniche associate all'impiego di un modello animale più grande nella ricerca cardiaca, descriviamo un approccio per misurare i parametri fisiologici in un cuore di maialino isolato e perfuso da Langendorff. Questo approccio combina due potenti strumenti sperimentali per valutare lo stato del cuore: studio di elettrofisiologia (EP) e mappatura ottica simultanea di tensione transmembrana e calcio intracellulare utilizzando coloranti sensibili ai parametri (RH237, Rhod2-AM). Le metodologie descritte sono adatte per studi traslazionali che studiano il sistema di conduzione cardiaca, alterazioni nella morfologia potenziale d'azione, gestione del calcio, accoppiamento di contrazione eccitazione e l'incidenza di alternanze cardiache o Aritmia.

Figura 1A mostra un diagramma del sistema di perfusione cardiaca isolato, che comprende il circuito tubo, pompa, filtro, ossigenatore, serbatoi ed elementi di riscaldamento. Il posizionamento degli elettrodi ECG (configurazione lead II) e della stimolazione è illustrato nella Figura 1Be la configurazione dell'immagine è illustrata nella Figura 1C. Uno schema dei componenti ottici e dei percorsi luminosi è illustrato nella Figura 1D.
Sono stati condotti studi sperimentali su cuori interi intatti e isolati dai giovani maiali dello Yorkshire (14-42 giorni, n - 18) che variavano in dimensioni da 2,5,10 kg di peso corporeo e 18-137 g di peso cardiaco (Figura 2A). Dopo aver trasferito il cuore isolato in un sistema Langendorff (37 gradi centigradi), la frequenza cardiaca si è stabilizzata a 70 s 4,5 bpm (media : SEM) entro 10 min di defibrillazione e rimase costante per tutta la durata dello studio (Figura 2B). È stata misurata una portata media di 184 mL/min (media e SEM), che è rallentata a 70 , 7 mL/min, dopo la perfusing con supporti riscaldati contenenti un disaccoppiatore meccanico (Figura 2C).
Gli ECG di piombo II sono stati registrati per tutta la durata dello studio durante il ritmo del sinusale(Figura 3A) o in risposta al ritmo esterno (Figura 3B-E) per quantificare i parametri elettrofisiologici. Per la valutazione dell'EP, all'atrio destro è stato applicato il ritmo dinamico (S1-S1) per individuare il WBCL e la SNRT (tempo di recupero dopo l'inizio di S1-S1, Figura 3C),in cui la WBCL è stata indicata come la PCL più breve che ha avviato la conduzione atriale alla conduzione ventricolare. Un protocollo di stimolazione S1-S2 è stato implementato utilizzando un elettrodo di stimolo bipolare sul ventricolo sinistro al fine di identificare l'intervallo di accoppiamento più breve che ha iniziato la depolarizzazione ventricolare, individuando così VERP (Figura 3D). In alternativa, viene applicato un protocollo di ritmo atriale S1-S2 per individuare AVNERP (S1-S2), come illustrato nella Figura 3E. Esempi rappresentativi di parametri di elettrofisiologia del cuore di maiale si allineano strettamente con quelli precedentemente pubblicati37.
Gli esperimenti di mappatura ottica sono stati eseguiti durante il ritmo del sinusoio, la fibrillazione ventricolare spontanea (Figura 4),o durante il ritmo dinamico (S1-S1) del ventricolo sinistro (LV) per generare curve di restituzione elettriche e calcio Figura 5. Immagini rappresentative di un cuore di maialino carico di tintura sono mostrate nella Figura 4 con i corrispondenti potenziali di azione ottica (Vm) e calcio (Ca) transitori raccolti da due regioni di interesse sulla superficie epicardiale (ventricolo destro [RV] - blu, LV - rosso) . I segnali non elaborati vengono visualizzati durante il ritmo del senzio e durante la fibrillazione ventricolare. Come accennato in precedenza, durante gli esperimenti di mappatura ottica è stato utilizzato anche il ritmo epicardiale dinamico (S1-S1) per normalizzare qualsiasi leggera differenza nellafrequenza cardiacaintrinseca ( Figura 5A-E). Vengono visualizzati i segnali grezzi (RV - blu, LV - rosso), che sono stati utilizzati per rappresentare il potenziale di azione - tempo di accoppiamento transitorio di calcio (Figura 5C), attivazione e durata (Figura 5D), restituzione elettrica e restituzione del calcio (Figura 5E). Per le preparazioni miocardiche spesse, il filtraggio spaziale con dimensione del kernel 3 mm x 3 mm è appropriato per il potenziale di azione epicardiale o l'analisi transitoria del calcio19,47. Di conseguenza, le immagini ad alta risoluzione spaziale (nell'impostazione descritta 1240 x 1024 totale, o 620 x 512 per canale, dimensione dei pixel di 6,5 m) sono spesso collocate spazialmente durante o dopo l'acquisizione (Figura 5C). L'elaborazione delle immagini può essere eseguita per generare mappe di attivazione e ripolarizzazione utilizzando algoritmi personalizzati23,33,43,45 ( Figura3D), con il tempo di attivazione di ogni pixel sul cuore è stato definito come il derivato massimo del potenziale di azione o upstroke transitorio di calcio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig01.jpg"> Figura 1: Configurazione sperimentale. (A) Diagramma del sistema di perfusione cardiaca isolato; frecce indicano la direzione del flusso. (B) Un cuore cannulato è mostrato con posizionamento elettrodo. RA - atria destra, RV - ventricolo destro, LV - ventricolo sinistro, elettrocardiogramma di piombo II. (C) La piattaforma di imaging in prossimità del tessuto cardiaco. (D) L'emissione di ogni sonda