Name: Screening per inibitori di Pirofosofasi rilegati a Thermotoga (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Scopri un metodo di screening per identificare inibitori della pirofosfatasi membranosa di Thermotoga maritima utilizzando la reazione del blu di molibdeno in piastra 96 pozzetti. Questo protocollo economico e stabile facilita la ricerca di composti terapeutici contro malattie parassitarie.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della Jane and Aatos Erkko Foundation e della BBSRC (BB/M021610) ad Adrian Goldman, l'Accademia di Finlandia (n. 308105) a Keni Vidilaseris, (n. 310297) a Henri Xhaard, e (n. 265481) a Jari Yli-Kauhaluoma, e l'Università di Helsinki Fondi di Ricerca a Gustav Boije af Gennàs. Gli autori ringraziano Bernadette Gehl per il suo aiuto tecnico durante il progetto.

1. Preparazione delle proteine
NOTA: l'espressione e la purificazione di TmPPase è stata descritta altrove13.
<ol><li>Preparare 10 mL della soluzione di buffer di riattivazione contenente 20 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonico acid (MES) pH 6.5, 3,5% (v/v) glicerol, 2 mM dithiothreitol (DTT) e 0,05% dodecyl maltoside (DDM).</li>
	<li>Preparare 10 mL della miscela di reazione contenente 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8,0 mM MgCl2, 333 mM KCl e 67 mM NaCl. NOTA: È necessario che il mg2 per masticare il pirofafato, poiché il substrato di mPPase, Kè necessario per aumentare l'attività degli enzimi poiché TmPPase è un mPPase dipendente dal potassio, e Naè necessaria per l'attività enzimatica durante la traslocazione di ioni di sodio da parte di TmPPase.</li>
	<li>Preparare 30 liposomi mg/mL per la riattivazione degli enzimi.<ol>
<li>Aggiungere 10 mL di 20 mM Tris-HCl pH 8.0 con 1 mM DTT a 0,3 g di L-z-phosphatidylcolina da soia a 10 mL di 20 mM Tris-HCl pH 8.0 con 1 mM-DTT.</li>
		<li>Mettere il liposoma sul ghiaccio e sonicare con intervallo di impulso di 1 secondo per 1 minuto, mettere in pausa per 1 minuto e ripetere fino a quando la soluzione diventa giallo trasparente.</li>
		<li>Aliquota i liposomi, congelare in azoto liquido e conservare a -80 gradi centigradi fino a quando non viene utilizzato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Riattivare l'enzima.<ol>
<li>Mescolare 40 l della soluzione liposomi con 22,5 litri di 20% DDM.</li>
		<li>Riscaldare il composto a 55 gradi centigradi per 15 minuti e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere 36,5 l della soluzione tampone di riattivazione, mescolare e aggiungere 1 l di proteine concentrate (13 mg/mL) per ottenere una concentrazione totale di 0,13 mg/mL. NOTA: Le proteine sono solitamente congelate in 10 gradiNI dopo la purificazione e scongelate sul ghiaccio prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prendere 20 l dell'enzima riattivato e aggiungere a 1.480 l della miscela di reazione, quindi mescolare delicatamente. NOTA: L'aggiunta dell'enzima riattivato alla miscela di reazione deve essere eseguita appena prima che venga utilizzata.</li>
</ol>2. Preparazione composta
<ol><li>Sciogliere i composti in zolfo dimetilo (DMSO) per fare soluzioni di magazzino di 25-100 mM in 50-200 l, in base alla disponibilità dei composti. NOTA: tutti i composti utilizzati qui (Figura 2A) sono stati pubblicati in precedenza9. Se la solubilità composto è bassa, la concentrazione di stock può essere regolata di conseguenza.</li>
	<li>Preparare tre diverse concentrazioni di ogni composto in acqua. NOTA: Le concentrazioni finali nella miscela di reazione saranno rispettivamente 1, 5 e 50 micromolar o 1, 5 e 20 micromolar per composti solubili e sobri, solubili.<ol>
<li>Diluislo la soluzione di riserva con acqua a 1 mL in microtubi per dare 2 M, 10 M e 100 M per composti solubili, o in alternativa 2 M, 10 M e 40 M per composti spietatamente solubili.</li>
		<li>Vorticare la soluzione composta istantaneamente dopo la diluizione della soluzione di riserva per una corretta miscelazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verificare l'aggregazione composta utilizzando un nephelometro. NOTA: Questo è stato studiato come triplicati in tre concentrazioni (1 M, 5 M e 20 M) e normalizzato nello spazio vuoto in un pozzo 96.<ol>
<li>Distribuisci 75 -L della miscela di reazione in ogni pozzo utilizzando una pipetta multicanale.</li>
		<li>Aggiungere 75 l di ogni composto (per lo spazio vuoto, utilizzare invece 75 l'acqua) e mescolare convogliando su e giù per 5o.</li>
		<li>Misurare ogni pozzo a 300 V utilizzando un nephelometro a microplacca.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Reagenti per la preparazione del saggio
<ol><li>Preparare la soluzione arsenite-citrate.<ol>
<li>Pesare 5 g di arsenite di sodio e 5 g di diidrato trisofato. AVVISO: L'arsenite di sodio è tossica, quindi utilizzare attrezzature protettive adeguate e maneggiare con particolare cura. Per precauzione, non maneggiare prima che tutte le precauzioni di sicurezza necessarie siano state lette e comprese. Maneggiare solo in un cofano di fumi per non inalare polvere/vapori del composto o delle sue soluzioni. Se inalato, passare all'aria aperta e ottenere cure mediche. Indossare occhiali di sicurezza chimica, guanti protettivi e indumenti appropriati per evitare l'ingestione e il contatto con gli occhi e la pelle. Se ingerito, chiamare immediatamente un centro antiveleni o un medico/medico. Se arriva sulla pelle o negli occhi, lavare con molta acqua e ottenere cure mediche.</li>
