Name: Infezione in vivo con Leishmania amazonensis per valutare la virulenza dei parassiti nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Scopri come valutare la virulenza di Leishmania amazonensis nei topi mediante iniezioni subplantari. Questo metodo permette di analizzare contemporaneamente la risposta infiammatoria dell'ospite e la replicazione del parassita per studiare la leishmaniosi cutanea.

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Ringraziamo la prof.ssa Niels Olsen Saraiva Camara dell'Animal Center dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo per il supporto e la prof.ssa Silvia Reni Uliana per aver fornito il macinino di tessuto di vetro. Questo lavoro è stato sostenuto da Sao Paulo Research Foundation (FAPESP - sovvenzione 2017/23933-3).

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Animal Care and Use Committee presso l'Istituto di Bioscienze dell'Università di San Paolo (CEUA 342/2019) e sono state condotte in conformità con le raccomandazioni e le politiche per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dello Stato di San Paolo (Lei Estadual 11.977, 25/08/2005) e il governo brasiliano (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Tutti i passaggi descritti nelle sezioni da 1 a 5 devono essere eseguiti apartire aquanto in armadi a flusso laminare. Le attrezzature di protezione personale dovrebbero essere utilizzate durante la manipolazione di parassiti della Leishmania vivi.
1. Differenziazione in Vitro di L. amazonensis Promastigotes in Amastigotes axenic15,20,35,36,37,38
NOTA: in questo saggio è stato utilizzato l'uso del parassita L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La). A seconda dello scopo dello studio, la forma di parassita infettiva può essere ottenuta sia attraverso la purificazione della forma metaclica utilizzando un gradiente di densità, come descritto in precedenza14, o differenziando i promastigoti in amastigoti assici, secondo il seguente protocollo.
<ol><li>Coltivare I promastigoti in un flacone di coltura cellulare 25 cm2 contenente 10 mL di mezzo per promastigotes (pro-medio) (pH - 7,0). </li>
	<li>Incubare a 25 gradi centigradi per 3 giorni. NOTA: Utilizzare colture promastigote che sono state passaggiate in vitro meno di 10x per evitare la perdita di virulenza e cambiamenti di aneuploidia dei parassiti39,40,41,42,43,44.</li>
	<li>Pipette 5 mL di fase di crescita logaritmica della coltura promastigote in un nuovo flacone di 25 cme 2.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di mezzo per amastigotes axeni (ama-medio) (pH - 5,2).</li>
	<li>Incubare a 34 gradi centigradi per 3-4 giorni.</li>
	<li>Dividere la coltura diluindo con ama-medium ad un rapporto di 1:3 in un nuovo pallone da 25 cm2.</li>
	<li>Incubare a 34 gradi centigradi per 3-5 giorni. NOTA: Incubare gli amastigoti axenic fino a 5 giorni, in quanto rappresenta la fine della maturazione37.</li>
</ol>2. C57BL/6 Footpad Infezione con L. amazonensis
NOTA: I topi C57BL/6 femminili (6-8 settimane) sono stati ottenuti e mantenuti presso l'Animal Center dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo. Gli animali hanno ricevuto cibo e acqua al libitum.
<ol><li>Contare la cultura degli amastigoti axenic trasferendo una sospensione parassita diluita in PBS a una camera di Neubauer (cioè emocitometro). Contare i parassiti non flagellati, che rappresentano forme di amastigotes. NOTA: In alternativa, Trypan blu (1:1) può essere utilizzato per il conteggio del numero di amastigotes vitali (cioè quelli non macchiati di blu Trypan).</li>
