Name: Modello murino in vivo di infezione da impianto spinale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Scopri un modello murino in vivo per studiare le infezioni da impianto spinale utilizzando Staphylococcus aureus bioluminescente. Questo metodo consente il monitoraggio longitudinale del carico batterico in tempo reale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori vorrebbero riconoscere la ricezione sia della Pediatric Orthopaedic Society of North America Biomet Spine Grant che del National Institutes of Health Clinical and Translational Science Institute KL2 Grant, e della HH Lee Surgical Research Grant come principali fonti di finanziamento per questi esperimenti.

Tutti gli animali sono stati trattati in stretta conformità con le buone pratiche animali, come definito nei regolamenti federali come stabilito nell'Animal Welfare Act (AWA), nella Guida del 1996 per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, nella politica PHS per la cura e l'uso umano degli animali da laboratorio, nonché nelle politiche e procedure dell'istituzione come stabilito nel Manuale di formazione per la cura e l'uso degli animali. e tutto il lavoro sugli animali è stato approvato dal Comitato per la Ricerca Animale (ARC) del Cancelliere dell'Università della California di Los Angeles.
1. Scelta del ceppo bioluminescente di S. aureus
<ol><li>Utilizzare il ceppo bioluminescente di S. aureus Xen36 come inoculo di interesse. NOTA: Questo ceppo è stato derivato dal ceppo parentale S. aureus ATCC-49525, che è un isolato clinico di un paziente settico. S. aureus Xen36 utilizza in modo univoco un operone ABCDE lux, che è ottimizzato e integrato nel plasmide nativo dell'ospite. 19 Di conseguenza, il ceppo Xen36 è in grado di produrre una luce bioluminescente blu-verde con un'emissione di lunghezza d'onda di picco di 490 nm. Questo segnale di emissione è prodotto solo da organismi batterici metabolicamente attivi viventi.</li>
</ol>2. Preparazione di S. aureo per inoculazione
<ol><li>Aggiungere 200 μg/mL di kanamicina al brodo di Luria più l'1,5% di agar per isolare S. aureus Xen36 da potenziali contaminanti, utilizzando il gene di resistenza alla kanamicina legato all'operone lux 19.</li>
	<li>Versare i batteri S. aureus Xen36 su piastre di agar di soia triptica (brodo di soia triptico [TSB] più 1,5% di agar) e incubare a 37 °C per 12-16 ore.</li>
	<li>Isolare singole colonie di S. aureus Xen36 e colcolare singolarmente in TSB per 12-16 ore a 37 °C in un incubatore ad agitazione (200 giri/min).</li>
	<li>Diluire la coltura risultante in un rapporto 1:50.</li>
	<li>Coltura per ulteriori 2 ore a 37 °C per isolare i batteri in fase mediologaritmica.</li>
	<li>Pellettare, risospendere e lavare i batteri in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) tre volte.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 600 nm. L'OD600 ideale è compreso tra 0,700 e 0,750 che corrisponde a 4x105 CFU/mL. Eseguire diluizioni seriali per ottenere l'inoculo batterico desiderato (1 x 103 CFU/2 μL). NOTA: La concentrazione ottimale di Xen36 per l'instaurarsi di un'infezione cronica è risultata essere 1 x 103 CFU. Un dosaggio più basso di batteri è stato eliminato dal sistema immunitario dell'ospite e un dosaggio più elevato ha causato la rottura della ferita. La rottura della ferita non distingue tra un'infezione profonda dell'impianto e un'infezione superficiale della ferita e viene quindi evitata in questo modello (Figura 1)20.</li>
</ol>3. Topi
<ol><li>Utilizzare topi maschi di tipo selvatico C57BL/6J di 12 settimane.</li>
	<li>Topi domestici in gabbie con un massimo di 4 alla volta.</li>
	<li>Tenere sempre a disposizione l'acqua. Mantenere un ciclo luce/buio di 12 ore e non eseguire esperimenti durante la fase oscura del ciclo.</li>
	<li>Utilizzare cibo privo di erba medica per l'alimentazione a causa della potenziale interferenza con la segnalazione fluorescente.</li>
	<li>Chiedere al personale di ricerca o veterinario di valutare quotidianamente i topi per garantire il benessere degli animali durante l'intero esperimento.</li>
</ol>4. Procedure chirurgiche del topo
<ol><li>Indurre l'anestesia mettendo i topi in una camera di isoflurano (2%) per circa 5 minuti. Confermare l'appropriata profondità dell'anestesia monitorando che la respirazione rimanga ritmica e più lenta rispetto a quando si è svegli e non cambi in risposta a stimoli nocivi (ad esempio, manipolazione chirurgica, pizzicamento delle dita dei piedi).</li>
	<li>Trasferire i topi anestetizzati in una stazione di preparazione e rimuovere i peli dall'osso sacro alla colonna vertebrale toracica superiore con tosatrici per roditori.</li>
	<li>Pulisci e sterilizza la pelle con tripli lavaggi di soluzione alternata di betadina e alcol isopropilico.</li>
	<li>Trasferire topi anestetizzati e sterilizzati in posizione prona su un letto chirurgico sterile mantenendo l'anestesia con somministrazione di isoflurano per via inalatoria (2%) tramite cono nasale.</li>