		<li>Sciogliere in 100 mL di acqua.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di acido acetico glaciale, mescolare e aggiungere acqua a 250 mL.</li>
		<li>Conservare a temperatura ambiente protetto dalla luce. NOTA: La soluzione è stabile per più di un anno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione A e la soluzione B.<ol>
<li>Per la soluzione A, aggiungere 10 mL di ghiaccio freddo 0,5 M HCl a 0,3 g di acido ascorbico. Sciogliere l'acido ascorbico vortice.</li>
		<li>Per la soluzione B, aggiungere 1 mL di acqua fredda di ghiaccio a 70 mg di tetraidratte e vortice di ammonio eptamolybdate per sciogliere. NOTA: Conservare entrambe le soluzioni su ghiaccio fino all'uso. Per la consistenza del risultato del saggio, entrambe le soluzioni possono essere conservate sul ghiaccio per un massimo di una settimana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare lo standard fosfato (Pi)con la concentrazione di 0 M, 62,5 M, 250 M e 500 M per la calibrazione.<ol>
<li>Aggiungete 0 , 25 l, 50 l, e 100 ll di 5 mM Na2HPO4 disiscaricano a quattro microtubi contenenti 370 l della miscela di reazione.</li>
		<li>Top fino a 1 mL con acqua.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Anale di attività per una piastra da 96 pozzetto
NOTA: vedere la figura 1 per il flusso di lavoro schematico del saggio.
<ol><li>Aggiungere 1 mL di soluzione B a 10 mL della soluzione A, mescolare vortice e conservare la soluzione sul ghiaccio. NOTA: questa soluzione deve essere trasparente e gialla. Mantenere la soluzione A e B sul ghiaccio per almeno 30 minuti prima dell'uso. Tuttavia, utilizzare la soluzione entro 3 h in quanto andrà male dopo l'archiviazione a lungo termine.</li>
	<li>Aggiungete alle strisce dei tubi in triplice le strisce in triplice copia utilizzando una pipetta multicanale. NOTA: La miscela di reazione senza Pi aggiunto verrà utilizzata come vuoto.</li>
	<li>Aggiungere 25 - L di soluzione composta alle strisce del tubo utilizzando una pipetta multicanale. NOTA: Ogni composto ha tre diverse concentrazioni in triplice copia, il che è sufficiente per la stima iniziale della concentrazione inibitoria massima (IC50). Per una determinazione più accurata di IC50, è possibile utilizzare otto diverse concentrazioni composte. Per l'enzima disinibito la soluzione composta viene sostituita con la stessa quantità di acqua. Come controlli positivi 2,5 M, 25 M, e 250 M di imidodiphosfato (IDP) sale sono stati utilizzati.</li>
	<li>Aggiungere 15 l-L di miscela di soluzione mPPase alle strisce del tubo (ad eccezione dei tubi contenenti Pi standard) utilizzando una pipetta multicanale.</li>
	<li>Sigillare le strisce del tubo con un foglio di sigillazione adesiva. Tagliare il foglio di saltellaggio per separare ogni striscia del tubo.</li>
	<li>Pre-incubare i campioni per 5 min a 71 gradi centigradi. Posizionare i campioni sul blocco di riscaldamento con intervallo di 20 s tra ogni striscia al fine di ridurre al minimo il consumo di tempo durante le fasi successive.</li>
	<li>Per ogni striscia, aprire la guarizione adesiva. Aggiungete 10 l of 2 mM di pirofosfato di sodio utilizzando una pipetta multicanale e mescolate con pipistrato su e giù per 5o. Sigillare nuovamente la striscia del tubo utilizzando la stessa guaritura. NOTA: questo passaggio potrebbe essere inizialmente difficile da eseguire in 20 s; tuttavia, diventerà più facile dopo alcuni saggi.</li>
	<li>Incubare a 71 gradi centigradi per 5 min.</li>
	<li>Posizionare i campioni sull'apparato di raffreddamento con un intervallo di 20 s tra ogni striscia. Lasciarli raffreddare per 10 min ma centrificare ogni striscia brevemente dopo 5 min di raffreddamento, per decantare le gocce d'acqua sotto il foglio di tenuta, quindi rimetterlo all'apparato di raffreddamento e rimuovere la tenuta. NOTA: L'apparato di raffreddamento può essere semplicemente realizzato posizionando una piastra PCR da 96 pozzetti su una piastra Petri in polistirolo (dimensioni 150 mm x 15 mm) riempita con acqua e congelata per almeno 1 ora. L'apparecchio deve essere estratto dal congelatore circa 5 minuti prima dell'inizio del saggio. Non estrarre l'apparato di raffreddamento subito prima del raffreddamento del campione in quanto congela la miscela di reazione e ostacola lo sviluppo del colore.</li>
	<li>Dopo 10 min di raffreddamento, aggiungere 60 -L di soluzione A e B, mescolare convogliando su e giù per 5 o più e mantenere le strisce del tubo sull'apparato di raffreddamento per 10 min.</li>
	<li>Aggiungere 90 l l della soluzione arsenite-citrate e mantenere a temperatura ambiente per almeno 30 min per produrre un colore blu stabile. AVVISO: A causa della sua tossicità tutte le soluzioni contenenti arsenite al sodio devono essere gestite con particolare attenzione in ogni momento. Pertanto, l'aggiunta di soluzione arsenite-citrato dovrebbe essere fatta in una cappa di fumi.</li>
	<li>Distribuisci 180 l di ogni miscela di reazione in una chiara microplacca di polistirolo 96 bene.</li>
	<li>Misurare l'assorbimento di ogni pozzo a 860 nm utilizzando uno spettrofotometro a microplacca.</li>
</ol>5. Analisi dei risultati
<ol><li>Media i triplicati di ogni campione e gli standard Pi. Quindi sottrarre con lo spazio vuoto per eliminare il segnale di sfondo.</li>
	<li>Effettuare una curva di calibrazione tracciando i valori di assorbimento (A860) rispetto alla quantità di standard Pi (nmol) ed eseguire una regressione lineare per ottenere la funzione di linea di tendenza utilizzando la seguente formula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ01a.jpg">
