Name: Raccolta di regioni cerebrali del roditore congelato per analisi a valle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Impara a raccogliere regioni cerebrali congelate da topi CD-1 per ottenere proteine e RNA di alta qualità. Questo metodo preserva l'integrità molecolare e supporta analisi a valle come RT-qPCR, RNA-Seq e Western blot.

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Questo lavoro è stato supportato da NIH, DA043982 e DA046196.

Gli animali utilizzati in questo studio sono stati trattati in modo etico e umano come stabilito dalle linee guida Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Indiana University e National Institutes of Health (NIH).
NOTA: Tutti gli utensili e le superfici devono essere lavati con un solvente appropriato per rimuovere le nucleasi18 prima di iniziare qualsiasi lavoro.
1. Memorizzazione del cervello
<ol><li>Rimuovere rapidamente i cervelli dai topi selvatici adulti monottana CD1 del peso di circa 30 g utilizzando un approccio convenzionale13 e flash-freeze per 60 secondi in azoto liquido o isopentane pre-raffreddati con ghiaccio secco.</li>
	<li>Conservare cervelli congelati a -80 gradi centigradi in un foglio di alluminio o in tubi conici fino all'uso.</li>
</ol>2. Preparazione della matrice cerebrale
<ol><li>Ventiquattro ore prima di sezionare il tessuto, posizionare una matrice cerebrale pulita (vedi Tabella dei materiali)su una pila di confezioni di congelatori scongelati. Sandwich i lati della matrice tra due confezioni congelatore assicurandosi di lasciare circa 0,5 cm tra la parte inferiore degli slot del rasoio e la parte superiore dei pacchetti di gel (Figura 1A). Posizionare un foglio di alluminio alle estremità per facilitare il raffreddamento. NOTA: Quando si acquista una matrice del cervello, acquistare uno che è abbastanza grande per racchiudere l'intero volume del cervello da sezionare.</li>
	<li>Posizionare la scatola contenente la matrice cerebrale e le confezioni del congelatore in un congelatore -20 gradi con il sojar superiore durante la notte.</li>
</ol>3. Impostazione di una lastra di vetro congelata
NOTA: Lo scopo di questa configurazione è quello di preparare una superficie congelata su cui sezionare le sezioni cerebrali.
<ol><li>Mettere il ghiaccio in una scatola isolata fino a circa 5 cm dall'alto. Posizionare quindi uno strato di ghiaccio secco di 2,5 cm sopra il ghiaccio e coprire con lastre di plastica nera per facilitare la visualizzazione del campione (Figura 1B, Figura 1C).</li>
	<li>Posizionare una lastra di vetro (dovrebbe solo adattarsi all'apertura della scatola) sulla parte superiore della plastica e posizionare il ghiaccio secco sulla parte superiore della piastra negli angoli lontani (Figura 1C).</li>
	<li>Prendi la matrice cerebrale congelata dal freezer e inserisci il cervello da tagliare la corteccia verso l'alto. Lasciare ed eseguire l'ancognimento alla temperatura nella scatola per 10 min.</li>
	<li>Regolare la posizione del cervello nella matrice con pinze fredde in modo che il seno sagittale e il seno trasversale si allineano con le scanalature perpendicolari del blocco (Figura 1D). Ciò contribuirà a garantire sezioni simmetriche per una più facile dissezione. Punte di tocco di pinze per asciugare il ghiaccio brevemente per raffreddare prima di regolare il cervello.</li>
	<li>Una volta che il cervello è in posizione, posizionare una lama fredda del rasoio vicino al suo centro e premere la lama di circa 1 mm nel tessuto. Aggiungere lame refrigerate alle estremità rostrale e caudale per aiutare a mantenere il cervello in posizione (Figura 2A e Figura 2B).</li>
	<li>Partendo dall'estremità rostrale, aggiungere le lame una alla volta, posizionandole negli slot e premendole delicatamente verso il basso nel tessuto di circa 1 mm (Figura 2B). Continuare ad aggiungere lame a intervalli di 1 mm lavorando verso l'estremità caudale.</li>