	<li>Diluire gli amastigoti axenic in PBS in base alla dose di inoculum desiderata e si raccomanda il numero di inoculum (1 x 106 amastigotes axenici in 50 - L di PBS).</li>
	<li>Caricare una siringa di tubercolina con un ago da 27 G con la sospensione parassita preparata.</li>
	<li>Anestesizzare un topo C57BL/6 utilizzando 3-5% isoflurane, come raccomandato da Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee45. Valutare la profondità anestetica testando la risposta del mouse a un pizzico di punta.</li>
	<li>Inoculare 50 L della sospensione del parassita omogeneizzato (1 x 106 amastigotes axenic o la dose di inoculum desiderata) nel tessuto subplanare del piede posteriore sinistro, utilizzando la siringa di tubercolina precedentemente caricata (passaggio 2.3).</li>
</ol>3. Sviluppo della lesione del piede del mouse
<ol><li>Misurare la progressione della lesione una volta alla settimana misurando lo spessore delle pedane sinistra (infetto) e destra (non infettate) utilizzando una pinza.</li>
	<li>Calcolare la differenza di spessore tra i piedi posteriori sinistro e destro settimanale per valutare la progressione della lesione.</li>
	<li>Tracciare le differenze calcolate sull'asse Y e il tempo dell'infezione sull'asse X e calcolare la significatività statistica. NOTA: Secondo le raccomandazioni dei Comitati per la cura degli animali e l'uso, gli animali devono essere sacrificati prima che la lesione infetta diventi ulcerata, perché le ulcere cutanee possono portare a infezioni secondarie. Come mostrato nella Figura supplementare 1, ci vogliono circa 10 settimane perché le lesioni presentino segni di ulcerazione con la dose parassitaria (106 amastigoti assici) e ceppo ospite (C57BL/6) utilizzato in questo protocollo. I topi devono essere sacrificati per l'estrazione della lesione prima che si osservino i segni di ulcerazione.</li>
</ol>4. Topi Footpad Lesion Extraction and Parasite Limiting Diluizione
<ol><li>Preparare una piastra di 96 pozze (fondo piatto) per il diluizione limitante46,47 aggiungendo 180 -L di pro-medio a tutti i pozzetti. NOTA: Utilizzare quattro corsie di piastra (metà della piastra) per ogni animale, che rappresentano i saggi quadruplicati (cioè, animale 1 - corsie A-D; animale 2 - corsie E-H).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di pro-medio in un tubo di smerigliatrice di tessuto di vetro per lesione e pesare il tubo. NOTA: Il tubo deve essere mantenuto sterile, in modo da utilizzare un coperchio sterile e pesare il tubo con il coperchio chiuso, se pesa all'esterno dell'armadio a flusso laminare.</li>
	<li>Sacrificare l'animale in una camera di CO2, seguendo le raccomandazioni dei Comitati per la cura e l'uso degli animali. Disinfettare l'animale spruzzando con il 70% di etanolo.</li>
	<li>Accisa il piede dell'animale alle talloni per estrarre il piede infetto e spruzzare 70% di etanolo sul piede per la disinfezione. Garantire la sterilizzazione delle forbici e delle pinze mantenendole imbevute del 70% di etanolo.</li>
	<li>Posizionare il pedonale infetto in una parabola Petri sterile e dissezionare usando pinze sterili e un bisturi per raccogliere tutti i tessuti molli. Scartare le ossa. NOTA: L'uniformità nella fase di dissezione è consigliata per evitare il recupero dei tessuti di parte.</li>