</li>
	<li>Calcolare la quantità di fosfato (nmol) rilasciata dalla reazione ezimatica in base alla formula di regressione lineare di cui sopra.</li>
	<li>Calcolare l'attività specifica utilizzando la formula seguente: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ02a.jpg"> dove nPi è la quantità di fosfato rilasciato dalla reazione (nmol), t è il tempo di reazione (min), e mTmPPase è la quantità del MoPPase puro utilizzato nel saggio (mg).</li>
	<li>Calcolare l'attività percentuale per ogni concentrazione di inibitore utilizzando la seguente formula: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ03a.jpg"> dove SAiis l'attività specifica di un campione con inibitore e SAun è l'attività specifica del campione disinibito.</li>
	<li>Calcolare il logIC50 (stima) e IC50 (stima) con una regressione non lineare adatta dalla curva dose-risposta a quattro parametri utilizzando la seguente formula: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ04a.jpg"> dove X è il registro di concentrazione (M), Y è l'attività (%), Top e Bottom sono altipiani nella stessa unità di Y (rispettivamente Y (100% e 0%)), logIC50 ha le stesse unità di log di X, e HillSlope - fattore di pendenza o pendenza collinare, che è senza unità. NOTA: Per il raccordo viene utilizzato il software (Table of Materials). Utilizzare la concentrazione di 0,01 M (invece di 0,00 M) per il campione senza inibitore poiché il logaritmo di zero non è definito.</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+research+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li>
<li>Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+pyrophosphatases%3A+a+novel+drug+target+for+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens.</a> AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).</li>
<li>Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate-Fueled+Na%2B+and+H%2B+Transport+in+Prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).</li>
<li>Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-PPases%3A+yesterday%2C+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">H+-PPases: yesterday, today and tomorrow.</a> IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuolar-H%2B-pyrophosphatase+%28TgVP1%29+is+required+for+microneme+secretion%2C+host+cell+invasion%2C+and+extracellular+survival+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).</li>
<li>Lemercier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyrophosphatase+regulating+polyphosphate+metabolism+in+acidocalcisomes+is+essential+for+Trypanosoma+brucei+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).</li>
<li>Belogurov, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+pyrophosphatase+of+Thermotoga+maritima+requires+sodium+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity.</a> Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).</li>
<li>Vidilaseris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+in+catalysis+by+Thermotoga+maritima+membrane-bound+pyrophosphatase+demonstrated+by+a+nonphosphorus+allosteric+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor.</a> Science Advances. 5 (5), (2019).</li>
<li>Lin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+membrane-embedded+H%2B-translocating+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase.</a> Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).</li>
<li>Fiske, C. H., Subbarow, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+colorimetric+determination+of+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The colorimetric determination of phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).</li>
<li>Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molybdenum+blue+reaction+for+the+determination+of+orthophosphate+revisited%3A+Opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box.</a> Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).</li>
<li>Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+purification+of+membrane-bound+pyrophosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases.</a> Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).</li>
<li>Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+orthophosphate+determination+of+thermostable+membrane-bound+pyrophosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity.</a> Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).</li>
<li>He, Z. Q., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+in+Soil+Science+and+Plant+Analysis%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).</li>
<li>Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorinated+tyrosine+phosphates+to+probe+the+substrate+specificity+of+the+low+molecular+weight+phosphatase+activity+of+calcineurin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).</li>
<li>Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+strategy+to+determine+the+dependence+of+membrane-bound+pyrophosphatases+on+K%2B+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor.</a> Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui riportiamo un protocollo dettagliato per lo screening semplice degli inibitori per la pirofosasi legata alla membrana da T. maritima in un formato 96 pozzo basato su Vidilaseris et al.14. Questo protocollo è poco costoso e basato su 12-acido fosforolismibdico, che è formato da ortopofosfato e molybdate in condizioni acide e ridotto a specie di fosfomilybdenum con un colore blu distinto12. Questo metodo è preferito rispetto ad altri protocolli, come il più sensi...

