Valutazione dell'autoregolazione del flusso sanguigno cerebrale nel ratto utilizzando Laser Doppler Flowmetry

Questo protocollo è ideale per valutare la capacità del microcircolo cerebrale di regolare il proprio flusso sanguigno durante i cambiamenti della pressione sanguigna in condizioni normali e patologiche. LDF fornisce un metodo relativamente non invasivo per il monitoraggio continuo del flusso sanguigno cerebrale in una varietà di condizioni che non è possibile con altri metodi. La flowmetria Laser Doppler può essere utilizzata per la valutazione non invasiva del flusso sanguigno.

Ad esempio, per valutare gli effetti di una dieta ad alto contenuto di sale sulla regolazione del flusso sanguigno compromessa nelle giovani donne sane. LDF consente di monitorare facilmente il flusso sanguigno in molti letti vascolari diversi di esseri umani e animali e può essere utilizzato in un'ampia varietà di studi. A dimostrare la procedura con Adrienne Allen sarà Megan Stumpf, il mio tecnologo di ricerca e responsabile di laboratorio.

Prima di iniziare la procedura, posizionare il ratto su una coperta d'acqua circolante mantenuta a 37 gradi Celsius e confermare una mancanza di risposta al riflesso del pedale in un ratto sperimentale anestetizzato. Applicare unguento agli occhi degli animali e radere la parte superiore del cranio, la zona del collo ventrale e i triangoli femorali. Rimuovere i capelli persi dalla pelle esposta.

E disinfettare la pelle con l'alcol di sfregamento. Spostare il topo su una pastiglia riscaldante con una pompa di acqua calda circolante. E utilizzare del nastro medico per fissare temporaneamente il topo in posizione supina.

Riempire due cannule PE 50 con un'unità per mL di eparina in soluzione isotonica di cloruro di sodio. E smussare l'estremità aperta dei cateteri con forbici chirurgiche per facilitare l'inserimento nelle arterie. Dopo aver accuratamente separato le arterie femorali dal tessuto circostante sotto un microscopio sezionante, legare l'estremità distale del segmento dell'arteria femorale isolata e posizionare due suture aggiuntive intorno alle estremità centrali e prossimali dell'arteria senza stringere i nodi.

Inserire un filo a forma di V modellato da una graffetta sotto l'arteria per occluderlo fino a quando la cannula non è stata fissata. Quindi usa le forbici vannas per fare una piccola incisione nell'arteria femorale vicino alla legatura distale. Inserire l'estremità smussata della cannula nell'incisione e far avanzare la cannula nell'arteria femorale.

Rimuovere la graffetta. Stringere il nodo nella legatura centrale sopra la cannula per fissare la cannula in posizione. Rilasciare la tensione sulla legatura di sollevamento, quindi stringere la legatura prossimale e chiudere l'incisione.

Immediatamente dopo che le cannule sono in posizione, posizionare l'animale in una posizione sternale. E fissare la testa in un dispositivo stereotassico facendo attenzione a non spodestare i cateteri. Fare un'incisione ellittica nella pelle che copre il cranio.

E utilizzare un batuffolo di cotone per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo, assicurando che il cranio sia pulito e asciutto. Posizionare un piccolo pezzo di carta velina allungato laminato intorno all'incisione sul cuoio capelluto per fermare qualsiasi sanguinamento e sotto il microscopio sezionato, utilizzare un trapano di dimensioni appropriato con una punta di perforazione da 2,15 mm per assottigliare un'area di osso da 0,5 a 1 cm nell'area parietale sulla corteccia somatosensoriale sinistra o destra, a seconda delle dimensioni del topo. Assottigliare l'osso lentamente e con attenzione per evitare di penetrare nel cranio.

Durante l'esecuzione di questo passaggio, la soluzione salina deve essere applicata liberamente per evitare che l'area si suscaldi. Quando l'area ha un aspetto rosa e / o i vasi sanguigni possono essere visualizzati, coprire l'osso assottigliato con olio minerale. E usate un micromanipolatore per posizionare la sonda laser doppler sul microcircolo cerebrale esposto in modo che la punta della sonda tocchi solo la parte superiore della piscina di olio minerale.

Per il posizionamento iniziale della sonda, è meglio iniziare con un segnale di circa 150 unità per garantire che la sonda sia posizionata sulla microcircolazione. Quando la sonda di flusso doppler laser è in posizione, lasciare riposare l'animale per un periodo di equilibrità da 30 a 45 minuti prima di prelevare 1,5 mL di sangue dall'appropriata cannula dell'arteria femorale per un periodo di 30 secondi. Per mantenere il brevetto del catetere, infondere 100 unità per mL di eparina in salina isotonica nella cannula dopo ogni estrazione di sangue.

Lasciare recuperare il ratto per due minuti e quindi misurare LDF e pressione sanguigna ogni 30 secondi per due minuti. Dopo le misurazioni della pressione sanguigna e della LDF, ripetere il prelievo del volume sanguigno ogni due minuti fino a quando l'animale raggiunge una pressione arteriosa media di circa 20 mmHg. In questi esperimenti rappresentativi, il flusso sanguigno cerebrale laser medio di 10 ratti Sprague-Dawley alimentati con chow di laboratorio standard è stato mantenuto entro il 20% del valore pre-emorragia dopo i primi tre prelievi di volume sanguigno, fino a quando la pressione arteriosa media ha raggiunto il limite inferiore di autogulation.

I successivi prelievi di volume sanguigno a pressioni inferiori al limite inferiore dell'autoregolazione, causarono una progressiva riduzione del flusso sanguigno cerebrale laser dimostrando che la circolazione cerebrale non era più in grado di produrre un livello sufficiente di vasodilatazione per mantenere costante il flusso sanguigno cerebrale alle pressioni di profusione più basse. A pressioni pari o superiori al limite inferiore dell'autoregulation, non c'era alcuna correlazione significativa tra il flusso sanguigno cerebrale laser e la pressione arteriosa, indicando che il flusso sanguigno cerebrale laser era indipendente dalla pressione arteriosa nell'intervallo di plateau della curva autoregolatoria. Al di sotto del limite inferiore di autoregolazione, la relazione laser cerebrale della pressione arteriosa del flusso sanguigno aveva una pendenza negativa.

E il flusso sanguigno cerebrale laser era significativamente correlato con la pressione arteriosa. Le cose più importanti da ricordare sono assottigliare il cranio con molta attenzione e assicurarsi che la sonda LDF rimanga saldamente ancorata sulla stessa area di tessuto. Questa procedura può essere utilizzata per testare la reattività del microcircolo di vari agenti dopo infusione retrograda attraverso l'arteria carotide, o per valutare l'iperemia funzionale e l'accoppiamento neurovascolare nella circolazione cerebrale.

Questa tecnica ha permesso di investigare gli effetti di diversi farmaci e anestetici sulla circolazione cerebrale e i cambiamenti nell'autoregolazione cerebrale nei modelli di malattia come l'ipertensione.