	<li>Assicurarsi che il cervello non si sposta durante questo periodo. Allineare le lame orizzontalmente e verticalmente (Figura 2B). Per tagliare le sezioni in larghezze di 0,5 mm, possono essere utilizzate lame a microtomi a basso profilo (vedere Tabella dei materiali). Posizionarli tra le lame del rasoio più grandi (Figura 2C).</li>
	<li>Una volta che le lame sono in posizione, premere verso il basso in cima al gruppo con le dita, palmo o qualche altra superficie piana (Figura 2C, Figura 2D). Rocciare il gruppo di lame lentamente da un lato all'altro per spostarli attraverso il tessuto. NOTA: Questa operazione potrebbe richiedere del tempo (1-2 min) e richiede pazienza. Ci dovrebbe essere resistenza alle lame che si muovono attraverso il tessuto. Facile ingresso significa che il cervello si sta scongelando e il blocco deve essere raffreddato con ghiaccio secco.</li>
	<li>Quando tutte le lame hanno raggiunto il fondo degli slot, afferrare ogni lato del gruppo di lame e lavorare libero dalla matrice dondolando avanti e indietro. NOTA: Prestare attenzione per evitare di tagliarsi sui bordi taglienti delle lame.</li>
	<li>Una volta che il gruppo è libero, posizionare la pila, lato rostrale verso l'alto, sulla lastra di vetro (Figura 2E). Posizionare il ghiaccio secco accanto e/o sopra la pila per congelare ulteriormente i campioni per una separazione più facile.</li>
	<li>Posizionare la pila con bordi taglienti verso il basso sulla lastra di vetro e lame separate spostando la pila tra pollici e dita. Le lame devono separarsi l'una dall'altra con le sezioni attaccate.</li>
	<li>Allineare le sezioni sulla lastra di vetro da rostral a caudal (Figura 2F).</li>
	<li>Separare il tessuto dalle lame flettendo le lame tra le dita o separandolo con un secondo rasoio freddo (Figure 2G,2H,2I).</li>
</ol>4. Sezioni di dissecting
<ol><li>Apri l'Atlante del cervello del topo di Allen o un altro riferimento e trova i punti di riferimento necessari per identificare le regioni di interesse. Alcuni punti di riferimento ovvi includono il commissure anteriore, il corpo calloso, i ventricoli laterali e l'ippocampo (Figura 3).</li>
	<li>Capovolgere la sezione da tagliare con pinze refrigerate e assicurarsi che la regione che sta per essere raccolta sia coerente in tutta la sezione. Durante la raccolta, consultare spesso l'atlante di riferimento per assicurarsi che si ottenga il ROI corretto. NOTA: Una lente di ingrandimento o un microscopio di sezionato è spesso utile in questo processo. Una buona illuminazione è anche essenziale. Lampade a LED a basso wattaggio o una lampada fredda (vedi Tabella dei materiali) possono essere utilizzati a questo scopo.</li>
	<li>Con un bisturi pulito o un punzone, tagliare nella sezione (Figura 4). Prechill ogni utensile prima di tagliare toccandolo brevemente per asciugare il ghiaccio. Spingere delicatamente la lama ma saldamente nel tessuto, dondolandola avanti e indietro per fare il taglio. Non spingere troppo forte o il tessuto si frattura. NOTA: gli utensili si riscaldano nel tempo. Le lame leggermente riscaldate possono essere utili per fare tagli puliti e possono limitare la fratturazione, ma fai attenzione a evitare lo scongelamento dei tessuti. Raffreddare periodicamente gli utensili sul ghiaccio secco.</li>
	<li>Una volta raccolto un ROI, metterlo in tubi etichettati da 1,5 mL presondati. Conservare i tessuti raccolti a -80 gradi centigradi fino a quando necessario.</li>
	<li>Elaborare il tessuto congelato raccolto in questo modo aggiungendo buffer RIPA freddo (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS e cocktail inibitori proteici (vedi Tabella dei materiali))per l'estrazione di proteine, o un solvente contenente guanidinium (vedi Tabella dei materiali ) per l'estrazione dell'RNA sul campione congelato e immediatamente omogeneizzare utilizzando un dounce di vetro o un omogenizzatore meccanico (vedi Tabella dei materiali). Table of Materials In questo modo, gli inibitori della proteasi e della nuclea sono in atto quando il campione si riscalda per proteggere le proteine e gli acidi nucleici dalla degradazione.</li>
</ol>