Circa il 25% del totale delle proteine cellulari sono proteine di membrana e circa il 60% di esse sono bersagli farmacologici1,2. Uno dei potenziali bersagli farmacologici3, pirofofosasi legati alla membrana (mPPases), sono enzimi dimero che pompano protone e/o ione di sodio attraverso la membrana da idrolisi di piofosfato in due ortoposfati4. mPPases può essere trovato in vari organismi5 come batteri, archea, piante e parassiti protisti, con l'eccezione di esseri umani e animali4. Nei parassiti protisti, per esempio Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii e Trypanosoma brucei, mPPases sono essenziali per la virulenza del parassita6 e knockout di questa espressione nei parassiti portano al fallimento nel mantenimento del pH intracellulare dopo l'esposizione al pH di base esterno7. A causa della loro importanza e della mancanza di proteine omologhe presenti nei vertebrati, mPPases può essere considerato come potenziali bersagli farmacologici per le malattie protische3.
Lo screening in vitro degli inibitori di mPPase in questo lavoro si basa su un sistema modello TmPPase. TmPPase è un mPPasi dipendente dagli ioni di sodio e ioscio da T. maritima e ha la sua attività ottimale a 71 gradi centigradi8. I benefici di questo enzima sono ad esempio la sua facilità di produzione e purificazione, una buona stabilità termica e un'elevata attività specifica. TmPPase mostra sia un'elevata somiglianza oltre alla completa conservazione della posizione, sia l'identità di tutti i residui catalitici al protista mPPases3,9 e la struttura risolta di Vigna radiata10 mPPase. Le strutture disponibili di TmPPase in diverse conformazioni sono utili anche per l'esperimento di progettazione di farmaci basati sulla struttura (come screening virtuale e progettazione de novo).
Qui segnaliamo un protocollo dettagliato per lo screening degli inibitori di TmPPase in un formato 96 ben piatto (Figura 1). Il protocollo si basa sul metodo colorimetrico della reazione blu molybdenum, che è stato sviluppato per la prima volta da Fiske e Subbarow11. Questo metodo comporta la formazione di 12-ciclomolistici da ortopofosfato e molybdate in condizioni acide, che viene poi ridotto per dare caratteristiche specie di fosfomilybdenum di colore blu12.

