Name: Nucleofezione e Propagazione In Vivo dei Parassiti dellEmeria del Pollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Impara la nucleofezione di sporozoi e merozoi di Eimeria per la manipolazione genetica di parassiti del pollo. Questo metodo facilita lo sviluppo di vaccini e lo screening di nuovi bersagli farmacologici.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2017YFD0501200) e dalla National Natural Science Foundation of China (31572507, 31772728 e 31873007).

I polli per tutti gli esperimenti sugli animali sono stati ospitati e mantenuti secondo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali delle Università Agricola della Cina e hanno seguito i principi guida internazionali per la ricerca biomedica che coinvolgono gli animali. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato di Animali da Laboratorio dell'Amministrazione di Pechino.
1. Estrazione e purificazione degli sporozoiti di Eimeria spp. (ad esempio, E. tenella)
<ol><li>Rilascio di sporocisti<ol>
<li>Centrifuga 1 x 107oocisti spororati in soluzione di cromata di potassio (2,5%, m/v) a 2.300 x g per 5 min. Lavarli con PBS (soluzione buffer fosfato) tre volte.</li>
		<li>Risospendere i pellet con 1 mL di PBS e trasferirli in un tubo da 15 mL. Aggiungere un volume uguale di perline di vetro (1 mm x 1 mm di diametro gamma) e oscillare la sospensione dell'oocisti utilizzando un mixer vortice per rilasciare le sporocisti.</li>
		<li>Monitorare il rilascio di sporocisti in microscopia ogni minuto. Smettere di vortice quando più del 90% delle oocisti sono rotti. NOTA: La maggior parte delle ovocisti (come E. tenella, E. necatrixed E. acervulina) sono stati interrotti dopo 1 min utilizzando il mixer vortice.</li>
		<li>Trasferire la sospensione sporocisti in nuovi tubi da 1,5 mL e centrifugare a 1.600 x g per 5 min.</li>
		<li>Risospendere il precipitato con una soluzione di gradiente di densità del 50%, combinare in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 10.000 x g per 1 min. NOTA: per la composizione del gradiente di densità, fare riferimento alla Tabella 1. Il gradiente di densità è un mezzo colloidale a base di silice, costituito da particelle di silice colloidali di 15-30 nm di diametro (23% w/w in acqua), che sono stati rivestiti con polivinylpyrrolidone (PVP).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rilascio di sporozoiti<ol>
<li>Risospendere il precipitato con il tampone di escissione (Tabella 1) e incubare in un bagno d'acqua a 42 gradi per 40-60 min per rilasciare le sporozoiti. Smettere di incubare quando più del 90% delle sporozoites vengono rilasciate. Quindi centrifugare a 600 x g per 10 min. NOTA: Agitare i tubi una volta ogni 5 minuti durante l'escissione.</li>
		<li>Risospendere la precipitazione con una soluzione di gradiente di densità del 55% del 55% e centrifugare a 10.000 x g per 1 min.</li>
		<li>Risospendere la precipitazione con 1 mL di PBS e contare gli sporozoiti utilizzando un emocitometro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Raccolta e purificazione dei merozoiti di E. necatrix
NOTA: utilizzare i polli da carne Arbor Acre di età compresa tra 7 e 14 d nell'esperimento. I polli senza coccidia (n. 3) sono stati inoculati con 2 x 105 ovociti di E. necatrix. A 109 h dopo l'infezione, gli uccelli sono stati sacrificati dalla lussazione cervicale. L'intestino è stato rimosso per la raccolta dei merozoiti di 2di maestra. Per diverse specie di Eimeria, c'era un tempo diverso per la raccolta dei merozoiti di secondagenerazione: E. necatrix a 109 h, ed E. tenella a 112 h post-inoculazione. Per la trafezione di E. necatrix,i merozoiti sono la scelta ottimale in quanto i secondi merozoiti sono facili da purificare.
<ol><li>Collezione dei merozoiti di seconda generazione di E. necatrix
	<ol>
<li>Tagliare il pollo alla longitudine, dal gambo del tuorlo (al centro dell'intestino tenue) all'orifizio ileocecal, e lavarlo con PBS o HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) delicatamente tre volte in un piatto Petri.</li>
		<li>Tagliare l'intestino a pezzi di 0,5 cm x 0,5 cm e metterlo in un pallone conico con un buffer di digestione (Tabella 1). Collocare il flacone su un miscelatore magnetico a 37 gradi centigradi con una barra di agitazione per 30-60 min per rilasciare i merozoiti. Dopo 30 min di incubazione, monitorare il rilascio di merozoiti con esame microscopico ogni 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificare i merozoiti filtrazione e centrifugazione.<ol>
<li>Filtrare le sospensioni contenenti merozoiti digeriti utilizzando quattro strati di garza14e centrifugare a 600 x g per 10 min.</li>
		<li>Dopo la centrifuga, scartare il supernatante contenente i detriti intestinali. Trasferire la precipitazione con merozoiti purificati a tubi da 1,5 mL.</li>
		<li>Risospendere la precipitazione con 1 mL di PBS e contare i merozoiti utilizzando un emocitometro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Nucleofezione di merozoiti o sporozoiti
<ol><li>Preparazione prima della nucleofezione dei parassiti<ol>
<li>Preparare circa 107 merozoiti o sporozoiti in un tubo. Se trasfecare i merozoiti, preparare 3-4 tubi.</li>