	<li>Flettere al massimo i fianchi e identificare la posizione del ginocchio a livello della colonna vertebrale per approssimare il corpo vertebrale lombare 4.</li>
	<li>Praticare un'incisione longitudinale di 2 cm attraverso la pelle con un bisturi chirurgico a 15 lame.</li>
	<li>Palpare i processi spinosi per confermare la linea mediana e continuare l'incisione fino all'osso.</li>
	<li>Sezionare sottoperiostale sul lato destro del processo spinoso L4, estendendosi lateralmente al processo trasverso.</li>
	<li>Passare una sutura intrecciata assorbibile di misura 5-0 cefalad e caudad al corpo L4 attraverso la fascia e lasciare aperta, in preparazione per la futura chiusura.</li>
	<li>Utilizzando un ago spinale da 25 G, alesare il processo spinoso di L4 utilizzando un ago spinale da 25 G e inserire un impianto chirurgico in acciaio inossidabile di grado "L" di 0,1 mm di diametro, lungo 1 cm, lungo 1 cm lungo la lamina con il braccio lungo che posa cefalica.</li>
	<li>Inoculare l'impianto con 1 x 103 CFU/2 μL di S. aureus Xen36 bioluminescente, avendo cura di assicurarsi che tutta la soluzione entri in contatto con l'impianto.</li>
	<li>Attendere circa 10 secondi prima di legare la sutura assorbibile precedentemente passata dopo l'inoculazione per garantire il contenimento dell'inoculo sull'impianto.</li>
	<li>Chiudi la pelle in modo da corsa con sutura riassorbibile.</li>
	<li>Somministrare farmaci antidolorifici tramite iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,1 mg/kg) immediatamente dopo postop e poi ogni 12 ore per 3 giorni successivi.</li>
	<li>Recupera i mouse su un termoforo e monitora il ritorno alla normale attività.</li>
	<li>Ottenere radiografie postoperatorie per confermare il posizionamento appropriato dell'impianto.</li>
</ol>5. Imaging longitudinale in bioluminescenza in vivo per misurare la carica batterica
<ol><li>Anestetizzare i topi con isoflurano per via inalatoria (2%). Confermare l'appropriata profondità dell'anestesia monitorando che la respirazione rimanga ritmica e più lenta rispetto a quando si è svegli e non cambi in risposta a stimoli nocivi (ad esempio, manipolazione chirurgica, pizzicamento delle dita dei piedi).</li>
	<li>Rimuovere i peli dall'osso sacro alla parte superiore della colonna vertebrale toracica con un tagliarodi.</li>
	<li>Caricare i topi sul campo visivo della piattaforma di imaging bioluminescente per eseguire l'imaging a bioluminescenza (BLI) in vivo19.</li>
	<li>Cattura il segnale bioluminescente in un tempo di acquisizione di 5 minuti. Utilizzare impostazioni di binning di grandi dimensioni con un campo visivo di 15 cm (B).</li>
	<li>Ripetere i passaggi 5.1-5.4 nei giorni postoperatori 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 e 35 (o altri giorni in base a un disegno sperimentale specifico) per monitorare la carica batterica.</li>
	<li>Presenta i dati BLI tramite scala di colori e sovrapposizione su una fotografia in scala di grigi. Isolare una regione di interesse ovoidale (ROI) standard utilizzando il software BLI per quantificare il BLI nel flusso totale (fotoni al secondo) o nel flusso massimo medio (fotoni/secondo/centimetro2/steradiante).</li>
</ol>6. Quantificare i batteri aderenti agli impianti e ai tessuti circostanti
<ol><li>Sopprimere i topi con POD 35 o una data post-operatoria alternativa a scelta con esposizione all'anidride carbonica in conformità con le linee guida AVMA. Confermare l'eutanasia con lussazione cervicale secondaria.</li>
	<li>Sterilizzare la pelle dorsale secondo il passaggio 4.3 e posizionare il topo prono su un campo chirurgico sterile.</li>
	<li>Incidere nettamente l'incisione precedente utilizzando un bisturi chirurgico a 15 lame.</li>
	<li>Utilizzare forbici sterili per sezionare senza mezzi termini il processo spinoso L4 e identificare l'impianto chirurgico.</li>
	<li>Utilizzare un cacciavite ad ago per ruotare delicatamente e rimuovere l'impianto dalla sua posizione nel processo spinoso L4.</li>
	<li>Utilizzando pinze e forbici sterili, prelevare circa 0,1 g di osso spinoso e tessuto molle immediatamente circostante l'impianto chirurgico e posizionare 1 ml di PBS in un piccolo tubo conico di rinoceronte con 4 perline omogeneizzanti affilate.</li>
	<li>Registrare il peso dei tessuti molli pesando una provetta conica prima e dopo il raccolto.</li>
	<li>Posizionare l'impianto in 0,5 ml di Tween-80 allo 0,3% in TSB e sonicare per 15 minuti.</li>
	<li>Vorticare la sospensione dell'impianto risultante per 2 minuti e coltura durante la notte per 12-16 ore.</li>
	<li>Omogeneizzare i tessuti molli e i processi spinosi precedentemente inseriti in 1 ml di PBS che circonda l'impianto utilizzando l'omogeneizzatore.</li>
	<li>Agitare la sospensione dei tessuti molli risultante per 5 minuti e coltura per una notte per 12-16 ore.</li>
	<li>Dopo la coltura notturna, contare rispettivamente la CFU dall'impianto e dai tessuti circostanti. Esprimere il valore come CFU/g totali raccolti per i tessuti molli e CFU/mL per l'impianto sonicato.</li>
</ol>