	<li>Trasferire i tessuti raccolti al tubo di smerigliatrice del tessuto di vetro con pro-medio, quindi pesare nuovamente il tubo per determinare il peso della lesione. NOTA: Evitare di posizionare le pinze e il bisturi direttamente nel mezzo, in quanto piccoli volumi possono essere rimossi, con conseguente sottovalutazione del peso del tessuto. Il peso della lesione viene calcolato sottraendo il peso del tubo contenente pro-medio con il tessuto raccolto dal peso del tubo contenente solo pro-medio.</li>
	<li>Omogeneizzare il tessuto 10x utilizzando la smerigliatrice per la rottura completa dei tessuti.</li>
	<li>Lasciare sedimentare la miscela per 10 min, quindi raccogliere 20 .</li>
	<li>Caricare 20 -L del supernatante nella colonna 1st della corsia 1st della 96 piastra ben preparato al passo 4.1. Ripetere questa operazione per le tre corsie successive per avere quadruplicati per ogni animale (ad esempio, per l'animale 1 aggiungere 20 L a ciascun pozzo e etichettare A1, B1, C1 e D1).</li>
	<li>Omogeneizzare ogni pozzo nella colonna 1st 10x utilizzando una pipetta multicanale. Quindi, trasferire 20 l dei campioni diluiti dalla colonna 1st alla colonna 2nd. NOTA: È importante omogeneizzare ogni pozzo 10x da una colonna all'altra.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.10 in tutte lecolonne rimanenti fino all'ultima colonna (12th ) ed eliminare gli ultimi 20 l del campione diluito. NOTA: Modificare le punte dopo ogni diluizione per evitare contaminazioni incrociate.</li>
	<li>Sigillare le piastre con un film e incubare a 25 gradi centigradi per 7 giorni in una camera umida.</li>
</ol>5. Determinazione del carico del parassita della lesione
<ol><li>Analizzare le piastre dopo 7 giorni di incubazione utilizzando un microscopio invertito per determinare l'ultimo pozzo contenente parassiti per ogni corsia. NOTA: È anche possibile avere un'indicazione della crescita dei parassiti, o densità cellulare, attraverso l'analisi visiva dei cambiamenti di colore e della torbidità del mezzo.</li>
	<li>Calcolare il carico del tessuto reitino per ogni corsia dividendo il fattore di diluizione per peso della lesione. NOTA: In una corsia specifica, se i parassiti sono presenti solo nelle colonne 1-5 (cioè, i pozzi A1-A5 sono positivi per la crescita dei parassiti), ciò significa che la colonna 5 conteneva solo 1 parassita, la colonna 4 conteneva 10 parassiti e così via, in multipli di dieci. La colonna 1 contiene 104 parassiti, che rappresenta il numero di parassiti nei 20 - L iniziali di supernatante (il campione non diluito nel passaggio 4.7). Poiché questo 20 l è stato diluito con 180 gradi L di pro-medio, il tubo iniziale conteneva 5 x 105 parassiti: (1 x 104) / (0,02 mL) - 5 x 105 parassiti/1 mL. Quindi, il carico del parassita in tale lesione può essere calcolato dividendo la concentrazione iniziale del parassita per il peso della lesione: (5 x 105) / peso della lesione (vedi passo 4.6).</li>
	<li>Tracciare la media del risultato quadruplicato per ogni animale con una scala Y del tronco.</li>
</ol>6. Analisi statistiche
<ol><li>Rappresentano i dati come media: deviazione standard utilizzando almeno cinque animali per gruppo sperimentale come repliche.</li>
	<li>Eseguire l'analisi statistica utilizzando un test a due code non accoppiato, considerando significativo un valore p < 0,05.</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L'analisi dell'infezione in vivo descritta in questo protocollo consente a qualsiasi ricercatore di valutare la leishmaniosi cutanea in vivo considerando l'interazione ospite-parassita in uno scenario sistemico. Questi saggi sono stati utilizzati da molti gruppi22,24,27,29,31,32,34,</su...