complementare (tensione, calcio) è separata dalla lunghezza d'onda utilizzando un dispositivo di scissione dell'immagine con filtri di emissione appropriati e specchio dicroico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig02.jpg"> Figura 2: Misurazioni del peso cardiaco, della frequenza e del flusso. (A) Rapporto peso cardiaco/peso corporeo per ogni suinio utilizzato nello studio (n - 18). (B) La frequenza cardiaca misurava 10 min dopo la defibrillazione e di nuovo alla fine dello studio (circa 1 h). (C) Il flusso coronario scende precipitosamente dopo la perfusione con un disaccoppiatore meccanico (BDM) a causa della ridotta domanda di ossigeno. Le barre della scala <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig02large.jpg" target="_blank"></a> rappresentano la media : SEM.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig03.jpg"> Figura 3: Esempi rappresentativi delle registrazioni di elettrocardiogramma di piombo II raccolte durante il ritmo del sinusale o in risposta al ritmo esterno. (A) Ritmo del peccato normale. (B) Esempio di ritmo epicardiale alla durata del ciclo di 400 ms ( S1-S1), che è stato utilizzato per esperimenti di imaging. (C) Top: Atrial pacing per identificare WBCL; l'acquisizione riuscita viene osservata a S1 - 250 ms in cuiin atriale a conduzione ventricolare è osservato. Si noti che il ritmo atriale può essere utilizzato per determinare SNRT (tempo di scarico del nodo del sino, dopo l'inizio del ritmo esterno). In basso: Come la lunghezza del ciclo S1 è diminuita a 205 ms, la conduzione al ventricolo fallisce. (D) Superiore: Stimolazione Epicardiale (S1-S2) per identificare VERP; l'acquisizione riuscita viene osservata a S1 - 450 ms, S2 - 300 ms. Bottom: Poiché la lunghezza del ciclo S2 viene ridotta a 250 ms, il tessuto ventricolare non riesce a catturare. (E) Atrial pacing (S1-S2) per identificare AVNERP. In alto: l'acquisizione riuscita viene osservata a S1 - 450 ms, S2 - 200 ms. In basso: Quando la lunghezza del ciclo S2 viene ridotta a 199 ms, la conduzione al ventricolo ha esito negativo. Le frecce blu indicano picchi di stimolazione, le frecce rosse indicano la cattura ('C') o nessuna cattura ('NC'). S1-S1 - ritmo dinamico, S1-S2 - stimolazione extrastimolante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig04.jpg"> Figura 4: Dati ottici durante il ritmo del senno e la fibrillazione ventricolare. Sinistra: immagini rappresentative di un cuore di maiale carico di tintura (Vm - tensione, RH237; Ca - calcio, Rhod2), vista anteriore. Tensione transmembrana filtrata spazialmente e segnali fluorescenti intracellulari del calcio da un cuore di maiale durante il ritmo del senno (centro). Segnali di tensione e calcio durante la fibrillazione ventricolare (destra). Dimensioni della regione del segnale (15 x 15 x 2,4 x 2,4 mm2, 30 x 30 x 4,8 x 4,8 mm2 dimensioni del kernel) rappresentate come quadrati rossi e blu. Unità : F/F. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60472/60472fig05.jpg"> Figura 5: Dati ottici provenienti da cuori di maiale langendorff-perfusi. La tensione transmembrana non lavorata, filtrata spazialmente (A) e (B) la fluorescenza intracellulare del calcio da destra e sinistra durante il ritmo elettrico all'apice. I segnali non filtrati e mediati nello spazio raffigurano i potenziali di azione ottica e i transitori di calcio provenienti da regioni di interesse (le unità di segnale sono f/F. (C) Una sovrapposizione di transitori normalizzati illustra il tempo di accoppiamento transitorio potenziale calcio (basso passaggio filtrato a 75 Hz). (D) Elaborazione dei segnali attraverso la superficie epicardiale per generare mappe isocroniche di parametri temporali, inclusi il tempo di attivazione (tact) e l'80% del tempo di ripolarizzazione. (E) Curve di restituzione transitorie elettriche e di calcio generate a più frequenze (a sinistra) con analisi statistica (a destra) per illustrare tempi di ripolarizzazione più lunghi a cicli di stimolazione più lenti. Barre di scala - media - SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60472/60472fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Chimica</td>
			<td>Formula</td>
			<td>Peso molecolare</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro di sodio</td>
			<td>Nacl</td>
			<td>58.44</td>
			<td>5.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gluconato di sodio</td>
			<td>C6H11NaO7
</td>
			<td>218.14</td>
			<td>5.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>Triidrato di acetato di sodio</td>
			<td>C2H3NaO2s3H 2O</td>
			<td>136.08</td>
			<td>3.68</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro di potassio</td>
			<td>Kcl</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloruro di magnesio (anidroso)</td>
			<td>MgCl2
</td>
			<td>95.21</td>
			<td>0.1405</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,4% bicarbonato di sodio</td>
			<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mannitolo</td>
			<td>C6H14O6
</td>
			<td>182.17</td>
			<td>16.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solfato di magnesio</td>
			<td>MGSO4
</td>
			<td>120.37</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Osmolarità (mOsmol/L)</td>
			<td>294</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Ricetta di cardioplegia di del Nido modificata.