<ol><li>Verdrengh, M., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+neutrophils+in+experimental+septicemia+and+septic+arthritis+induced+by+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of neutrophils in experimental septicemia and septic arthritis induced by Staphylococcus aureus.</a> Infection and Immunity. 65 (7), 2517-2521 (1997).</li>
<li>Fang, A., Hu, S. S., Endres, N., Bradford, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+infection+after+spinal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Risk factors for infection after spinal surgery.</a> Spine. 30 (12), Phila Pa. 1460-1465 (2005).</li>
<li>Levi, A. D., Dickman, C. A., Sonntag, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+postoperative+infections+after+spinal+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Management of postoperative infections after spinal instrumentation.</a> Journal of Neurosurgery. 86 (6), 975-980 (1997).</li>
<li>Weinstein, M. A., McCabe, J. P., Cammisa, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+spinal+wound+infection%3A+a+review+of+2%2C391+consecutive+index+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Spinal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Postoperative spinal wound infection: a review of 2,391 consecutive index procedures.</a> Journal of Spinal Disorders. 13 (5), 422-426 (2000).</li>
<li>Picada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+deep+wound+infection+in+adults+after+posterior+lumbosacral+spine+fusion+with+instrumentation%3A+incidence+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Spinal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Postoperative deep wound infection in adults after posterior lumbosacral spine fusion with instrumentation: incidence and management.</a> Journal of Spinal Disorders. 13 (1), 42-45 (2000).</li>
<li>Smith, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+infection+after+spine+surgery+based+on+108%2C419+procedures%3A+a+report+from+the+Scoliosis+Research+Society+Morbidity+and+Mortality+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Rates of infection after spine surgery based on 108,419 procedures: a report from the Scoliosis Research Society Morbidity and Mortality Committee.</a> Spine. 36 (7), Phila Pa. 556-563 (2011).</li>
<li>Abbey, D. M., Turner, D. M., Warson, J. S., Wirt, T. C., Scalley, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+postoperative+wound+infections+following+spinal+fusion+with+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Spinal+Disorders%22%5BJournal%5D)">Treatment of postoperative wound infections following spinal fusion with instrumentation.</a> Journal of Spinal Disorders. 8 (4), 278-283 (1995).</li>
<li>Silber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+postprocedural+discitis%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Management of postprocedural discitis.</a> Spine Journal. 2 (4), 279-287 (2002).</li>
<li>Pappou, I. P., Papadopoulos, E. C., Sama, A. A., Girardi, F. P., Cammisa, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+infections+in+interbody+fusion+for+degenerative+spinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Postoperative infections in interbody fusion for degenerative spinal disease.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 444, 120-128 (2006).</li>
<li>Sampedro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biofilm+approach+to+detect+bacteria+on+removed+spinal+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">A biofilm approach to detect bacteria on removed spinal implants.</a> Spine. 35 (12), Phila Pa. 1218-1224 (2010).</li>
<li>Pull ter Gunne, A. F., Mohamed, A. S., Skolasky, R. L., van Laarhoven, C. J., Cohen, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presentation%2C+incidence%2C+etiology%2C+and+treatment+of+surgical+site+infections+after+spinal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">The presentation, incidence, etiology, and treatment of surgical site infections after spinal surgery.</a> Spine. 35 (13), Phila Pa. 1323-1328 (2010).</li>
<li>Olsen, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+surgical+site+infection+in+spinal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Risk factors for surgical site infection in spinal surgery.</a> Journal of Neurosurgery. 98, 2 Suppl 149-155 (2003).</li>
<li>Ofluoglu, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant-related+infection+model+in+rat+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Orthopaedic+and+Trauma+Surgery%22%5BJournal%5D)">Implant-related infection model in rat spine.</a> Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 127 (5), 391-396 (2007).</li>
<li>Guiboux, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+prophylactic+antibiotics+in+spinal+instrumentation.+A+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">The role of prophylactic antibiotics in spinal instrumentation. A rabbit model.</a> Spine. 23 (6), Phila Pa. 653-656 (1998).</li>
<li>Stavrakis, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Animal+Models+of+Postoperative+Spine+Infection+and+Potential+Future+Advances%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Current Animal Models of Postoperative Spine Infection and Potential Future Advances.</a> Frontiers in Medicine (Lausanne). 2, 34(2015).</li>
