Name: Utilizzo del modello di membrana coroallantoica di pollo in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Scopri il modello di membrana coroallantoica di pollo per studiare tumori ginecologici e urologici. Questo metodo consente una rapida crescita tumorale in vivo immunotollerante per testare nuove terapie.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Fuyuhiko Tamanoi e Binh Vu per la formazione iniziale su questo metodo. Le discussioni con la Dott.ssa Eva Koziolek sono state determinanti nell'ottimizzazione di questo approccio e sono state molto apprezzate. Questo lavoro non sarebbe stato possibile senza il finanziamento delle seguenti fonti: il programma di ricerca sulle malattie relative al tabacco Postdoctoral Fellowship (27FT-0023, ACS), il Department of Defense (DoD) Ovarian Cancer Research Program (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), Tobacco-Related Disease Research Program High Impact Pilot Award (27IR-0016) e il supporto istituzionale UCLA, tra cui un JCCC Seed Grant (NCI/NIH P30CA016042) e una sovvenzione 3R dall'Ufficio del Vice Cancelliere per la Ricerca a LW.

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<li>Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+chorioallantoic+membrane+as+an+in+vivo+xenograft+model+for+Burkitt+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma.</a> BMC Cancer. 14 (1), 339(2014).</li>
<li>Avram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+A375+human+melanoma+models+on+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane+and+Balb%2Fc+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice.</a> Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'espansione e l'innesto del tumore con il modello CAM consentono una crescita tumorale più rapida e direttamente osservabile rispetto ai modelli animali in vivo esistenti. Inoltre, i costi sono significativamente più bassi una volta completato l'acquisto iniziale di attrezzature, soprattutto se confrontato con il costo dei topi immunocompromessi. Lo stato iniziale, immunocompromesso degli embrioni di pollo, consente facilmente l'innesto di tessuto umano e murino. Anche con questi punti di forza, il modello CAM ha delle ...

I topi sono serviti come il classico organismo modello per lo studio delle malattie umane, compresa la malignità. Come mammiferi, condividono molte somiglianze con gli esseri umani. Il loro alto grado di somiglianza genetica ha permesso la manipolazione transgenica del genoma del topo per fornire enormi informazioni sul controllo genetico delle malattie umane1. Un'ampia esperienza nella gestione e sperimentazione dei topi ha portato al loro essere il modello di scelta per la ricerca biomedica. Tuttavia, oltre alle preoccupazioni etiche e scientifiche riguardanti i modelli murini, possono anche essere piuttosto costose e dispendiose in termini di tempo2,3. Lo sviluppo dei tumori può richiedere settimane o addirittura mesi. L'alloggiamento in un'istituzione tipica da solo può funzionare in centinaia a migliaia di dollari mentre i tumori si stanno sviluppando. Il cancro ovarico è un esempio di questo inconveniente perché la sua crescita nei modelli murini può facilmente richiedere mesi. I ritardi nei progressi della ricerca hanno un potenziale impatto sul tasso di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti affetti da cancro ovarico, pari solo al 47% (ossia un aumento della sopravvivenza di appena il 10% in 30 anni)4. Allo stesso modo, i tumori urologici (cancro del rene, della prostata e della vescica) costituiscono il 19% di tutti i casi di cancro negli Stati Uniti e l'11% dei decessi correlati al cancro4. Così, un nuovo approccio in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici potrebbe far risparmiare a un laboratorio molto tempo, lavoro e denaro, anche se questo modello viene applicato solo agli esperimenti di screening iniziali. Inoltre, la conseguente accelerazione dei risultati della ricerca potrebbe avere un impatto significativo i 177.000 individui diagnosticati con questi cancri ogni anno.
Il modello CAM di pollo offre molti vantaggi che affrontano i problemi di cui sopra. Un modello popolare per studiare l'angiogenesi5,6, invasione delle cellule tumorali7,8, e metastasi7,9, il modello CAM embrione pulcino è già stato utilizzato per studiare molte forme di cancro, tra cui glioma10,11,12, testa e collo carcinoma a cellule squamose13,14, leucemia15,16, cancro al pancreas17, cancro colorettale18. Inoltre, sono stati generati modelli CAM per neuroblastoma19, linfoma Burkitt20, melanoma21e fibrosarcoma felino22. Studi precedenti hanno anche presentato l'innesto di cancro della vescica23 e linee cellulari del cancro alla prostata24, ma con dettagli di protocollo limitati. Non solo le uova sono molto più economiche dei topi, ma producono anche risultati altamente riproducibili25,26. Essi mostrano lo sviluppo di vascolatura veloce, e l'afflusso di tumore può verificarsi in più rapidamente come pochi giorni ed essere visualizzato longitudinalmente attraverso la finestra aperta. Con il periodo di tempo di 21 giorni tra la fecondazione ovula e la schiusa, gli esperimenti possono essere completati in poche settimane. Inoltre, il basso costo, le limitate esigenze abitative e le piccole dimensioni consentono facilmente esperimenti su larga scala che sarebbero proibitivi per gli studi sui topi.
Pertanto, abbiamo cercato di ottimizzare il modello CAM per l'innesto di tumori ginecologici e urologici. A causa dello stato immunocompromesso del primo embrione di pollo27, sia le cellule del topo che quella umana possono essere facilmente impiantate. Come tale, abbiamo innestato con successo tumori ovarici, renali, prostatici e della vescica. Per ciascuno di questi tipi di tumore, la CAM accetta prontamente le linee cellulari del topo e/o del tumore umano. È importante sottolineare che i tessuti tumorali primari appena raccolti possono anche innestare cellule digerite o pezzi di tessuto solido con alti tassi di successo. Ognuno di questi tipi di cancro e fonti cellulari richiede ottimizzazione, che condividiamo qui.