<table><tbody><tr><td>Foglio sigillante adesivo</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Ammonio eptamolibdato tetraidrato</td><td>Merck</td><td>F1412481 636</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95212-250G</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96Well Multidish</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Merck</td><td>1167431000</td><td></td></tr><tr><td>Strisce per provette PCR a 8 pozzetti, 0,2 ml senza tappi (120)</td><td>Genetica Nippon</td>, <td>FG-028</td><td></td></tr>, <tr><td>Dodecil maltoside (DDM)</td><td>Melford</td><td>B2010-100G</td><td></td>,</tr><tr><td>Etanolo</td>, <td>Merck</td><td>1009901001</td><td></td></tr>, <tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Merck</td>, <td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>258148-500ML</td><td></td></tr>, <tr><td>Imidodifosfato di sodio sale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0631-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-Fosfatidilcolina da lecitina di soia</td><td>Sigma</td><td>429415-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8147330500</td><td></td></tr><tr><td>Multipiastra 96 pozzetti Piastre PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9651</td><td></td></tr><tr><td>MultiSkan Go</td><td>Thermo Scientific</td><td>10680879</td><td></td></tr><tr><td>Nepheloskan Ascent (Tipo 750)</td><td>Labsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri in polistirene (dimensioni 150 mm x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 software</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QBT2 Blocco riscaldante</td><td>Grant Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meta-arsenito di sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td></td><td></td>12897692</tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico (Pi)</td><td>Sigma</td><td>S0876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodio pirofosfato bibasico</td><td>Fluka</td><td>71501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico diidrato</td><td>Fluka</td><td>71404-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