<ol><li>Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas">https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas</a> (2008).</li>
<li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930(2009).</li>
<li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Clusters%2C+Hubs%2C+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312(2016).</li>
<li>Mitulović, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+techniques+for+proteomics+analysis%E2%80%94a+short+overview+of+latest+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269(2007).</li>
<li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAring%2C+L+%22Laser+Capture+Microdissection.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology</a>. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457(2018).</li>
<li>Björk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain%3A+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li>
<li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics%2C+Neuromethods%22">Neuroproteomics, Neuromethods</a>. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalkovits%2C+M+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 103, Academic Press. 368-376 (1983).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+2+edn%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+4+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn</a>. , Academic Press. (1998).</li>
<li>RNaseZap. Ambion. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf</a> (2008).</li>
<li>Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf</a> (2016).</li>
<li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li>
<li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li>
<li>Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+%5Bcorrected%5D+interval%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507(2013).</li>
<li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signs+of+biological+activities+of+28%2C000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050(2019).</li>
<li>Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf">http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf</a> (2011).</li>
<li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro descrive una tecnica per isolare piccole regioni specifiche del cervello limitando la degradazione dell'acido nucleico e delle proteine. Il danno ai tessuti cerebrali avviene rapidamente una volta che un organismo muore. Ciò è in parte dovuto a un rapido accumulo di glutammato extracellulare e alla conseguente eccitotossicità che si verifica21. L'RNA messaggero è particolarmente vulnerabile alla degradazione22,23. La ripartiz...