Le leishmaniosi sono malattie infettive parassitarie prevalenti in tutto il mondo che rappresentano importanti sfide nei paesi in via di sviluppo e sono riconosciute come una delle più importanti malattie tropicali trascurate dall'Organizzazione Mondiale della Sanità1,2. Le leishmaniasi sono caratterizzate da manifestazioni cutanee, mucose e/o viscerali. Cutaneous leishmaniosi è di solito causata da L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica e L. aethiopica3. Questa forma della malattia è spesso auto-guarigione negli esseri umani a causa dell'induzione della risposta immunitaria cellulare protettiva. Tuttavia, la risposta immunitaria cellulare può fallire e la malattia può progredire nella diffusione della leishmaniosi cutanea diffusa4,5. Non esiste un vaccino disponibile a causa della diversità tra le specie di Leishmania e ospitare le provenienze genetiche6,7. Le opzioni di trattamento sono anche limitate in quanto la maggior parte dei farmaci attualmente disponibili sono costosi, tossici e/o possono richiedere un trattamento a lungo termine8,9. Inoltre, ci sono state segnalazioni di resistenza ai farmaci contro i trattamenti disponibili10,11.
L'agente causale delle leishmaniosi è il parassita protozoo Leishmania. Il parassita presenta due forme morfologiche distinte nel suo ciclo di vita: i promastigoti, la forma flagellata trovata nelle libellule; e amastigoti, la forma intracellulare trovata nei vacuoli parassitoforo dei macrofagi ospiti dei mammiferi12,13. La capacità degli amastigoti di invadere, sopravvivere e replicarsi nonostante i meccanismi di difesa dei macrofagi dell'ospite vertebrato sono soggette a molti studi14,15,16,17. Di conseguenza, diversi gruppi di ricerca hanno descritto i saggi di infezione da macrofagio in vitro per valutare l'impatto di specifici fattori ambientali, nonché i geni parassiti e ospiti sull'infettività dei parassiti. Questo test presenta diversi vantaggi, come la capacità di adattare gli studi a un formato ad alta produttività, un periodo di tempo relativamente più breve per ottenere risultati e un numero ridotto di animali da laboratorio sacrificati18. Tuttavia, i risultati dei test in vitro sono limitati perché non sempre replicano studi in vivo14,19,20,21. I saggi in vivo forniscono una panoramica fisiologica sistemica dell'interazione ospite-parassita, che non può essere completamente imitata da analisi in vitro. Ad esempio, gli studi immunologici possono essere eseguiti attraverso saggi immunohistochimici da sezioni di tessuto del piede raccolte o anche da linfonodi poplylitali per l'analisi delle cellule immunitarie recuperate22.
Gli animali sono spesso utilizzati come modello per le malattie umane nella ricerca biologica e biomedica per comprendere meglio i meccanismi fisiologici sottostanti delle malattie23. Nel caso della leishmaniosi, il percorso, il sito o la dose di inoculazione influenzano l'esito della malattia24,25,26,27. Inoltre, la suscettibilità e la resistenza all'infezione nell'uomo e nei topi sono altamente regolate dagli sfondi genetici dell'ospite e del parassita4,5,22,28,29,30,31. I topi BALB/c sono altamente sensibili all'infezione cutanea di L. amazonensis, mostrando una rapida progressione della malattia con la diffusione dei parassiti ai linfonodi, alla milza e al fegato32. Poiché la malattia può progredire verso metastasi cutanee, l'infezione può essere fatale. Al contrario, i topi C57BL/6 spesso sviluppano lesioni croniche con carichi di parassiti persistenti nei saggi dell'infezione da L. amazonensis 33. Di conseguenza, l'infezione da L. amazonensis con questa particolare specie di topi è stata considerata un ottimo modello per studiare le forme croniche di leishmaniosi cutanea negli esseri umani, perché imita la progressione della malattia meglio del modellodiinfezione dei topi BALB/c 5,34.
Quindi, proponiamo che l'infezione murina in vivo sia un metodo utile per gli studi fisiologici della virulenza Leishmania applicabili alla malattia umana, consentendo una visione sistemica dell'interazione ospite-parassita. Rivisitando i saggi consolidati22, presentiamo qui un protocollo graduale compilato dell'infezione in vivo di topi C57BL/6 con L. amazonensis che comprende la differenziazione del parassita in amastigoti assici, topi pedana cutanea inoculazione, sviluppo delle lesioni, determinazione del carico di parassiti. Questo protocollo può essere adattato ad altri ceppi di topi e specie di Leishmania che causano leishmanie cutanee. In conclusione, il metodo qui presentato è fondamentale per identificare nuovi bersagli e vaccinianti-Leishmania, nonché negli studi fisiologici delle risposte immunitarie e metaboliche dell'ospite all'infezione da Leishmania.