screening per inibitori di pirofosofasi rilegati a thermotoga

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

I piifofosti legati alla membrana (mPPases) sono enzimi dimerici che si verificano nei batteri, negli arcai, nelle piante e nei parassiti protisti. Queste proteine si sciolgono il pirofosfato in due molecole di ortopofosde, che è accoppiato con protone e/o ione di sodio che pompa attraverso la membrana. Poiché non si verificano proteine omologhe negli animali e negli esseri umani, gli mPPasi e sono buoni candidati nella progettazione di potenziali bersagli farmacologici. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening per gli inibitori mPPase utilizzando la reazione blu molybdenum in un sistema di piastra 96. Usiamo mPPase dal batterio termofilo Thermotoga maritima (TmPPase) come enzima modello. Questo protocollo è semplice ed economico, producendo un risultato coerente e robusto. Ci vuole solo circa un'ora per completare il protocollo di analisi dell'attività dall'inizio del saggio fino alla misurazione dell'assorbimento. Poiché il colore blu prodotto in questo saggio è stabile per un lungo periodo di tempo, il saggio successivo può essere eseguito immediatamente dopo il lotto precedente e l'assorbimento può essere misurato in un secondo momento per tutti i lotti contemporaneamente. Lo svantaggio di questo protocollo è che è fatto manualmente e quindi può essere estenuante così come richiedono buone abilità di pipettaggio e di mantenimento del tempo. Inoltre, la soluzione arsenite-citrate utilizzata in questo saggio contiene arsenite di sodio, che è tossico e deve essere maneggiato con le precauzioni necessarie.