L'obiettivo di questo studio era quello di stabilire un metodo per studiare le dinamiche cardiache utilizzando un modello animale traslazionale. L'approccio sperimentale descritto incorpora l'optocardiografia a doppia emissione in combinazione con uno studio elettrofisiologico per valutare l'attività elettrica in un modello cardiaco porcina isolato e intatto.

Optocardiografia ed elettrofisiologia Studi di Ex Vivo Langendorff-perfusi

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Il malfunzionamento cardiovascolare è la principale causa di morte in tutto il mondo. Il modello cardiaco isolato che presentiamo qui può servire come finestra sperimentale sulla dinamica cardiaca umana. Questo approccio combina uno studio di elettrofisiologia classica con la mappatura ottica simultanea della tensione transmembrana e del calcio intercellulare per valutare lo stato del cuore.Questa metodologia può essere applicata agli studi di modellazione delle malattie, farmacologia e tossicologia. Ad esempio, una delle nostre aree di interesse è caratterizzare gli effetti dei taglia vetro sull'elettrofisiologia cardiaca. Sebbene questa metodologia sia più tecnicamente impegnativa di un protocollo che utilizza un modello animale più piccolo, nel complesso, il protocollo è relativamente semplice una volta che tutti i pezzi sono in atto.È difficile descrivere tutti i componenti di un sistema di imaging e perfusione per testo, quindi la dimostrazione visiva di questo processo aivierà a riprodurre una preparazione di successo. Dopo aver isolato il cuore con l'aorta ascendente intatta, immergere l'organo asportato nella cardioplegia ghiacciata e usare un paio di emostati per afferrare la parete dell'aorta. Infilare il vaso su una cannula a coste attaccata a tubi collegati a un litro di mezzo cardioplegia ghiacciato sospeso a circa 95 centimetri sopra il cuore.Lasciare che il fluido riempia l'aorta fino a quando il recipiente trabocca per evitare che eventuali bolle entrino nella vascuola e utilizzare nastro ombelicale per fissare l'aorta alla cannula. Legare gli emostati per sopportare il peso del cuore mentre pende dalla cannula per fissare ulteriormente il tessuto e consentire al mezzo freddo di retrogradare perfondendo il cuore a una pressione costante di 70 millimetri di mercurio per gravità. Trasferire l'udizione al sistema Langendorff di 37 gradi Celsius senza introdurre aria nella cannula.E permettere al normale ritmo del seno di sciacquare la vascucolatura di tutto il sangue e la cardioplegia rimanenti. In caso di aritmie shockable, posizionare le pagaie esterne all'apice e alla base del cuore per defibrillare l'organo, offrendo un singolo shock a cinque joule e aumentando in cinque incrementi joule fino a raggiungere 50 joule, cardioversione o ritmo non sganciabile. Quindi, sciacquare il cuore con almeno un litro di mezzo Krebs-Henseleit modificato senza ricircolo per rimuovere sangue residuo e cardioplegia.Quando il mezzo scorre limpido attraverso il cuore, chiudere il ciclo circolante per ricircolare il perfusato. Per registrare un piombo standard all'ECG durante tutto il corso dello studio, attaccare un elettrodo ad ago calibro 29 all'epicardio ventricolare vicino all'apice e attaccare un altro elettrodo nell'atrio destro. Collegare gli ingressi positivi e negativi di un bioamplificatore differenziale rispettivamente all'apice e all'atrio destro e attaccare un elettrodo di stimolo bipolare sull'atrio destro e un secondo elettrodo di stimolo bipolare al ventricolo sinistro laterale per scopi di stimolazione.Cammina il cuore usando uno stimolatore di elettrofisiologia, con la corrente iniziale impostata sul doppio della soglia diastolica e una larghezza dell'impulso di un millisecondo. Per identificare la soglia di stimolazione, applicare una serie di impulsi di stimolo da uno a due milliamp con una larghezza dell'impulso di un millisecondo a lunghezze del ciclo di stimolazione definite per garantire una risposta di stimolo coerente. Eseguire stimolazione extra utilizzando un treno di stimolazione S1, S1 o S1, S2.Ridurre la lunghezza del ciclo di stimolazione S2 in modo graduale di 10 millisecondi fino a quando il ritmo non riesce a catturare. Quindi, sali alla penultima lunghezza del ciclo di stimolazione e riduci le lunghezze del ciclo in intervalli di un millisecondo per determinare la lunghezza del ciclo di stimolazione più precisa prima della perdita di cattura. Per stabilire il periodo refrattario efficace ventricolare, utilizzare l'elettrodo di stimolo sul ventricolo sinistro laterale per identificare l'intervallo S1, S2 più breve in cui il battito prematuro S2 inizia la depolarizzazione ventricolare.Per definire la lunghezza del ciclo di Wenckebach, utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro per trovare l'intervallo S1, S1 più breve in cui una conduzione atrioventricolare