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Greiner bio-ne</td><td>655180</td><td>Una piastra a fondo piatto per limitare il saggio di diluizione</td></tr><tr><td>adenina</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td>Supplemento aggiunto al calibro M199 per terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td></td><td>Mitutoyo</td><td>700-118-20</td><td>Un calibro per misurare lo spessore del</td></tr><tr><td>pallone per colture cellulari</td><td>Corning</td><td>353014</td><td>Un pallone per colture cellulari da 25 cm2 per coltivare la centrifuga antiparassitaria Leishmania</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Un'apparecchiatura utilizzata per separare i campioni in base alla sua densità</td></tr><tr><td>CO2 incubatore 34 &deg; C</td><td>Thermo Scientific</td><td>3110</td><td>Un incubatore per la differenziazione degli amastigoti</td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Merck</td><td>K50237083820</td><td>Un disinfettante per articoli generici</td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>Integratore aggiunto al terreno di coltura cellulare M199 tubo</td></tr><tr><td>di macinazione per tessuti in vetro</td><td>Thomas</td><td>Scientific 3431 E04</td><td>Un tubo per raccogliere e distruggere il tessuto</td></tr> <tr><td>del cuscinetto del piede infettoglucosio</td><td>Synth</td><td>G1008.01.AH</td><td>Supplemento aggiunto ai terreni di coltura cellulare M199</td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Un software utilizzato per tracciare i dati e calcolare la significatività statistica</td></tr><tr><td>hemin</td><td>Sigma</td><td>H-2250</td><td>Supplemento aggiunto ai terreni di coltura cellulare M199</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Promega</td><td>H5303</td><td>Supplemento aggiunto all'incubatore per terreni di coltura cellulare M199</td></tr><tr><td>25 &deg; C</td><td>Fanem</td><td>347CD</td><td>Un incubatore per la coltivazione di promastigoti</td></tr> al <tr><td>microscopio invertito</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>Un'apparecchiatura utilizzata per analizzare visivamente le colture di promastigote e amastigote</td></tr><tr><td>isoflurano</td><td></td><td></td><td>Un anestetico inalante per topi (3-5%)</td></tr> <tr><td>cabina a flusso laminare</td><td>Veco</td><td>VLFS-09</td><td>Una cabina di biosicurezza utilizzata per l'area di lavoro asettica</td></tr><tr><td>Cella M199 terreni di coltura</td><td>Gibco</td><td>31100-035</td><td>Un terreno di coltura cellulare per la microprovetta per microcentrifuga per la coltivazione di Leishmania</td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td>Una microprovetta utilizzata per la raccolta, l'elaborazione e la conservazione dei campioni</td></tr><tr><td>pipetta multicanale</td><td>Labsystems</td><td>F61978</td><td>Una pipetta multicanale utilizzata per limitare il saggio di diluizione</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>Supplemento aggiunto ai terreni di coltura cellulare M199</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Supplemento aggiunto ai terreni di coltura cellulare M199</td></tr><tr><td>Camera Neubauer</td><td>HBG</td><td>2266</td><td>Un emocitometro per contare il</td></tr><tr><td>microscopio ottico</td> a sospensione dei parassiti <td>Nikon</td><td>E200</td><td>Un'apparecchiatura ottica utilizzata per contare</td></tr><tr>il<td>parafilm</td><td>dei parassiti Bemis</td><td>349</td><td>Una plastica flessibile e resistente per sigillare il piastra</td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Integratore aggiunto ai terreni di coltura cellulare M199</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Una piastra sterile per sezionare il pipetman tissutale del poggiapiedi</td></tr><tr><td>Kit</td><td>Gilson</td><td>F167360</td><td>Un kit di micropipette contenente quattro pipettatori (P2 P20 P200 P1000)</td></tr> <tr><td>bilancia</td><td>Quimis</td><td>BG2000</td><td>Un'attrezzatura utilizzata per pesare il cuscinetto plantare raccolto bisturi per lesioni</td></tr><tr><td></td><td>Solidor</td><td>10237580026</td><td>Un bisturi per tagliare e raccogliere la pipetta sierologica tissutale del cuscinetto</td></tr><tr><td>plantare 10 mL</td><td>Nest</td><td>327001</td><td>Una pipetta sterile utilizzata per il trasferimento di punte di volumi di millilitri</td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td></td><td>Una punta di pipetta utilizzata per il trasferimento di volumi di microlitri</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>Un colorante utilizzato per contare i parassiti vitali</td></tr><tr><td>tripticasi peptone</td><td>Merck</td><td></td> Integratore aggiunto alla siringa di tubercolina <td>M199 per colture cellulari</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>305945</td><td>Una siringa con ago da 27G per inoculare la sospensione antiparassitaria</td></tr></tbody></table>