Questo lavoro illustra la dissezione delle regioni cerebrali congelate per l'estrazione di acido nucleico o proteina di alta qualità utilizzando un riferimento, come l'Atlante del cervello del mouse Allen1, come guida. In questa tecnica, i cervelli sono congelati da flash e vengono conservati a -80 gradi centigradi per la sezionamento e la dissezione successivi, pur essendo mantenuti in condizioni congelate. Questo processo permette al ricercatore di raccogliere un gran numero di cervelli in una sessione e successivamente sezionarli per una raccolta accurata di più regioni del cervello.
La raccolta accurata di regioni di interesse cerebrali (ROI) è spesso necessaria quando si risponde a domande relative all'espressione genica e proteica. Mentre farmacologia, elettrofisiologia e optogenetica possono essere utilizzate su roditori selvatici o geneticamente modificati per aiutare a chiarire i cambiamenti molecolari alla base dei comportamenti osservati2,3,4, la misurazione dei cambiamenti indotti nei trascrittomi e nei proteomi è spesso utilizzata per sostenere questi risultati. Tecniche come la narrazione quantitativa inversa della polimerasi di trascrizione inversa (RT-qPCR), il gonfiore occidentale, RNAseq5, MAPSeq6 e HPLC7 sono robuste e relativamente basse in termini di costi, consentendo a molti laboratori di studiare cambiamenti molecolari indotti all'interno di piccole regioni cerebrali2,4,5,6.
Ci sono diversi modi per estrarre e purificare l'acido nucleico o la proteina dalle regioni cerebrali8,9,10,11,12. Molti laboratori raccolgono le regioni del cervello raffreddando e tagliando i cervelli sul ghiaccio al momento del raccolto9,13. Anche se questo approccio può portare ad acido nucleico e proteine di alta qualità, è un po 'limitato nel tempo in quanto la degradazione all'interno del microambiente del tessuto può avvenire a queste temperature. Ciò può essere particolarmente vero quando si tenta di sezionare un gran numero di animali o ROI in una sola seduta. Mantenere i campioni congelati aiuta a mantenere molecole bersaglio labili, fornendo al ricercatore il tempo per confrontare attentamente i punti di riferimento su entrambi i lati di ogni sezione nello sforzo di raccogliere campioni relativamente puri. La cattura laser è un altro modo per raccogliere tessuti per l'analisi dell'RNA o delle proteine dalle aree cerebrali10. Questa procedura è superiore alla dissezione meccanica in quanto i ROI molto piccoli e di forma irregolare possono essere identificati e isolati. Tuttavia, la cattura laser è limitata dall'uso di costose attrezzature e reagenti, richiede molto tempo e può anche essere più suscettibile alla degradazione del campione.
La dissezione di micropunch sui tessuti congelati non è nuova. I primi documenti di Miklos Palkovits e altri descrivono le tecniche di base nel dettaglio14,15. Questa presentazione segue in gran parte il lavoro originale, con alcuni miglioramenti per facilitare l'efficienza e ridurre i costi delle attrezzature necessarie. Per esempio, le sezioni cerebrali sono fatte in un blocco cerebrale congelato piuttosto che su un criostato. Questo produce sezioni più spesse che riduce il numero di sezioni necessarie per raccogliere campioni di ROI. Questo metodo seziona anche i campioni su una piastra di vetro congelato che si trova sul ghiaccio secco all'interno di una scatola isolata. Questo produce una fase di subcongelamento sul banco su cui lavorare. Le sezioni sezionate in questo modo sono facilmente manipolabili, consentendo al ricercatore di confrontare entrambi i lati di ogni sezione con un riferimento al fine di limitare la contaminazione da regioni al di fuori del ROI desiderato.
I vantaggi di questo protocollo sono che 1) il cervello è mantenuto in una condizione congelata durante tutto il processo, che aiuta a preservare le proteine e l'acido nucleico e dà al ricercatore il tempo di raccogliere con attenzione i ROI, e 2) i reagenti necessari sono poco costosi e si trovano nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare. In questo processo, interi cervelli sono sezionato a 0,5–1,0 mm in una matrice cerebrale e collocati su una piastra di vetro congelato che viene continuamente raffreddata con ghiaccio secco. Punti di riferimento trovati nell'Atlante del cervello di Allen1 o in altri atlanti cerebrali16,17 vengono utilizzati per identificare le regioni di interesse, che vengono poi sezionati utilizzando un pugno a freddo o bisturi. Poiché il tessuto non viene mai scongelato, le regioni raccolte in questo modo forniscono RNA e proteine di alta qualità per le analisi a valle.

<table><tbody><tr><td>Matrice cerebrale coronale di topo da 0,5 mm</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 505C</td><td>Blocco di taglio</td></tr><tr><td>Matrice coronale di cervo di ratto da 0,5 mm</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 705C</td><td>Blocco di taglio</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia da 1,0 mm con stantuffo</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Dot Scientific</td><td>229443</td><td>Per la conservazione di ROI congelati</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia da 1,5 mm con stantuffo</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 69031-02</td><td></td></tr><tr><td>Punzone per biopsia da 2,0 mm con stantuffo</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>69031-03</td><td></td></tr><tr><td>4-12% NuPage gel</td><td>Invitrogen</td><td>NPO323BOX</td><td>gel a gradiente proteico</td></tr> Sistema <tr><td>bioanalizzatore</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Sistema di analisi RNA</td></tr><tr><td>Macinatore di tessuti Dounce</td><td>Millipore Sigma</td><td> D8938</td><td>Omogeneizzatore di tessuti in vetro</td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite</td><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td>Modello 180</td><td>Lampada fredda</td></tr><tr><td>Piastre di vetro</td><td>LabRepCo</td><td>11074010</td><td></td></tr><tr><td>HALT</td><td>ThermoFisher</td><td>78440</td><td>cocktail di inibitori della proteasi</td></tr><tr><td>Lame a basso profilo</td><td>Sakura Finetek USA Inc.</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-actina di topo</td><td>Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi</td><td>Anticorpo JLA20</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>Utilizzato nell'analisi iniziale della purezza dell'RNA</td></tr><tr><td>Lama chirurgica n. 15</td><td>Design chirurgico Inc</td><td>17467673</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Tampone bloccante</td><td>LiCor Biosciences</td><td>927-40000</td><td>Reagente</td></tr> <tr>bloccante occidentale<td>Omni Tissue Master 125</td><td>VWR</td><td>10046-866</td><td>Omogeneizzatore tissutale</td></tr><tr><td>coniglio anticorpo anti-KCC2</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>94725S</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>RNA Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>73034</td><td>Utilizzato per estrarre l'RNA da piccoli campioni di tessuto</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi</td><td>Excelta Corp.</td><td></td><td></td>16050103</tr><tr><td>Lame di rasoio standard</td><td>American Line</td><td>66-0362</td><td></td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Utilizzato per estrarre l'RNA dai tessuti</td></tr></tbody></table>

