Valutazione della tossicità dell'inalazione acuta delle particelle aerotrasportate esponendo cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquida

Lo screening delle particelle trasportate dall'aria riguardanti la citotossicità polmonare acuta esponendo le cellule polmonari umane coltivate all'ALI utilizzando questo sistema di esposizione in vitro può contribuire a ridurre gli esperimenti sugli animali. Il principale vantaggio di questo sistema di esposizione è il concetto di distribuzione radiale degli aerosol che porta ad una distribuzione omogenea e alla posizione delle particelle sulle cellule. Prima di seminare le cellule, aggiungere 2,5 millilitri di mezzo di crescita temperato a ogni pozzo di una piastra di sei poggiasaggio.

Posizionare accuratamente gli inserti di coltura cellulare senza celle all'interno dei pozzetti e aggiungere un millilitro di mezzo di crescita a ogni inserto di coltura cellulare. Incubare le piastre per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo la tripsininazione delle cellule, diluire 100 microlitri della sospensione della coltura cellulare in una tazza piena di 10 millilitri di soluzione isotonica.

Inclinare lentamente la tazza senza tremare. Su un contatore di celle, determinare il numero di cellule vitali per millilitro e la vitalità cellulare in base ai parametri di misurazione specifici della cella delle celle A549. Dopo il rinvenimento della piastra, aspirare il mezzo all'interno degli inserti di coltura cellulare e seminare un millilitro di cellule A549 con una densità di tre volte 10 alla quinta cella per millilitri in ogni inserto di coltura cellulare.

Distribuire la sospensione cellulare a dondolo delicato e incubare per 24 ore. Impostare il tempo di pressione tramite il controllo del tempo sul lato anteriore della pressa. Aprire l'alimentazione dell'aria compressa alla valvola ad aria compressa.

Utilizzando il regolatore di pressione sul lato anteriore della pressa, impostare la pressione dell'aria compressa su circa due barre. Estrarre il cassetto, premere il pulsante Press e leggere la pressione di pressione sull'interruttore di pressione digitale. Riempire il contenitore della sostanza con una piccola quantità della sostanza in esame.

Inserire lo stantuffo nel contenitore della sostanza e girarlo leggermente avanti e indietro per distribuire uniformemente la polvere nel contenitore. Posizionare il contenitore della sostanza, con lo stantuffo, nel cassetto e premere il pulsante Premi. Aprire il cassetto e rimuovere lo stantuffo.

Un passo critico è la pressatura di sostanze in esame che devono essere specificamente compresse in una torta di polvere all'interno del contenitore della sostanza al fine di consentire esposizioni stabili al particolato. Rimuovere l'adattatore di ingresso e il riflettore della condensa dal modulo di guida aerosol. Chiudere i tre fori di alimentazione aerosol nel modulo di guida aerosol con spine e le connessioni di alimentazione medie al modulo di campionamento con lembi fittizi.

Collegare le linee del vuoto con il connettore del tubo del modulo di guida aerosol. Utilizzare il volantino per chiudere il modulo e misurare il valore dei controller di flusso. Un paio di minuti dopo la chiusura, i valori diminuiscono sotto i cinque millilitri al minuto.

Avviare il software del generatore di aerosol. Se il raschietto della sostanza non si trova nella posizione più bassa, premere il pulsante Homing Mode. Posizionare il contenitore della sostanza con il materiale di prova pressato capovolto sopra il raschietto della sostanza.

Assicurarsi che il vetro del contenitore della sostanza sia anteriore. Posizionare la piastra di bloccaggio nello slot sopra il contenitore della sostanza e stringere la vite nera. Modificare i valori di Avanzamento e Rotazione in base alle impostazioni desiderate.

Utilizzare le frecce verso il basso per spingere verso il basso lo scivolo con il contenitore della sostanza fino a quando il raschietto della sostanza non è vicino alla sostanza pressata. Aprire l'alimentazione dell'aria compressa al generatore di aerosol con un tocco del controller di flusso di massa e avviare la generazione di aerosol facendo clic sul pulsante Start. Impostare la velocità di avanzamento su 15-20 millimetri all'ora per evitare lunghi tempi di attesa.