infezione in vivo con leishmania amazonensis per valutare la virulenza dei parassiti nei topi

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. sono parassiti protozoi che causano leishmaniosi, malattie che presentano un ampio spettro di manifestazioni cliniche da lesioni cutanee a lesioni viscerali. Attualmente, si stima che 12 milioni di persone siano infettate dalla Leishmania in tutto il mondo e oltre 1 miliardo di persone viva a rischio di infezione. La leishmania amazonensis è endemica in America centrale e meridionale e di solito porta alla forma cutanea della malattia, che può essere visualizzata direttamente in un modello animale. Pertanto, i ceppi di L. amazonensis sono buoni modelli per gli studi di leishmaniosi cutanea perché sono anche facilmente coltivati in vitro. I topi C57BL/6 imitano la progressione della malattia guidata da L. amazonensisosservata nell'uomo e sono considerati uno dei migliori modelli di ceppi di topi per la leishmaniosi cutanea. Nell'ospite dei vertebrati, questi parassiti abitano i macrofagi nonostante i meccanismi di difesa di queste cellule. Diversi studi utilizzano saggi di infezione da macrofagio in vitro per valutare l'infettività del parassita in diverse condizioni. Tuttavia, l'approccio in vitro è limitato a un sistema cellulare isolato che ignora la risposta dell'organismo. Qui, compiliamo un metodo di infezione murina in vivo che fornisce una panoramica fisiologica sistemica dell'interazione ospite-parassita. Il protocollo dettagliato per l'infezione in vivo di topi C57BL/6 con L. amazonensis comprende la differenziazione dei parassiti in amastigoti infettivi, intorpidimento cutaneo dei topi, sviluppo della lesione e determinazione del carico di parassiti. Proponiamo questo metodo consolidato come il metodo più adeguato per gli studi fisiologici delle risposte immunitarie e metaboliche dell'ospite alla leishmaniosi cutanea.