In questo protocollo, sono stati testati otto composti (Figura 2A) insieme a IDP, un inibitore comune di pirofofosofasi, come controllo positivo. Ogni composto è stato testato in triplice copia a tre diverse concentrazioni (1 M, 5 M e 20 M) in triplice copia. Il flusso di lavoro dello screening è illustrato nella Figura 1, a partire dalla preparazione del campione e del reagente fino alla misurazione dell'assorbimento a 860 nm.
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Qui presentiamo un metodo di screening per gli inibitori di pyrophosphatase legati alla membrana (da Thermotoga maritima) basato sulla reazione blu molybdenum in un formato 96 pozzo piastra.

Screening per inibitori di Pirofosofasi rilegati a Thermotoga

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Il nostro protocollo funziona come uno strumento per trovare composti che inibiscono la de-attività della pirofosfatasi legata alla membrana. E questi inibitori possono essere utilizzati nel trattamento di diverse malattie parassitarie. Questo protocollo è economico e semplice producendo colori stabili per lungo tempo senza mostrare alcuna interferenza in presenza di alta concentrazione fosfolipidica richiesta per la riattivazione enzimatica.Preparare 10 millilitri della soluzione tampone di riattivazione, contenenti 20 millimolare M-E-S a PH 6,5, 3,5% volume per glicerolo volume, due D-T-T millimolare e 0,05%D-D-M. Preparare 10 millilitri del miscelatore di reazione, contenenti 200 tris cloridrato di millimolare a PH otto. Cloruro di magnesio millimolare, cloruro di potassio millimolare 333 e cloruro di sodio millimolare da 67 millimolare.Preparare 30 milligrammi per liposomi millilitro per la riattivazione enzimatica. In primo luogo, aggiungere 10 millilitri di 20 millimolare di tris cloridrato a PH otto, con un D-T-T millimolare a 0,3 grammi di L alfa fosfatidilcolina dal fagiolo di soia. Metti il liposoma sul ghiaccio e sonica con un secondo post-intervalli per un minuto.Mettere in pausa per un minuto e ripetere fino a quando la soluzione diventa giallo trasparente. Aliquota i liposomi in 100 microlitri, congelare l'azoto liquido e conservare a -80 gradi Celsius fino a quando non viene utilizzato. Per riattivare l'enzima, scongelare la soluzione liposoma a temperatura ambiente.Mescolare 40 microlitri della soluzione liposoma con 22,5 microlitri del 20%D-D-M. Mantenere la miscela a 55 gradi Celsius per 15 minuti. E lasciare raffreddare a temperatura ambiente.Quindi, aggiungere 36,5 microlitri della soluzione tampone di riattivazione. Mescolare e aggiungere un microlitro di proteine concentrate per ottenere una concentrazione totale di 0,13 milligrammi per millilitro. Successivamente, trasferire 20 microlitri dell'enzima riattivato a 1480 microlitri della miscela di reazione.Mescolare delicatamente e utilizzare immediatamente. In primo luogo, sciogliere i composti in D-M-S-O per realizzare soluzioni stock di 50 millimolari in 200 microlitri. Per i composti solubili diluire la soluzione stock con acqua a un millilitro in micro tubi, per dare due, 10 e 100 micromolari.Per ogni diluizione, vortice la soluzione composta per una corretta miscelazione. Successivamente, controllare la divergenza composta e, utilizzando una pipetta multicanale, erogare 75 microlitri della miscela di reazione in ogni pozzo in una piastra da 96 porri. Aggiungere 75 microlitri di ogni composto e acqua come controllo in triplice copia e mescolare pipettando su e giù cinque volte.Misurare ogni pozzo a 300 volt utilizzando un nefelometro micropiatta. Per preparare la soluzione di citrato di arsenite, pesare cinque grammi di arsenite di sodio e cinque grammi di diidrato di citrato di trisodico, sciogliere entrambi i composti in 100 millilitri di acqua. Quindi, aggiungere cinque millilitri di acido acetico glaciale.Mescolare e aggiungere acqua a 250 millilitri, conservare a temperatura ambiente protetta dalla luce. Quindi, preparare la soluzione A aggiungendo 10 millilitri di acido cloridrico molare freddo di ghiaccio a 0,3 grammi di acido ascorbico Sciogliere l'acido ascorbico con il vortice. Preparare la soluzione B aggiungendo un millilitro di acqua ghiacciata a 70 milligrammi di tetratiomodato tetraidrato di ammonio e vortice da sciogliere.Conservare le soluzioni A e B sul ghiaccio. Preparare lo standard fosfato con una concentrazione pari a zero, 62,5, 250 e 500 micromolari per la taratura. Aggiungere zero microlitri, 12,5 microlitri, 50 microlitri e 100 microlitri di diidrato di fosfato disodico millimolare a quattro micro tubi contenenti 370 microlitri della miscela di reazione.Ricarica fino a un millilitro con acqua. Ora aggiungere un millilitro della soluzione B a 10 millilitri di soluzione A, mescolare a mano e conservare la soluzione sul ghiaccio. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 40 microlitri di zero, 62,5, 250 e 500 standard di fosfato micromolare agli script del tubo in triplice copia.Aggiungere quindi 25 microlitri di soluzione composta e 15 microlitri di miscela di soluzioni M-P-P-A di ciascun tubo. Ad eccezione dei tubi contenenti norma fosfato. Sigillare le strisce del tubo con un foglio di tenuta adesivo.Tagliare il foglio di tenuta per separare ogni nastro del tubo. Successivamente, pre incubare il campione per cinque minuti a 71 gradi Celsius. Posizionare il campione sul blocco riscaldante con intervalli di 20 secondi tra ogni striscia.Per ogni striscia, aprire la sigillatura adesiva. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di due dibasici molari di pirofosfato di sodio. E mescolare pipettando su e giù per cinque volte.Sigillare nuovamente la striscia del tubo utilizzando la stessa sigillatura. Incubare di nuovo a 71 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, posizionare i campioni sull'apparecchio di raffreddamento con un intervallo di 20 secondi tra ogni striscia.Lasciare raffreddare per cinque minuti e quindi centrifugare brevemente ogni striscia per decantare le gocce d'acqua sotto il foglio di tenuta. Rimettere la striscia all'apparecchio di raffreddamento, rimuovere la sigillatura e lasciarla raffreddare per altri cinque minuti. Quindi aggiungere 60 microlitri della soluzione A e B, mescolare tubazione su e giù per cinque volte e mantenere le strisce del tubo sull'apparecchio di raffreddamento per altri 10 minuti.In una cappa aspirante aggiungere 90 microlitri della soluzione di citrato di arsenite e mantenere a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. Per produrre un colore blu stabile. Distribuire 180 microlitri di ogni miscela di reazione in una chiara micropiatta di polistirolo a 96 polietilene.Utilizzare uno spettrofotometro a micropiastra per misurare l'assorbanza di ogni pozzo a 860 nanometri. In questo protocollo, otto composti sono stati testati insieme all'I-D-P, un comune inibitore della pirofosfatasi come controllo positivo. Dopo l'aggiunta della soluzione A e B e del citrato di arsenite, un colore blu in 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente.Tutte e tre le concentrazioni di composti non inibitori, mostravano la stessa intensità di colore blu. Così come da E-1 a E-3 senza alcun inibitore. La trama dell'attività enzimatica contro la concentrazione di ogni composto testato mostra che il composto con attività di inibizione formava un raccordo a curva non lineare.La trama dell'I-D-P come controllo positivo, mostra chiaramente una diminuzione dell'attività a concentrazioni più elevate. La curva di inibizione per i composti uno, cinque, sei, sette e otto. Mostra concentrazioni inibitorie semi massime a 1,7 micromolari, 21,4 micromolari, 58,8 micromolari, 239,0 micromolari e superiori a 500 micromolari, rispettivamente.Ricordati di prepararti, la soluzione M-P-P-A. Poco prima dell'inizio del saggio.

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Un nuovo metodo evoluzione diretta specifico campo dell'ingegneria termostabilità stato sviluppato e validato per conseguenza enzimi bacteriolytic. Dopo un solo ciclo di mutagenesi casuale, un enzima evoluta bacteriolytic, PlyC 29C3, visualizzato superiore a due volte l'attività residua rispetto alla proteina wild-type, dopo incubazione temperatura elevata.