uno a uno si propaga attraverso la normale via di conduzione. Per definire il tempo di recupero del nodo del seno, utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro per applicare un treno di stimolazione S1, S1 e misurare il ritardo di tempo tra l'ultimo impulso nel treno di stimolazione e il recupero dell'attività mediata spontanea del nodo sinoatriale. Per stabilire il periodo refrattario effettivo del nodo atrioventricolare, utilizzare l'elettrodo di stimolo sull'atrio destro.Trova l'intervallo di accoppiamento S1, S2 più breve in cui la stimolazione atriale precoce è seguita da un potenziale hisbundle che suscita un complesso QRS, che significa depolarizzazione ventricolare. Per la mappatura ottica della tensione transmembrana e del calcio intracellulare, aggiungere prima lentamente fino a cinque millilitri di colorante di tensione appena preparato prossimale alla cannula aortica seguito dalla lenta aggiunta di colorante di calcio appena preparato. Quindi, posizionare l'hardware di imaging per concentrarsi su un campo visivo appropriato e collegare la fotocamera a una workstation.Acquisire immagini utilizzando il software selezionato con un tempo di esposizione da 5 a due millisecondi. Ed eseguire un allineamento dell'immagine con l'aiuto di software in grado di dividere e sovrapporre le regioni desiderate e visualizzare una sottrazione in scala di grigi o un'aggiunta pseudo-colore a eventuali disallineamenti di evidenziazione. Con l'illuminazione ambientale ridotta al minimo, testare le luci a LED per garantire un'illuminazione epicardiale uniforme e massima, come determinato dalla profondità del pozzo del sensore.Quindi, immagini il miocardio durante il ritmo del seno, la fibrillazione ventricolare o il stimolazione dinamico usando l'elettrodo di stimolazione posizionato sul ventricolo sinistro, iniziando con una lunghezza del ciclo di stimolazione di 350 millisecondi e diminuendo di 10-50 millisecondi per generare curve di restituzione. Per confermare l'acquisizione di un segnale ottico di qualità durante l'esperimento, aprire un file video, selezionare una regione di interesse e tracciare la fluorescenza media nel tempo. Alla fine dell'esperimento, rimuovere il cuore dal sistema e drenare il perfusato.Quindi, sciacquare i tubi e le camere del sistema con acqua purificata. Per la manutenzione ordinaria, sciacquare periodicamente il sistema con la soluzione detergente in base alle esigenze. In questi studi rappresentativi, la procedura è stata eseguita su modelli intatti, come dimostrato, che variavano in dimensioni da 2,5 a 10,5 chilogrammi di peso corporeo e da 18 a 137 grammi di peso cardiaco.Dopo aver trasferito il cuore isolato in un sistema Langendorff, la frequenza cardiaca si stabilizza a circa 70 battiti al minuto entro circa 10 minuti dalla defibrillazione e rimane costante per tutta la durata dello studio. Viene in genere misurata una portata media di circa 184 millilitri al minuto. Rallenta a 70 millilitri al minuto dopo aver perfuso con mezzo riscaldato contenente un disaccoppiatore meccanico.Due ECG di piombo possono essere registrati per tutta la durata dello studio durante il ritmo del seno o in risposta al ritmo esterno per quantificare i parametri elettrofisiologici. Gli esperimenti di mappatura ottica possono anche essere eseguiti durante il ritmo del seno e la fibrillazione ventricolare spontanea. Le immagini rappresentative di un cuore carico di colorante possono essere ottenute con i corrispondenti potenziali di azione ottica.E i transitori di calcio possono essere raccolti da due regioni di interesse sulla superficie epicardiale. Inoltre, la stimolazione epicardiale dinamica può essere utilizzata durante gli esperimenti di mappatura ottica per normalizzare eventuali lievi differenze nella frequenza cardiaca intrinseca. I segnali grezzi possono essere utilizzati per rappresentare il potenziale d'azione del tempo di accoppiamento transitorio del calcio, il tempo di attivazione e durata e la restituzione elettrica e del calcio.È importante evitare di permettere alle bolle di entrare nell'aorta, ridurre al minimo il tempo di trasferimento dall'animale al sistema e sostenere il cuore più grande. L'elettrofisiologia e i dati del segnale ottico possono essere analizzati dopo l'acquisizione. Inoltre, il cuore può essere preservato dopo lo studio per l'istologia, l'immunostaining o l'analisi dell'espressione genica.Stiamo usando questa tecnica per caratterizzare lo sviluppo cardiaco giovanile ed esaminare l'impatto delle esposizioni ambientali sulla fisiologia cardiaca. I disaccoppiatrici meccaniche utilizzati per ridurre al minimo il movimento e le sostanze chimiche anti-schiuma utilizzate per affrontare la schiuma dell'albumina sono entrambi tossici, quindi è assolutamente essenziale utilizzare gli adeguati dispositivi di protezione individuale.