I parassiti della Leishmania protozoi esistono in due forme di sviluppo durante il loro ciclo di vita invertebrati e ospiti di vertebrati: promastigoti, le forme proliferanti che si trovano nel lume della landanella femmina; e amastigoti, le forme proliferanti che si trovano nei vacuoli parassofosi delle cellule ospiti dei mammiferi. I promastigoti hanno un corpo allungato di circa 1,5 m di larghezza e di 20 m di larghezza, con un flagello che emerge tipicamente dall'estremità an...

Qui, presentiamo un protocollo compilato per valutare l'infezione cutanea dei topi con Leishmania amazonensis. Questo è un metodo affidabile per studiare la virulenza dei parassiti, consentendo una visione sistemica della risposta dell'ospite vertebrato all'infezione.

Infezione in vivo con Leishmania amazonensis per valutare la virulenza dei parassiti nei topi

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...

Questo protocollo è adatto per studiare la virulenza di Leishmania, perché fornisce una visione sistemica dell'ospite vertebrato all'infezione cutanea. Il vantaggio principale dell'adozione di questo protocollo è che consente ai ricercatori di valutare contemporaneamente la risposta infiammatoria dell'ospite e la replicazione dei parassiti. Questo metodo può essere utilizzato per caratterizzare diversi bersagli e trattamenti relativi alla virulenza, che potrebbero portare nuove intuizioni nel controllo della leishmaniosi cutanea.Può anche essere applicato ad altri ceppi di topi e specie di Leishmania che causano la leishmaniosi cutanea. Questo test ha alcuni passaggi critici, come richiedere personale addestrato che si confortevole a lavorare con i topi e ha esperienza nell'esecuzione di iniezioni subplantarie per evitare l'esposizione accidentale a materiale infettivo. A dimostrare la procedura sarà il Dottor Ricardo Zampieri, tecnico del mio laboratorio.Inizia coltivando promastigoti L.amazonensis in un matraccio di coltura cellulare quadrata di 25 centimetri, contenente 10 millilitri di pro-medium, per tre giorni a 25 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, pipettare cinque millilitr

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Leishmaniosi cutanea nella pelle dorsale di criceti: ​​un modello utile per lo screening delle droghe Antileishmanial

Questo video indaga la virulenza della Leishmania trattando i macrofagi con promastigoti metaciclici, con conseguente formazione di amastigoti intracellulari. La conferma della virulenza della Leishmania si ottiene attraverso la colorazione con colorante fluorescente con acido nucleico. Questa intuizione può contribuire allo sviluppo di nuove terapie per la leishmaniosi.

Valutazione della virulenza della Leishmania nei macrofagi in coltura

Questo video mostra un test per quantificare la crescita intracellulare dei parassiti nei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM). Le cellule macrofagiche sono infettate dagli stadi invasivi mobili e non mobili della Leishmania, rispettivamente i promastigoti metaciclici e gli amastigoti. I parassiti invadono i macrofagi, interiorizzandosi in un vacuolo parassitoforo e moltiplicandosi all'interno. La crescita intracellulare del parassita viene quantificata utilizzando un microscopio dopo...

Un test in vitro per quantificare la crescita intracellulare del parassita nei macrofagi

Questo articolo riporta un metodo dettagliato per la misurazione dinamica e la quantificazione della velocità del flusso sanguigno all'interno dei singoli vasi sanguigni del sistema vascolare epatico di topo utilizzando l'imaging al microscopio intravitale in combinazione con una metodologia specifica per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.

Intravitale Microscopia Imaging del Fegato seguente<em&gt; Leishmania</em&gt; Infezione: Valutazione della epatiche Emodinamica

Tutte le specie di Leishmania patogene risiedono e replicano all'interno dei macrofagi dei loro ospiti vertebrati. Qui, presentiamo un protocollo per infettare i macrofagi murini derivate da midollo osseo nella cultura con Leishmania, seguita da quantificazione precisa della cinetica di crescita intracellulare. Questo metodo è utile per lo studio di singoli fattori che influenzano l'interazione ospite-patogeno e la virulenza di Leishmania .

Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania

Qui presentiamo una valutazione longitudinale di criceti dorati infettati per via intraperitoneale (IP) o per via intragengivale (IG) con L. infantum-Luc mediante imaging bioluminescente e mediante PCR. I criceti sono stati valutati 1 giorno dopo l'infezione (1 dpi), 1 settimana dopo l'infezione (8 dpi) e 3 settimane dopo l'infezione (22 dpi) e soppressi al 50° dpi e 8 mesi dopo l'infezione.

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