Un nuovo metodo di screening per l&#39;Evoluzione diretta di enzimi termostabili bacteriolytic

Fonte: Vidilaseris, K., et al. Screening per gli inibitori della pirofosfatasi legati alla membrana di Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra un test colorimetrico per lo screening degli inibitori della pirofosfatasi batterica legata alla membrana (mPPasi) quantificando il rilascio di ortofosfato. Il metodo consente l'identificazione di composti che inibiscono la mPPasi da Thermotoga maritima, un potenziale bersaglio farmacologico antimicrobico.

Screening degli inibitori della pirofosfatasi legata alla membrana batterica mediante un test colorimetrico 

Il presente rapporto descrive un test enzimatico in vitro per misurare l'attività della fosfatidiletanolammina metiltransferasi utilizzando estratti cellulari di Leishmania. Questo test si basa sul trasferimento di un gruppo metilico radioattivo dalla S-[metil-3H]adenosil-L-metionina alla fosfatidiletanolammina endogena.

In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

Questo lavoro presenta un metodo di screening ad alto rendimento utilizzando un sistema di screening enzimatico genetico universale che può essere teoricamente applicato a oltre 200 enzimi. Qui, il singolo sistema di screening identifica tre diversi enzimi (lipasi, cellulasi e fosfatasi alcalina) semplicemente cambiando il substrato utilizzato (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-cellobioside e fenil fosfato).

Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

Presentiamo un piano strategico e un protocollo per identificare le varianti genetiche non codificanti che influenzano il legame del DNA con il fattore di trascrizione (TF). Viene fornito un protocollo sperimentale dettagliato per il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) e il saggio di precipitazione di affinità del DNA (DAPA) del legame del DNA TF genotipo-dipendente.

Screening per Funzionale non codificante Varianti genetiche Utilizzando Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e DNA-affinità precipitazioni Assay (DAPA)

La segnalazione di TLR (Toll-like receptor) ha un ruolo importante nella fisiopatologia di molte malattie infiammatorie umane e la regolazione delle risposte TLR mediante nanoparticelle bioattive è prevista per essere vantaggiosa in molte condizioni infiammatorie. Le cellule reporter THP-1 forniscono una piattaforma di screening versatile e robusta per identificare nuovi inibitori della segnalazione TLR.

Screening delle nanoparticelle bioattive in cellule immunitarie fagocitiche per gli inibitori della segnalazione di ricetrasmettitori simili

Questo protocollo è stato sviluppato per studiare la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050, un'amminopeptidasi M42, a livello strutturale. È una pipeline semplice che parte dalla purificazione delle proteine all'elaborazione dei dati a raggi X. La cristallogenesi, l'indicizzazione del set di dati e la sostituzione molecolare sono state enfatizzate attraverso un caso di studio, variante TmPep1050H60A H307A.

Cristallografia a raggi X per studiare la transizione di stato oligomerica della termotoga maritima M42 Aminopeptidasi TmPep1050

La capacità di valutare l'impegno target da parte degli inibitori candidati nelle cellule intatte è fondamentale per la scoperta di farmaci. Questo protocollo descrive un saggio di spostamento termico cellulare in formato 384 che rileva in modo affidabile l'impegno del bersaglio cellulare degli inibitori che prendono di mira SHP2 di tipo selvaggio o le sue varianti oncogeniche.

Valutazione dell'impegno del bersaglio cellulare da parte degli inibitori della fosfatasi SHP2 (PTPN11)

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Questo protocollo introduce una metodologia di screening fluorometrica ottimizzata per identificare inibitori naturali di prodotti e piccole molecole nella sintesi proteica. La sua praticità lo rende adatto sia all'istruzione triennale sulle tecniche di scoperta di farmaci sia all'applicazione in campagne di chimica medicinale.

Un protocollo basato sulla fluorescenza per lo screening preliminare degli inibitori della sintesi proteica da fonti naturali

Scopri un metodo di screening per identificare inibitori della pirofosfatasi membranosa di Thermotoga maritima utilizzando la reazione del blu di molibdeno in piastra 96 pozzetti. Questo protocollo economico e stabile facilita la ricerca di composti terapeutici contro malattie parassitarie.

Screening per inibitori di Pirofosofasi rilegati a Thermotoga

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