		<li>Preparare una quantità di DNA plasmide o frammento di PCR purificato maggiore o uguale a 10 g. NOTA: Il plasmide utilizzato in questo studio contiene 2 geni: proteina fluorescente gialla avanzata (EYFP) e sintesi diidrofolata reducitto tiromidillatico derivata da Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15.</li>
		<li>Preparare 25 U di enzima di restrizione. Se i plasmidi sono linearizzati, l'enzima di restrizione può migliorare l'efficienza della trasfezione. Se i plasmidi sono circolari, omettere l'enzima di restrizione.</li>
		<li>Preparare 85 l di buffer di nucleofezione: mescolare 20 l di buffer di nucleofezione I e 1 mL di buffer di nucleofezione II, e utilizzare una parte della soluzione. Il volume del buffer totale è 100.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nucleofezione<ol>
<li>Centrifugare la sporozoite o la sospensione di merozoite a 600 x g per 10 min. Poi scartare il super-natante.</li>
		<li>Nell'ordine seguente, aggiungere 85 l di buffer di trasfezione nucleare, 10 g di plasmide (frammento PCR) e 25 U di enzima di restrizione (di solito 5) nel tubo da 1,5 mL contenente sporozoiti o merozoiti.</li>
		<li>Trasferire la sospensione in una coppa di trasfezione nucleare. Metti la tazza in una scanalatura di trasferimento nucleare.</li>
		<li>Accendere il dispositivo di nucleofezione utilizzando il pulsante di accensione e selezionare la procedura di trasfezione U-033. Se il dispositivo di nucleofezione si avvia nella modalità Scelta programma libero, uscire da questa modalità premendo il pulsante X.</li>
		<li>Al termine del programma, premere il pulsante X del dispositivo di nucleofezione e sullo schermo dovrebbe essere visualizzato OK, a indicare che la nucleoflessione ha esito positivo.</li>
		<li>Aggiungere 0,5-1 mL di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)8 alla coppa di nucleofezione per fermare la reazione e trasferire la sospensione a tubo da 1,5 mL dopo aver miscelato delicatamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Inoculazione cloaca o iniezione endovenosa
<ol><li>Inoculare i parassiti nucleofettati in polli vecchi di 7 giorni. Inoculare le merozoites di E. necatrix o le sporozoites di E. tenella attraverso il percorso cloacale, ma inoculare E. acervulina sporozoites tramite iniezione endovenosa. Inoculare circa 2 x 107 milioni di sporozoiti in ogni pollo, e incoluate merozoites 107 per ogni uccello.</li>
</ol>5. Propagazione e smistamento FACS
<ol><li>Raccogliere le oocisti dalle feci 5-9 giorni dopo l'inoculazione con sporozoiti trasmutati. Raccogliere le oocisti il terzo giorno dopo l'inoculazione con merozoiti trasmissi.</li>
	<li>Utilizzare lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) e 150 mg/kg di pirilatamina8 per aumentare successivamente il rapporto tra popolazione transgenica. NOTA: Utilizzare la pirimethamina aggiungendola direttamente nel feed. Per un uso più conveniente, preparare pirrimethamina solubile in acqua. Sciogliere 1 g di pirithamina in 0,2 mL pf H2SO4 e 9,8 mL di pirrododone n-metilico (NMP), quindi aggiungere 1,5 mL di questa soluzione di stock in 1 L di acqua potabile per gli uccelli.</li>
</ol>6. Purificazione facoltativa colonna
NOTA: Se sono necessari più sporozoiti o merozoiti puri, c'è un metodo opzionale che li purifica attraverso una colonna di cellulosa dietilaminoethyl-52 (DE-52 cellulosa).
<ol><li>Preparare la colonna di cellulosa DE-52 con almeno un giorno di anticipo.<ol>
<li>Preparare il buffer eluente della glicina (tabella 1). Regolare il pH del buffer eluente di glicina da 7,6 a 8,0 e preriscaldato a 41 gradi centigradi.</li>
		<li>Aggiungere 2,5 g di cellulosa DE-52 alla colonna. Aggiungere acqua e ammollo durante la notte. Scartare il super-attardato.</li>
		<li>Aggiungere acqua e ammollo per 1 h. Scartare il supernatante.</li>
		<li>Aggiungere 0,1 M di NaOH e immergere per almeno 2 ore. Ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Sostituire il supernatante con acqua. Dopo che la cellulosa si deposita completamente verso il basso (circa mezz'ora), ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Scartare il supernatante, aggiungere 0,1 M HCl e immergere per almeno 2 ore. Ripetere questo passaggio.</li>
		<li>Scartare il supernatante e immergere la cellulosa due volte con tampone eluente di glicina.</li>
		<li>Misurare e regolare il pH da 7,6 a 8,0 aggiungendo 0,1 M HCl o 0,1 M NaOH. NOTA: In questa parte, il liquido ha almeno 5 volte più volume di quello della cellulosa DE-52.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Regolare la portata tra 40-50 r/min.</li>
	<li>Quando la sedimentazione della cellulosa è completata, aggiungere la sporozoite o la sospensione della merozoite alla colonna cromatografica. Regolare la portata a 30-40 r/min. NOTA: Risospendere la sporozoite o la precipitazione di merozoite con tampone eluente di glicina prima di aggiungere la colonna cromatografica.</li>
	<li>Raccogliere con tampone eluente di glicina in tubi da 50 mL. Interrompere la raccolta in base ai risultati dell'esame microscopico di sporozoiti o merozoiti durante il processo di eluizione.</li>
	<li>Centrifugare il buffer eluente di glicina raccolto a 600 x g per 10 min. Trasferire la precipitazione sporozoite o merozoite a nuovi tubi da 1,5 mL.</li>
	<li>Contare gli sporozoiti o i merozoiti usando un emocitometro.</li>
</ol>