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La maggior parte degli studi che coinvolgono l'apparato di Langendorff utilizzano modelli di piccoli animali a causa della maggiore complessità dei sistemi per mammiferi più grandi. Descriviamo un sistema di Langendorff per modelli animali di grandi dimensioni che ne consente l'uso in una vasta gamma di specie, compreso l'uomo, e l'acquisizione di dati relativamente facile.

Un Isolato sistema Cuore di lavoro per i grandi modelli animali

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Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

Qui, presentiamo un protocollo per la modulazione del sistema nervoso autonomo intracardiaco e la valutazione della sua influenza su base elettrofisiologia, aritmogenesi e accampamento dinamica utilizzando un'installazione di Langendorff ex vivo .

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Tecnica modificata per l'uso di cuori murini neonatali nella preparazione di Langendorff

Il presente protocollo descrive i metodi per l'espressione transgenica nei cuori di ratto e topo mediante iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida ecocardiografica. Qui vengono spiegati anche i metodi per la valutazione della suscettibilità dei cuori alle aritmie ventricolari mediante la stimolazione elettrica programmata di cuori isolati perfusi da Langendorff.

Espressione del transgene virale nei cuori dei roditori e valutazione del rischio di aritmia cardiaca

Qui viene presentato un protocollo per quantificare in modo affidabile la funzione ventricolare destra e sinistra dei cuori dei donatori dopo la conservazione a freddo utilizzando un sistema di perfusione ex vivo .

Valutazione della funzione biventricolare murina ex vivo in un modello di Langendorff

Lo screening per la malattia coronarica potrebbe aumentare l'approvvigionamento di cuori di donatori con criteri estesi. Un protocollo per l'esecuzione di un'angiografia coronarica riproducibile durante la perfusione cardiaca ex-situ è descritto qui in un modello suino.

Angiografia coronarica durante la perfusione cardiaca ex-situ in un modello suino

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