<li>Pribaz, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+chronic+post-arthroplasty+infection%3A+noninvasive+in+vivo+bioluminescence+imaging+to+monitor+bacterial+burden+for+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse model of chronic post-arthroplasty infection: noninvasive in vivo bioluminescence imaging to monitor bacterial burden for long-term study.</a> Journal of Orthopaedic Research. 30 (3), 335-340 (2012).</li>
<li>Bernthal, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+post-arthroplasty+Staphylococcus+aureus+joint+infection+to+evaluate+in+vivo+the+efficacy+of+antimicrobial+implant+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings.</a> PLoS One. 5 (9), 12580(2010).</li>
<li>Niska, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+bacterial+burden%2C+inflammation+and+bone+damage+longitudinally+using+optical+and+muCT+imaging+in+an+orthopaedic+implant+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring bacterial burden, inflammation and bone damage longitudinally using optical and muCT imaging in an orthopaedic implant infection in mice.</a> PLoS One. 7 (10), 47397(2012).</li>
<li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+bioluminescent+Staphylococcus+aureus+infections+in+living+mice+using+a+novel+luxABCDE+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct.</a> Infection and Immunity. 68 (6), 3594-3600 (2000).</li>
<li>Dworsky, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+vivo+mouse+model+of+implant+related+spine+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Novel in vivo mouse model of implant related spine infection.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).</li>
<li>Hegde, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+telavancin+against+heterogeneous+vancomycin-intermediate+Staphylococcus+aureus+%28hVISA%29+in+vitro+and+in+an+in+vivo+mouse+model+of+bacteraemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Activity of telavancin against heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) in vitro and in an in vivo mouse model of bacteraemia.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 65 (4), 725-728 (2010).</li>
<li>Crandon, J. L., Kuti, J. L., Nicolau, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+efficacies+of+human+simulated+exposures+of+telavancin+and+vancomycin+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+with+a+range+of+vancomycin+MICs+in+a+murine+pneumonia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparative efficacies of human simulated exposures of telavancin and vancomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus with a range of vancomycin MICs in a murine pneumonia model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 5115-5119 (2010).</li>
<li>Reyes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+telavancin+in+a+murine+model+of+bacteraemia+induced+by+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Efficacy of telavancin in a murine model of bacteraemia induced by methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 58 (2), 462-465 (2006).</li>
<li>Sakoulas, G., Eliopoulos, G. M., Alder, J., Eliopoulos, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+daptomycin+in+experimental+endocarditis+due+to+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Efficacy of daptomycin in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (5), 1714-1718 (2003).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatory+antibiotic+therapy+increases+rate+of+bacterial+kill+but+not+final+outcome+in+a+novel+mouse+model+of+Staphylococcus+aureus+spinal+implant+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Combinatory antibiotic therapy increases rate of bacterial kill but not final outcome in a novel mouse model of Staphylococcus aureus spinal implant infection.</a> PLoS One. 12 (2), 0173019(2017).</li>
<li>Poelstra, K. A., Barekzi, N. A., Grainger, D. W., Gristina, A. G., Schuler, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+spinal+implant+infection+model+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">A novel spinal implant infection model in rabbits.</a> Spine. 25 (4), Phila Pa. 406-410 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Le infezioni correlate all'impianto nella colonna vertebrale fanno presagire esiti negativi per i pazienti 1,2,3,4,5. A differenza di molte altre aree del corpo, l'hardware infetto nella colonna vertebrale spesso non può essere rimosso a causa del rischio di instabilità e compromissione neurologica. Questa sfida unica nel contesto dei batteri a biofilm resiste...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60560">In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection</a>. The Authors section was updated from:
Benjamin V. Kelley1 
Stephen D. Zoller1 
Danielle Greig1 
Kellyn Hori1 
Nicolas Cevallos1 
Chad Ishmael1 
Peter Hsiue1 
Rishi Trikha1 
Troy Sekimura2 
Thomas Olson2 
Ameen Chaudry2 
Michael M. Le2 
Anthony A. Scaduto1 
Kevin P. Francis1 
Nicholas M. Bernthal1 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles 
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles
to:
Benjamin V. Kelley1 
Christopher Hamad1 
Stephen D. Zoller1 
Danielle Greig1 
Zeinab Mamouei1 
Rene Chun1 
Kellyn Hori1 
Nicolas Cevallos1 
Chad Ishmael1 
Peter Hsiue1 
Rishi Trikha1 
Troy Sekimura2 
Brandon Gettleman3 
Autreen Golzar2 
Adrian Lin2 
Thomas Olson2 
Ameen Chaudry2 
Michael M. Le2 
Anthony A. Scaduto1 
Kevin P. Francis1 
Nicholas M. Bernthal1 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of California Los Angeles 
2David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles 
3University of South Carolina School of Medicine, University of South Carolina

