Visualizzazione e quantificazione dei dati di citometria ad alta dimensione utilizzando Cytofast e i metodi di clustering a monte FlowSOM e Cytosplore

I dati generati dalla citometria di massa sono complessi e devono essere visualizzati in modo efficiente e semplice. Cytofast è un metodo che evidenzia i modelli immunologici all'interno della popolazione delle cellule immunitarie e determina sottoinsiemi cellulari collegati a trattamenti clinici o gruppi sperimentali. Cytofast può essere applicato dopo qualsiasi metodo di cristallizzazione come FlowSOM o Cytosplore.

Ti permetterà di scoprire un sottoinsieme cellulare collegato al trattamento clinico o a un gruppo sperimentale. Con questo metodo, sarai in grado di vedere la panoramica immunologica dei dati a colpo d'occhio in modo quantitativo. Iniziare creando cluster con Cytosplore o FlowSOM.

Se si utilizza Cytosplore, caricare i file FCS facendo clic su File e aprire file FCS. Quindi selezionare un cofattore per la trasformazione ArcSinh iperbolica quando richiesto e fare clic su aggiungi tag di esempio univoco come canale. Selezionare Esegui HSNE per eseguire un livello HSNE di tre e attendere che la mappa venga generata.

Al primo livello HSNE, controllare le celle positive per CD161 selezionando le celle positive del CD161 e facendo clic con il pulsante destro del mouse sullo zoom nella selezione. Al secondo livello, ripetere la procedura per raggiungere il terzo livello con solo eventi positivi CD161. Una volta generata l'ultima mappa TSNE, salvare i cluster definiti da Citosplore facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla mappa e scegliendo salva cluster.

Scegliere la directory dei file di output come richiesto da Cytosplore e prendere nota di questo percorso perché verrà successivamente utilizzato per caricare i file FSC in R.Utilizzare un nome solo caratteri semplici quando si rinominano i file di output che renderanno più semplice l'identificazione e l'ulteriore gestione e selezioneranno il salvataggio. Caricare i file in R con la funzione designata readcytosploreFCS. Per pulire i dati, rimuovere alcuni parametri come tempo e sfondo controllando la posizione della colonna relativa ai relativi parametri non necessari e rimuovendoli dalla matrice.

Quindi, riordinare i marcatori in modo che i marcatori di lignaggio siano visualizzati per primi seguiti da marcatori funzionali. Collegare il file di metadati ai dati generati da Cytosplore caricando il metafile del foglio di calcolo contenente informazioni cliniche. Per eseguire il clustering tramite FlowSOM, caricare i dati non elaborati precedentemente gated su CD161 eventi positivi in R con la lettura.

flowSet (funzione). Selezionare i marcatori biologici pertinenti selezionando le colonne corrette e trasformando i dati in modo ArcSinh5. Applicare un cofattore di cinque scegliendo cofacter=5 nella funzione.

Raggruppare i dati utilizzando la funzione FlowSOM e confrontare FlwoSOM e Cytosplore scegliendo di raggruppare i dati in 10 sottoinsiemi come l'output precedentemente prodotto da Cytosplore. Assegnare quindi ogni cella al sottoinsieme identificato e all'ID di esempio.Caricare il file di metadati in R contenente l'assegnazione del gruppo e collegarlo ai file FCS utilizzando il codice del manoscritto di testo. Creare un elenco CF basato sul dataframe ottenuto da FlowSOM.

Quindi riordinate i marcatori in modo che appaiano in modo simile all'output dell'analisi di Citosplore. Prima di creare le mappe di calore, generare la tabella di conteggio per campione utilizzando la funzione cellCount. Poiché alcuni cluster contengono meno celle di altri, ridimensionare i dati per cluster specificando scale=true all'interno della funzione che semplifica la visualizzazione della dispersione tra i campioni.

Visualizzare i dati con una mappa termica, quindi visualizzare con i box plot generando il conteggio delle celle ma non ridimensionando i dati per ottenere la frequenza di ogni cluster. Infine, visualizzare l'intensità dell'espressione dei marcatori CD45, CD11c e CD54 con i nomi dei marcatori notati e includendoli nella funzione di plottaggio MSI. Cytofast esegue diverse possibili uscite tra cui la mappa termica di tutti i cluster identificati nell'analisi e basati sull'espressione marcatore.

Il dendrogramma nella parte superiore rappresenta la somiglianza gerarchica tra i cluster identificati. Il pannello superiore visualizza un'altra mappa termica che mostra la quantità relativa di sottoinsiemi corrispondenti in ogni campione. Nel frattempo, il dendrogramma a destra mostra la somiglianza tra i campioni basati su frequenze sottoinsiemi che dimostrano che il fenotipo delle cellule killer naturali è modellato dal trattamento PD-L1 tre giorni dopo l'iniezione.

Le mappe di calore combinate possono essere ottenute per FlowSOM seguito da Cytofast e per Cytosplore seguito da Cytofast. Cytofast può anche essere utilizzato per presentare i dati quantitativamente e visualizzare i risultati in box plot. Un'altra caratteristica inclusa nel pacchetto Cytofast è la funzione di plottaggio MSI che mostra il grafico mediano dell'intensità del segnale di ogni marcatore per gruppo.

Questa funzione consente di rilevare cambiamenti globali come l'aumento dell'espressione di CD54 o CD11c nelle cellule killer naturali del gruppo trattato PD-L1. Questa tecnica è un modo rapido per visualizzare e quantificare i dati e può essere utilizzata per scoprire nuove risposte cellulari dopo la terapia. Dopo questo metodo, il pacchetto di test globale in R può essere utilizzato per testare un gruppo di covariati per l'associazione con variabili di risposta.

Ciò mostrerà la correlazione tra ogni sottoinsieme e l'esito clinico.