<ol><li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox%2C+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li>
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</ol>

Negli anni '90, è stato sviluppato un sistema di trasfezione per i parassiti apicomplessi, ed è stato utilizzato per studi sui parassiti eimeri. Recentemente, la trasfezione stabile è stata condotta in E. tenella8,9 e E. nieschulzi15. Abbiamo raggiunto la trasfezione stabile di E. necatrix traducendo merozoiti di seconda generazione11. L'inoculazione delle sporozoiti trasfette di E. ac...

Eimeria spp. provoca coccidiosi, che porta a notevoli perdite economiche nell'industria zootecnica e avicola. Anche se i farmaci anticcidi, e in una certa misura, attenuati i vaccini anticcidi, sono stati ampiamente utilizzati per il controllo della coccidiosi, ci sono ancora carenze per quanto riguarda la loro resistenza ai farmaci, i residui di farmaci e la potenziale diffusione di ceppi di vaccino che riacquistano la virulenza1. Con lo sviluppo della biologia molecolare, la trasfezione è diventata uno strumento vitale per studiare le funzioni genetiche, sviluppare nuovi vaccini e vagliare nuovi bersagli farmacologici per Eimeria.
Negli ultimi decenni, la trasfezione è stata applicata con successo per parassiti apicomplessi come Plasmodium e Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Uno studio condotto su z-gal come reporter per la trasfezione in E. tenella ha sperimentato tale lavoro in Eimeria7. La trasfezione di E. tenella8,9, E. mitis10ed E. acervulina (et al., dati inediti) ebbe successo nei polli. Recentemente, abbiamo raggiunto la trasfezione usando merozoiti di E. necatrix attraverso la nucleofezione11.
Gli studi hanno dimostrato che Eimeria che esprime un antigene eteologo ha il potenziale per essere sviluppata come vaccino ricombinante, come quelli che esprimono L'antigene A (CjaA) o l'interleumina di pollo 2 (chIL-2)12,13. Pertanto, questo protocollo descrive uno studio di nucleofezione di Eimeria spp. in polli. La procedura descrive la purificazione di sporozoiti o merozoiti, la nucleofezione con DNA plasmide, l'inoculazione cloasnica/iniezione endovenosa e la propagazione in vivo per aiutare i ricercatori ad avviare studi sui parassiti eimeria transgenici.