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60560">In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection</a>. The Authors section was updated.

Erratum: In vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection

Lo scopo di questo metodo è quello di descrivere un nuovo modello murino di infezione da impianto spinale (SII). Questo modello è stato progettato per fornire uno strumento economico e accurato per valutare in modo flessibile l'effetto delle variabili dell'ospite, dell'agente patogeno e/o dell'impianto in vivo. Il test di potenziali terapie e strategie di trattamento per le infezioni da impianti spinali in questo modello ha lo scopo di guidare lo sviluppo della ricerca prima dell'applicazione in modelli animali più grandi e studi clinici.
L'infezione correlata all'impianto dopo un intervento chirurgico alla colonna vertebrale è una complicanza devastante e purtroppo si verifica in circa il 3-8% dei pazienti sottoposti a chirurgia elettiva della colonna vertebrale 1,2,3,4,5 e fino al 65% dei pazienti sottoposti a chirurgia multilivello o di revisione 6. Il trattamento delle infezioni da impianti spinali spesso richiede più ricoveri, più interventi chirurgici e una terapia antibiotica prolungata. Le SII fanno presagire esiti negativi per i pazienti, tra cui compromissione neurologica, disabilità e un aumento del rischio di mortalità. La gestione della SII è estremamente costosa e costa fino a 900.000 dollari per paziente7.
Lo Staphylococcus aureus è il patogeno virulento più comune di SII 8,9,10,11. I batteri possono seminare l'hardware direttamente durante l'intervento chirurgico, attraverso la ferita durante il periodo postoperatorio o successivamente attraverso la diffusione ematogena. In presenza di impianti metallici, S. aureus forma un biofilm che protegge i batteri dalla terapia antibiotica e le cellule immunitarie. Sebbene la rimozione dell'hardware infetto possa aiutare a sradicare efficacemente un'infezione, ciò non è spesso fattibile nella colonna vertebrale senza causare destabilizzazione e rischiare una compromissione neurologica12.
In assenza di espianto di hardware infetto, sono necessari nuovi approcci per prevenire, rilevare e trattare la SII. Storicamente, ci sono stati modelli animali limitati di SII per valutare in modo efficiente la sicurezza e l'efficacia di nuove terapie. I precedenti modelli animali di SII richiedevano un gran numero di animali e la raccolta di dati che richiedevano l'eutanasia, tra cui il conteggio delle colonie, l'istologia e la coltura13,14,15. Mancando di un monitoraggio longitudinale in vivo, questi modelli forniscono solo un punto dati per animale e sono quindi costosi e inefficienti.
Un precedente lavoro che studiava un modello murino di infezione da artroplastica del ginocchio ha stabilito il valore e l'accuratezza dell'imaging ottico in vivo non invasivo per monitorare longitudinalmente il carico di infezione16. Il rilevamento della bioluminescenza consente di quantificare la carica batterica su un decorso temporale longitudinale in un singolo animale in modo umano, accurato ed efficiente. Inoltre, studi precedenti hanno dimostrato un'elevata correlazione tra la bioluminescenza in vivo e le CFU aderenti agli impianti17. La capacità di tracciare l'infezione nel tempo ha portato a una comprensione più sfumata dell'infezione correlata all'impianto. Inoltre, il monitoraggio longitudinale dell'infezione in questo modo ha permesso di valutare con precisione l'efficacia della terapia antibiotica e dei nuovi antimicrobici16,17,18.
Sfruttando questi strumenti, abbiamo sviluppato e validato un modello di infezione postoperatoria dell'impianto spinale. Nel metodo presentato, utilizziamo un inoculo di S. aureus Xen36 bioluminescente per stabilire un modello murino in vivo di SII per monitorare longitudinalmente la carica batterica16,17,18. Questo nuovo modello fornisce uno strumento prezioso per testare in modo efficiente le potenziali strategie di rilevamento, prevenzione e trattamento per la SII prima della loro applicazione in modelli animali più grandi e studi clinici.