Controllare la corretta generazione di particelle osservando la nube di polvere fine con una piccola torcia posizionata dal basso dietro il tubo di vetro dell'elutriatore. Avviare l'alimentazione media con mezzo di esposizione preriscaldato e riempire i moduli di campionamento fino a quando i downpipe sono coperti mentre il modulo è aperto. Inserire inserti di coltura a celle cieche nel modulo di esposizione, pompare il mezzo di esposizione verso il basso fino a quando i downpipe sono coperti con mezzi e il lato inferiore degli inserti è a contatto con il mezzo.

Avviare il generatore di aerosol, chiudere il modulo di esposizione e collegare il modulo di esposizione all'uscita del modulo di esposizione del generatore di aerosol. 30 minuti dopo il lead time, sigillare l'uscita del modulo di esposizione dell'elutriatore con un tappo di gomma e rimuovere gli inserti ciechi. Riempire il mezzo di esposizione fino a quando i downpipes sono ricoperti di mezzo.

Rimuovere gli inserti di coltura cellulare dalle sei piastre del pozzo con l'aiuto di pinzette. Versare attentamente il mezzo di crescita dagli inserti di coltura cellulare rovesciando gli inserti e utilizzare una pipetta per aspirare e scartare il liquido residuo. Posizionare gli inserti nelle camere di esposizione sia dei moduli di esposizione che di aria pulita.

Chiudere i moduli e avviare gli esperimenti di esposizione collegando contemporaneamente il modulo di esposizione all'uscita del modulo di esposizione del generatore di aerosol e del modulo aria pulita all'alimentazione del gas vettore. Dopo aver completato l'esperimento, scollegare l'esposizione e i moduli di aria pulita e sigillare l'uscita del modulo di esposizione. Interrompere l'alimentazione dell'aria compressa e il generatore di aerosol facendo clic sul pulsante Interrompi.

Aprire il modulo esposizione e aria pulita e utilizzare una pinzetta per trasferire gli inserti di coltura cellulare nelle sei piastre di pozzo preparate dopo l'incubazione. Incubare le sei piastre del pozzo, così come gli inserti di coltura cellulare non esposta, per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica all'interfaccia del liquido dell'aria. 24 ore dopo l'esposizione, inserire gli inserti di coltura cellulare nelle nuove sei piastre di pozzo preparate.

Aggiungere un millilitro della soluzione WST1 preparata fresca ad ogni inserto di coltura cellulare. Dondolare accuratamente le piastre per distribuire la soluzione in modo omogeneo sulle cellule. Incubare le sei piastre del pozzo con gli inserti di coltura cellulare per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Successivamente, trasferire 100 microlitri del supernatante in triplicati da ogni piastra di sei pozza di pozzo a una piastra da 96 porri. Utilizzando un lettore di micropiastrine, misurare l'assorbanza a 450 nanometri con una lunghezza d'onda di riferimento di 650 nanometri. Cultex RFS è un sistema modulare di esposizione modulare in vitro appositamente progettato che consente l'esposizione diretta e omogenea delle cellule alle particelle trasportate dall'aria nell'interfaccia del liquido dell'aria.

L'esposizione delle cellule all'aria pulita non porta a alcuna diminuzione della vitalità cellulare nel tempo. Il sistema di esposizione è stato convalidato e stabilito con successo come modello di previsione per i rischi di inalazione acuta dei composti testati. Esposizione di cellule A549 a diverse sostanze di prova che non presentavano tossicità, media o forte.

Assicurarsi di mantenere rigorosamente i tempi di incubazione, i tempi di consegna della generazione di particolato e i tempi di deposizione del particolato. Questo metodo di esposizione è progettato principalmente per l'esposizione al particolato delle cellule, ma può essere esteso all'esposizione di aerosol liquidi e gas adattando il metodo di generazione dell'aerosol. Questo metodo di screening consente la valutazione qualitativa delle particelle inalabili per quanto riguarda la tossicità acuta per inalazione in vitro, riducendo così la sperimentazione animale che normalmente fornirebbe questa valutazione tossicologica.

Non dimenticare che lavorare con sostanze di prova tossiche può essere estremamente pericoloso e precauzioni, come indossare guanti, una maschera, dovrebbero sempre essere prese quando si maneggiano tali composti.