<table><tbody><tr><td>ATP-disodico</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Cellulosa DE-52</td><td>Solarbio</td><td>C8350</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a flusso costante</td><td>SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.</td><td>HL-2B</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>MACGENE</td><td></td><td></td></tr> CM15019 <tr><td>Perle di vetro</td><td>Sigma</td><td>Z250473-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>n. V900116</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Biotopped</td><td>G6200</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>MACGENE</td><td>CC016</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>n. V900041</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga a bassa velocità</td><td>BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.</td><td>DT5-2</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore magnetico</td><td>SCILOGEX</td><td>MS-H280-Pro</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>449164</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare MoFlo</td><td>BeckMan Coulter, US</td><td>201309995</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di nucleofeczione</td><td>LONZA/amaxa</td><td>90900012 (Nucleofector II)</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (soluzione madre a gradiente DG)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Taurodesossicolato di sodio idrato</td><td>Sigma</td><td>T0875</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>La composizione del DMEM: 4,5 g/L di glucosio con piruvato di sodio, L-glutammina e 25 mM di HEPES.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Solarbio</td><td>T8150</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Pechino Nord TZ-Biotech Develop.co.</td><td>HQ-60-II</td><td></td></tr><tr><td>Termostato per bagnomaria</td><td>Grant Instruments (Cambridge), Ltd.</td><td>GD120,GM0815010</td><td></td></tr></tbody></table>

nucleofezione e propagazione in vivo dei parassiti dell'emeria del pollo

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

La trasfezione è un processo tecnico attraverso il quale il materiale genetico, come il DNA e l'RNA a doppio filamento, vengono consegnati nelle cellule per modificare il gene di interesse. Attualmente, la tecnologia transgenica sta diventando uno strumento indispensabile per lo studio di Eimeria, gli agenti causali della coccidiosi nel pollame e nel bestiame. Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata della trasfezione stabile nei parassiti emerici: purificazione e nucleofezione di sporozoiti o merozoiti di seconda generazione, e propagazione in vivo di parassiti trasmutati. Utilizzando questo protocollo, abbiamo raggiunto la trasfezione in diverse specie di Eimeria. Nel loro insieme, la nucleofezione è uno strumento utile per facilitare la manipolazione genetica nei parassiti emerici.

Questo protocollo è stato utilizzato per trasfect parassiti eimeri. In questo studio, le merontes di 2nd generazione e merozoites di E. necatrix sono stati mostrati in Figura 2A e Figura 2B, mentre Figura 2C e Figura 2D ha mostrato le sporocisti e sporozoites di E. tenella do...

Qui, abbiamo fornito un metodo per ottenere una trasfezione stabile dei parassiti dell'Eimeria di pollo nucleofecting sporozoiti o merozoiti di seconda generazione. I parassiti eimeri geneticamente modificati che esprimono geni antigenici eterologi potrebbero essere usati come veicoli per la somministrazione di vaccini.

Nucleofezione e Propagazione In Vivo dei Parassiti dell'Emeria del Pollo

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

La definizione di protocolli di trasfezione per le specie Eimeria aiuterebbe a far progredire lo studio delle funzioni geniche, sviluppando nuovi vaccini e vagliando nuovi obiettivi farmacologici per Eimeria. Usando questa tecnica, abbiamo raggiunto la trasfezione di diverse specie di Eimeria e la nucleofezione è uno strumento utile per facilitare l'applicazione della manipolazione genetica nei parassiti eimeriani. La nucleofezione di Eimeria fornisce un riferimento per la trasfezione di altri parassiti che non possono essere coltivati in vitro e accelereranno lo studio della loro manipolazione genetica.Se provi questa tecnica per la prima volta, dovresti preparare bene tutti i reagenti e i loro strumenti prima dell'inizio della trasfezione per evitare la corsa durante l'esperimento. La realizzazione di questo metodo aiuta le persone che si concentrano sulla trasfezione di Eimeria a vedere gli intricati dettagli di questo esperimento. Per iniziare con il rilascio di sporocista, centrifugare uno per 10 alle sette ovocitosi sporulate in soluzione di dicromato di potassio a 2.300 volte g per cinque minuti.Lavarli con PBS tre volte. Resuspend il pellet con un millilitro di PBS e trasfe