<table><tbody><tr><td>Bilancia analitica ME104</td><td>Mettler Toledo</td><td>30029067</td><td>portata 120 g, risoluzione 0,1 mg, LCD retroilluminato, regolazione interna, base metallica</td></tr><tr><td>BD Bacto Tryptic Soy Broth</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD 211825</td><td>BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)</td></tr><tr><td>Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-208300</td><td>Spettrofotometro; Termo Scientifico; BioMate 3S; Porta cella a sei posizioni; Larghezza di banda spettrale: 1,8 nm; Lampada allo xeno a lunga durata; Memorizza fino a 40 metodi di test; 16 L x 13 L x 9 pollici H; 19 libbre; Cavo di linea 100/240V US</td></tr><tr><td>Bioshield 720+ rotore a secchio oscillante</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003183</td><td>rotore, secchio oscillante; Termo Scientifico; BIOShield 720 ad alta velocità; Capacità: 4 x 180 ml (0,72 l); Angolo: 90 gradi; Velocità massima/RCF: 6300 giri/min/7188 x g; Raggio massimo: 16,2 cm</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicatore)</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>CPX952217R</td><td>*modello simile, il nostro modello è fuori produzione* Bagno di pulizia a ultrasuoni riscaldato Branson Ultrasonics serie MH, 120 V, 0,75 gal</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M</td><td>Il Bullet Blender Storm è il membro più potente della famiglia Bullet Blender. Omogeneizza fino a 24 dei tuoi campioni più difficili (femore di topo, pelle, cartilagine, tumore, ecc.) in pochi minuti. Raffreddamento ad aria e commercio; Riduce al minimo il calore del campione. Utilizza un tappo a vite da 1,5 ml RINO® provette o tappo a scatto Eppendorf&reg; Sicuro-lock&trade; Tubi.</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>66118-10</td><td>Il Germinator 500 è progettato per decontaminare solo strumenti di micro-dissezione metallica. Deve essere utilizzato esclusivamente per scopi di ricerca. Il Germinator 500 non deve essere utilizzato come sostituto dei metodi tradizionali di sterilizzazione terminale. Una sterilizzazione efficace non può essere garantita a causa della mancanza di metodi di monitoraggio dell'efficacia della sterilizzazione di routine per la sterilizzazione con perle di vetro. Il Germinator 500 è stato progettato e costruito per superare il test di convalida della sospensione di spore dello sterilizzatore a secco: USP XXIII, Parte 1211.</td></tr><tr><td>Incubatore a CO2 Heracell 150i</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026282</td><td>singolo 150L</td></tr><tr><td>IVIS Lumina X5 Sistema di imaging</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS148590</td><td>Il sistema di imaging ottico 2D ad alta produttività IVIS Lumina X5 combina la bioluminescenza e la fluorescenza ad alta sensibilità con i raggi X ad alta risoluzione in un sistema compatto che si adatta al banco. Con un campo visivo esteso di 5 mouse per l'imaging ottico 2D e la nostra esclusiva linea di accessori per accelerare la configurazione e l'etichettatura, non è mai stato così facile o veloce ottenere dati robusti. e risposte&mdash; sugli aspetti anatomici e molecolari della malattia.</td></tr><tr><td>MAXQ 4450 Agitatore da banco per incubazione Digtial</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE4450</td><td>agitatore, incubato; Termo Scientifico; Digitale; MaxQ 4450; Velocità da 15 a 500 giri/min +/-1 giri/min; 5 gradi C sopra la temperatura ambiente a 80 gradi C; 120V 50/60Hz</td></tr><tr><td>PBS, soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP24384</td><td>PBS, soluzione salina tamponata con fosfato, soluzione 1X, centrifuga pH 7,4</td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21, 75002436 termoscientifica ventilata</td><td></td><td></td><td>24 rotori da 1,5/2,0 ml con coperchio di biocontenimento ClickSeal</td></tr><tr><td>SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004261</td><td>centrifuga, da banco; Termo Scientifico; Sorvall Legend X1R (Refrigerato), capacità 1L; Velocità massima/RCF 15.200 giri/min/25.830 x g; Raffreddamento senza CFC da -10C a +40C; 120V 60Hz</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus - Xen36</td><td>Perkin Elmer</td><td>119243</td><td>Staphylococcus aureus - Xen36 batteri patogeni bioluminescenti per la scoperta di farmaci in vivo e in vitro. Questo prodotto è stato derivato da un ceppo parentale dell'American Type Culture Collection, utilizzato su licenza. Stafilococco. aureus-Xen36 possiede una copia stabile dell'operone Lux Photorhabdus luminescens sul plasmide nativo.</td></tr><tr><td>TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V</td><td>Heidolph Tuttnauer 23210401</td><td></td><td>Sterilizzatore, da banco; Heidolph; Tuttnauer; Modello 2540E; Il design autonomo con serbatoio ricaricabile controlla la purezza dell'acqua per la sterilizzazione; 120V 50/60Hz; 1400w. Con controlli elettronici</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP338-500</td><td>Tween 80, Fisher BioReagents, Detergente non ionico per l'estrazione selettiva</td></tr><tr><td>delle proteine Miscelatore a vortice VX-200</td><td>Labnet Internation</td><td>S0200</td><td>120V touch o miscelatore continuo, 230V: 0 - 2.850 giri/min, 120V: 0 - 3.400 giri/min</td></tr><tr><td>0,9% Cloruro di sodio</td><td>Pfizer Injectables/Hospira</td><td>00409-4888-10</td><td>0,9% Iniezione di cloruro di sodio, USP</td></tr></tbody></table>