raccolta di regioni cerebrali del roditore congelato per analisi a valle

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Man mano che la nostra comprensione della neurobiologia è progredita, le analisi molecolari vengono spesso eseguite su piccole aree cerebrali come la corteccia prefrontale mediale (mPFC) o il nucleo accumbens. La sfida di questo lavoro consiste nel sezionare l'area corretta preservando il microambiente da esaminare. In questo articolo viene descritto un metodo semplice e a basso costo utilizzando risorse prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori. Questo metodo mantiene l'acido nucleico e le proteine mantenendo il tessuto congelato durante tutto il processo. I cervelli sono tagliati in sezioni da 0,5 a 1,0 mm utilizzando una matrice cerebrale e disposti su una piastra di vetro congelato. I punti di riferimento all'interno di ogni sezione vengono confrontati con un riferimento, ad esempio l'atlante del cervello del mouse di Allen, e le regioni vengono sezionate usando un punzone a base di bisturi freddo o di biopsia. Il tessuto viene poi immagazzinato a -80 gradi centigradi fino all'uso. Attraverso questo processo ratto e topo mPFC, nucleo accumbens, ippocampo ventrale e altre regioni sono stati analizzati con successo utilizzando qRT-PCR e assaggi occidentali. Questo metodo è limitato alle regioni cerebrali che possono essere identificate da punti di riferimento chiari.

Per convalidare questo metodo, la corteccia prefrontale mediale è stata raccolta da topi maschi di tipo selvatico CD1 adulti e l'RNA e la proteina sono stati estratti e caratterizzati. L'RNA è stato analizzato dall'elettroforesi capillare. L'RNA degradato mostra una perdita nell'intensità delle bande ribosomale 28S e 18S e mostra anche i prodotti di degradazione come uno striscio tra 25 e 200 nucleotidi (Figura 5A, campione 1). L'RNA di alta qualità mostra bande ribosomiche distinte con poco...

Questa procedura descrive la raccolta di regioni cerebrali congelate discrete per ottenere proteine e RNA di alta qualità utilizzando strumenti economici e comunemente disponibili.

Raccolta di regioni cerebrali del roditore congelato per analisi a valle

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Questa procedura descrive la raccolta di regioni cerebrali congelate discrete per ottenere proteine e RNA di alta qualità utilizzando strumenti economici e comunemente disponibili. Poiché le regioni cerebrali sono tenute congelate dal raccolto attraverso la dissezione, le molecole bersaglio vengono preservate e il ricercatore ha il tempo di sezionare e immagazzinare attentamente le regioni di interesse. Identificare le regioni di interesse può essere inizialmente impegnativo.L'uso di punti di riferimento cerebrali comuni man mano che emergono e si allontanano attraverso le sezioni in relazione alle regioni desiderate renderà chiara l'identificazione. Dopo aver rimosso il cervello dai topi adulti eutanasiati di tipo selvatico CD-1, flash congelare il tessuto per 60 secondi in azoto liquido o isopentane. Pre-raffreddare con ghiaccio secco e conservarlo a meno 80 gradi Celsius.24 ore prima di sezionare il tessuto, posizionare una matrice cerebrale pulita su una pila di confezioni congelatrici scongelate. E incastro i lati della matrice tra due confezioni congelatrici assicurandosi di lasciare circa mezzo centimetro tra il fondo delle fessure del rasoio e la parte superiore delle confe

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Micro-dissezione del cervello di ratto in varie regioni è estremamente importante per lo studio di diverse malattie neurodegenerative. Questo video dimostra micro-dissezione di quattro regioni del cervello importanti includono bulbo olfattivo, la corteccia frontale, ippocampo e striato in tessuto fresco cervello di ratto. Consigli utili per la rimozione rapida delle rispettive regioni al fine di evitare l'RNA e la degradazione delle proteine ​​del tessuto sono dati.