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Utilizzando punta fine micropipette iniettiamo DNA plasmidico in sottodomini di somiti pollo o tubi neurali. La concentrazione del plasmide è regolata per generare solo cellule transfettate. Abbiamo poi permettere alle cellule di trasformarsi in popolazioni clonale.

Cella Transfection singola in embrioni di pollo

Un metodo di trasferimento genico in embrioni di pollo in fasi successive di incubazione (più di Hamburger e Hamilton stadio (HH) 22) è descritto. Questo metodo supera...

Il trasferimento genico in embrioni di pollo da anziani<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elettroporazione

Fonte: Yates, J. G. E., et al. Produzione di virus ricombinante della malattia di Newcastle ad alto titolo a partire dal liquido allantoinico. J. Vis. Exp. (2022)Il video illustra la purificazione e la concentrazione di particelle virali da liquido allantocoico chiarificato ottenuto da uova di pollo embrionate infette da virus. Vengono mostrate una serie di fasi di filtrazione e separazione, tra cui la filtrazione a profondità, la filtrazione a flusso tangenziale e l'ultracentrifugazione su...

Purificazione del virus dal liquido allantoideo di uova di pollo embrionate

In questo video, descriviamo la nucleofection, una procedura di trasfezione basata sull'elettroporazione per fornire DNA plasmidico codificante una proteina reporter fluorescente nella forma sporozoite del parassita Eimeria del pollo.

Nucleofection of Parameter Forms: un metodo di trasfezione basato sull'elettroporazione per fornire plasmidi codificanti proteine fluorescenti nel nucleo di sporozoite

Pulcino colture di cellule della retina embrionali costituiscono validi strumenti per lo studio della biologia dei fotorecettori. Abbiamo sviluppato una tecnica di trasferimento genico efficace sulla base di ex ovo plasmide elettroporazione delle retine precedenti alla cultura. Questa tecnica aumenta considerevolmente l'efficienza di transfezione su protocolli attualmente disponibili, rendendo la manipolazione genetica fattibile per questo sistema.

Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An Ex-ovo Elettroporazione Approach

Le uova di gallina fertili sono ampiamente utilizzate per produrre grandi quantità di virus dell'influenza A umana in quanto forniscono un sistema conveniente ed economico per dimostrare alti rendimenti di virus.

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

La diagnosi di infezione da Eimeria nei polli rimane impegnativa. Gli approcci guidati dalla morfologia dei parassiti e dalla patologia dell'ospite sono comunemente inconcludenti, mentre gli approcci molecolari basati sulla PCR si sono dimostrati impegnativi in termini di costi e competenze. Lo scopo di questo protocollo è quello di stabilire l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) come diagnostica molecolare semplice per l'infezione di Eimerian.

Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica<em&gt; Eimeria</em&gt; Che infettano Polli

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di descrivere come eseguire l'iniezione intracellulare ovo di materiali esogeni in embrioni di pollo. Questo approccio è molto utile per studiare la biologia dello sviluppo degli embrioni di pollo.

In zona Ovo Iniezione intravascolare in embrioni di pollo

Questo metodo presenta l'embrione di pollo come un modello in vivo semplice ed economico per far rivivere il patogeno batterico L. monocytogenes da uno stato vitale ma non coltivabile (VBNC) e con potenziali ulteriori usi nella comprensione dei meccanismi di dormienza batterica.

L'embrione di pollo come modello in vivo per rianimare patogeni vitali ma non coltivabili

Propagazione di staminali embrionali umane (ES) Cellule

Impara la nucleofezione di sporozoi e merozoi di Eimeria per la manipolazione genetica di parassiti del pollo. Questo metodo facilita lo sviluppo di vaccini e lo screening di nuovi bersagli farmacologici.

Nucleofezione e Propagazione In Vivo dei Parassiti dell'Emeria del Pollo

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