modello murino in vivo di infezione da impianto spinale

In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection

Le infezioni da impianti spinali fanno presagire scarsi risultati poiché la diagnosi è difficile e l'eradicazione chirurgica è in contrasto con la stabilità meccanica della colonna vertebrale. Lo scopo di questo metodo è quello di descrivere un nuovo modello murino di infezione da impianto spinale (SII) che è stato creato per fornire uno strumento in vivo economico, rapido e accurato per testare potenziali terapie e strategie di trattamento per le infezioni da impianti spinali.
In questo metodo, presentiamo un modello di chirurgia spinale con approccio posteriore in cui un filo k in acciaio inossidabile viene trafitto nel processo spinoso L4 di topi wild-type C57BL/6J di 12 settimane e inoculato con 1 x 103 CFU di un ceppo bioluminescente di batteri Staphylococcus aureus Xen36. I topi vengono quindi sottoposti a imaging longitudinale per la bioluminescenza in vivo nei giorni post-operatori 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 e 35. I segnali di imaging a bioluminescenza (BLI) provenienti da un campo visivo standardizzato vengono quantificati per misurare la carica batterica in vivo.
Per quantificare i batteri che aderiscono agli impianti e al tessuto perimplantare, i topi vengono sottoposti a eutanasia e vengono raccolti l'impianto e i tessuti molli circostanti. I batteri vengono staccati dall'impianto mediante sonicazione, coltivati durante la notte e quindi vengono contate le unità formanti colonie (CFU). I risultati acquisiti da questo metodo includono la conta batterica longitudinale misurata dalla bioluminescenza in vivo di S. aureus (flusso massimo medio) e la conta delle CFU dopo eutanasia.
Mentre i precedenti modelli animali di infezione della colonna vertebrale strumentata hanno comportato un'analisi invasiva dei tessuti ex vivo, il modello murino di SII presentato in questo documento sfrutta l'imaging ottico in vivo non invasivo e in tempo reale di batteri bioluminescenti per sostituire lo studio statico dei tessuti. Le applicazioni del modello sono ampie e possono includere l'utilizzo di ceppi batterici bioluminescenti alternativi, l'incorporazione di altri tipi di topi geneticamente modificati per studiare contemporaneamente la risposta immunitaria dell'ospite e la valutazione di nuove modalità diagnostiche e terapeutiche come antibiotici o rivestimenti implantari.

La procedura qui presentata è stata utilizzata per valutare l'efficacia dei regimi antibiotici in un modello murino in vivo di SII. In particolare, l'efficacia della terapia antibiotica combinata con vancomicina e rifampicina è stata confrontata con la monoterapia con vancomicina e con i controlli infetti non trattati.
Prima dell'intervento chirurgico, i topi sono stati randomizzati alla terapia di combinazione, alla monoterapia o al controllo infetto. È stata eseguita un'analisi statistica de...

Il protocollo descrive un nuovo modello murino in vivo di infezione da impianto spinale in cui un impianto k-wire in acciaio inossidabile è infettato da Staphylococcus aureus Xen36 bioluminescente. La carica batterica viene monitorata longitudinalmente con imaging bioluminescente e confermata con la conta delle unità formanti colonie dopo l'eutanasia.

Modello murino in vivo di infezione da impianto spinale

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The ...

L'infezione postoperatoria è una complicanza devastante della chirurgia spinale. Questo modello murino di infezione da impianto spinale consente ai ricercatori di studiare l'effetto dell'ospite, dell'impianto e dei fattori terapeutici sull'infezione. Questa tecnica quantifica la carica batterica longitudinale in tempo reale, in modo umano ed efficiente, in vivo.Utilizzando un brodo congelato di S.aureus zen 36, striare i batteri su piastre da brodo Luria contenenti 200 microgrammi per millilitro di kanamicina e incubare per 12-16 ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, coltivare individualmente singole colonie della coltura S.aureus zen 36 in brodo di soia triptico contenente 200 microgrammi per millilitro di kanamicina per 12-16 ore a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto. Il giorno successivo, diluire la coltura in brodo fresco in un rapporto di uno a 50 e coltivare i batteri per altre due ore per consentire l'isolamento dei batteri in fase medio-logaritmica.Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule batteriche mediante centrifugazione e lavare le cellule tre volte in un millilitro di PBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, misurare l'assorbanza a 60

in-vivo-mouse-model-of-spinal-implant-infection

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Un protocollo minimamente invasiva per stabilizzare la colonna vertebrale del mouse ed eseguire...