Micro-dissezione del cervello di ratto per estrazione RNA o proteine ​​da Regione specifiche del cervello

Il profilo dell'espressione dell'RNA in regioni cerebrali murine discrete richiede una strategia di raccolta dei tessuti precisa e ripetibile. Viene qui descritto un protocollo che utilizza sia il sezionamento coronale del cervello sia la microdissezione assistita da corer tissutale. Il rendimento e la qualità dell'RNA totale ottenuti dai campioni risultanti confermano l'utilità del metodo delineato.

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

Descriviamo un modello murino del disturbo post traumatico da stress (PTSD) che rivela le alterazioni persistenti della funzione neuroendocrina e del ritardato a lungo termine, di risposta paura esagerata, caratteristici dei pazienti con PTSD. Il modello animale e metodi descritti qui sono utili per correlare biomarcatori nei nuclei del cervello, che sono meccanicistica ma non possono essere misurati nei pazienti, con biomarcatori nelle periferie globuli bianchi, che può.

Biomarcatori in un modello animale per Rivelare correlati neurali, ematologiche, e comportamentali di PTSD

Questo video mostra un protocollo dettagliato passo dopo passo per la preparazione di sezioni di tessuto cerebrale di topo congelate per le analisi a valle.

Elaborazione di un cervello di topo per l'analisi a valle

Descriviamo l'uso di laser capture microdissection per ottenere campioni di popolazioni distinte delle cellule dalle regioni differenti del cervello per l'analisi del gene e microRNA. Questa tecnica permette lo studio di effetti differenziali del trauma cranico in regioni specifiche del cervello del ratto.

Atlas-guida stereotassica del Laser Capture Microdissection di regioni del cervello colpite da lesione traumatica

Qui, presentiamo un protocollo per congelare e sezione di tessuto cerebrale da più animali come alternativa ad alta produttività per singoli cervelli di elaborazione. Questo riduce la variabilità di colorazione durante immunohistochemistry e imaging e tempo cryosectioning.

Cryosectioning simultanea di più cervelli roditore

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Diverse regioni cerebellari sono state implicate per svolgere un ruolo in distinti output comportamentali, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti. Questo lavoro descrive un metodo per sezionare in modo riproducibile e rapido la corteccia cerebellare degli emisferi, delle regioni anteriori e posteriori del verme e dei nuclei cerebellari profondi al fine di sondare le differenze molecolari isolando l'RNA e testando le differenze nell'espressione genica.

Dissezione regionale cerebellare per l'analisi molecolare

Presentiamo un protocollo pratico, passo-passo, rapido per la rimozione del cervello del topo e la dissezione di regioni discrete dal tessuto cerebrale fresco. Ottenere regioni cerebrali per l'analisi molecolare è diventato routine in molti laboratori di neuroscienze. Queste regioni cerebrali vengono immediatamente congelate per ottenere dati trascrittomici di alta qualità per l'analisi a livello di sistema.

Microdissezione del cervello di topo in regioni funzionalmente e anatomicamente diverse

Qui presentiamo un metodo automatizzato per la determinazione semi-quantitativa del numero di neuroni dopaminergici nella substantia nigra pars compacta del ratto.

Determinazione semi-quantitativa della densità neuronale dopaminergica nella Substantia Nigra dei modelli di roditori utilizzando l'analisi automatizzata delle immagini

Impara a raccogliere regioni cerebrali congelate da topi CD-1 per ottenere proteine e RNA di alta qualità. Questo metodo preserva l'integrità molecolare e supporta analisi a valle come RT-qPCR, RNA-Seq e Western blot.

Raccolta di regioni cerebrali del roditore congelato per analisi a valle

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