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In questo video, sviluppiamo un modello murino in vivo per l'invasione perineurale iniettando cellule tumorali del pancreas nel nervo sciatico. Questo modello aiuta a quantificare l'entità dell'invasione e a studiare le interazioni tra le cellule tumorali e i nervi.

Modello di invasione perineurale murina: generazione di un modello in vivo per simulare l'invasione perineurale nel nervo sciatico di topo

Questo video mostra una tecnica per generare un modello murino di infezione della ferita cutanea. Dopo aver infettato i topi, ingegnerizzati per esprimere una proteina fluorescente nei neutrofili, con uno Staphylococcus aureus bioluminescente geneticamente modificato, un batterio patogeno. La carica batterica nel sito di infezione e le dinamiche di reclutamento dei neutrofili possono essere studiate utilizzando l'imaging dell'intero animale.

Un modello di infezione da ferita cutanea murina per studiare la risposta immunitaria contro un patogeno batterico

Fonte: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomia e impianto della finestra del midollo spinale nel topo. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra l'impianto di una finestra del midollo spinale in un topo anestetizzato per l'imaging in vivo. Il protocollo stabilizza il midollo spinale esposto utilizzando un vetro di copertura in borosilicato e una piastra posteriore stampata in 3D. Questo metodo consente la microscopia a due fotoni ad alta risoluzione per studiare la dinamica della barriera...

Impianto della finestra del midollo spinale in un topo per l'imaging in vivo

Combinato imaging ottico e μCT in un modello murino di infezione impianto ortopedico, utilizzando un ceppo ingegnerizzato bioluminescente di Staphylococcus aureus, purché la capacità di monitorare in maniera non invasiva e longitudinalmente la dinamica della infezione batterica, così come la risposta infiammatoria corrispondente e cambiamenti anatomici nel osso.

Combinato<em&gt; In vivo</em&gt; Optical e μCT Imaging Monitor per infezione, infiammazione, e Bone Anatomy in una infezione ortopedica impianto in topi

Descriviamo un modello murino in vivo di invasione perineurale iniettando le cellule tumorali pancreatiche syngeneic nel nervo sciatico. Il modello consente per la quantificazione del grado di invasione del nervo e appoggia la indagine dei meccanismi cellulari e molecolari dell'invasione perineurale.

Un modello In Vivo murino nervo sciatico di invasione perineurale

Abbiamo sviluppato un modello di topo di degenerazione del disco intervertebrale lombare per resezione dei processispinosiL 3 –L5 insieme a legamenti sovra- e inter-spinosi e distacco di muscoli paraspinosi.

Un modello di topo di instabilità della colonna lombare

L'infezione dell'articolazione periprotesica (PJI) causata da agenti patogeni pericolosi è comune in ortopedia clinica. I modelli animali esistenti non sono in grado di simulare accuratamente la situazione reale della PJI. Qui, abbiamo stabilito un modello murino di PJI associato al biofilm di Candida albicans per la ricerca e lo sviluppo di nuove terapie per la PJI.

Un modello di infezione da Candida albicans articolare periprotesica nel topo

Il presente protocollo descrive lo sviluppo di un modello murino riproducibile di glioma del midollo spinale mediante l'iniezione di cellule tumorali nello spazio intervertebrale, offrendo un approccio più efficace e meno invasivo per la ricerca e lo sviluppo terapeutico.

Trapianto chirurgico di cellule tumorali nel midollo spinale di topi

Il presente protocollo descrive un modello murino che impiega l'impianto dorsale sottocutaneo per studiare le infezioni associate all'impianto, consentendo un'indagine completa dei meccanismi fisiopatologici e supportando lo sviluppo di criteri diagnostici con strategie terapeutiche mirate.

Modello animale di infezioni associate all'impianto nei topi

Questo protocollo descrive un modello sperimentale unico di infezioni correlate all'impianto che consente l'incubazione simultanea di due impianti con batteri in condizioni identiche all'interno di un singolo topo. Consente inoltre una valutazione precisa della formazione di biofilm sulle superfici implantari utilizzando metodi analitici comparativi ottimizzati, dimostrando tecniche avanzate per valutare le proprietà antimicrobiche dei biomateriali.

Un modello murino unico per la valutazione quantitativa della formazione di biofilm su impianti chirurgici in ascesso sottocutaneo

Scopri un modello murino in vivo per studiare le infezioni da impianto spinale utilizzando Staphylococcus aureus bioluminescente. Questo metodo consente il monitoraggio longitudinale del carico batterico in tempo reale.

Modello murino in vivo di infezione da impianto spinale

Esplora altri video