<table><tbody><tr><td>-010 Teflon (PTFE) Bianco 55 Duro Shore D O-Ring</td><td>L'O-Ring Store</td><td>TEF010</td><td>Anello antiaderente per la semina cellulare. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Politetrafluoroetilene (PTFE).</td></tr><tr><td>C4-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-3314</td><td>Linea cellulare di cancro alla prostata umana.</td></tr><tr><td>Le cellule CWR22Rv1</td><td></td><td></td><td>CWR sono state il gentile dono del Dr. David Agus (Keck Medicine della University of Southern California)</td></tr><tr><td>Anticorpo citocheratina 8/18 (C-51)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-44929-0,02mg</td><td>Utilizzato a una diluizione di 1:100 per l'analisi immunoistochimica dei tumori ovarici CAM umani.</td></tr><tr><td>D-Luciferina Firefly, sale di potassio</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Operative Delicate; Curvo; Acuto-tagliente; Lunghezza lama 30 mm; 4-3/4 pollici Lunghezza totale Roboz</td><td>Surgical</td><td>RS6703</td><td>Questo è fornito come esempio. Anche qualsiasi forbice curva simile funzionerebbe.</td></tr><tr><td>Kit di attrezzi Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td>Questo kit contiene tutti gli strumenti necessari.</td></tr><tr><td>Uova di gallina fecondate (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)</td><td>AA Lab Eggs Inc.</td><td>N/A</td><td>Dovrebbe essere identificato un fornitore locale di uova, poiché questo fornitore consegna solo a livello regionale.</td></tr><tr><td>HT-1376</td><td>ATCC</td><td>CRL-1472</td><td>Linea cellulare di cancro alla vescica umana.</td></tr><tr><td>Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit</td><td>Incubator Warehouse</td><td>HB1588D-NONE-1102-1588-1357</td><td>È possibile utilizzare altre incubatrici per uova, ma la loro affidabilità dovrebbe essere verificata. Dopo l'impianto, può essere utilizzato anche un incubatore cellulare con CO2 disabilitata.</td></tr><tr><td>ID8</td><td></td><td></td><td>Non disponibile in commercio, vedere PMID: 10753190.</td></tr><tr><td>Incu-Bright Cool Light Egg Candler</td><td>Incubator Warehouse</td><td>1102</td><td>Possono essere utilizzati altri candelabri; tuttavia, questo è preferito tra quelli che abbiamo testato. Questo candelabro è incluso nel suddetto kit incubatrice.</td></tr><tr><td>Pinze a iride, 10 cm, curve, seghettate, punte da 0,8 mm</td><td>World Precision Instrument</td><td>15915</td><td>Questo è fornito come esempio. Anche qualsiasi pinza curva simile funzionerebbe. Per questo metodo sono state utilizzate più marche.</td></tr><tr><td>Clipper per isoflurano</td><td>che distribuisce</td><td>0010250</td><td></td></tr><tr><td>sistema di imaging in vivo IVIS Lumina II</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Membrane Matrix HC; </td><td>Soluzione di</td><td></td><td>matrice extracellulare</td></tr><tr><td>MyC-CaP</td><td>ATCC</td><td>CRL-3255</td> 354248 Linea <td>cellulare di cancro alla prostata murino.</td></tr><tr><td>Controller per pipette portatile Pipet-Aid XP</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>Qualsiasi controller per pipette simile sarebbe appropriato.</td></tr><tr><td>Aghi ipodermici PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305196</td><td>Questo è fornito come esempio. Qualsiasi ago da 18G funzionerebbe in modo simile.</td></tr><tr><td>RENCA</td><td>ATCC</td><td>CRL-2947</td><td></td></tr><tr><td>Semken Forcipe</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>11008-13</td><td>Questo è fornito come esempio. Qualsiasi pinza simile o un altro stile che si adatti alle preferenze del ricercatore sarebbe appropriato.</td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Linea cellulare di carcinoma ovarico umano.</td></tr><tr><td>Pinza per campioni Microscopia</td><td>elettronica Scienze</td><td>72914</td><td>Questo è fornito come esempio. Le pinze utilizzate per estrarre il guscio per l'imaging a bioluminescenza sono lunghe circa 12,8 cm con punte larghe 3 mm.</td></tr><tr><td>Batuffoli di cotone sterili</td><td>Fisherbrand</td><td>22-456-885</td><td>Questo è fornito come esempio. Sarebbero sufficienti batuffoli di cotone sterili.</td></tr><tr><td>Aste di agitazione con poliziotto di gomma; diametro 5 mm, lunghezza 6 pollici</td><td>United Scientific Supplies</td><td>GRPL06</td><td>Questo è fornito come esempio. Funzionerebbero anche aste di agitazione in vetro simili.</td></tr><tr>Linea <td>cellulare di cancro alla vescica umana</td> <td>T24</td><td>ATCC</td><td>HTB-4</td>.</tr><tr><td>Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"</td> <td>Moore Medical</td><td>21272</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali, diametro 10 cm</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>Questo è fornito come esempio. Può essere utilizzato qualsiasi piatto simile sterile da 10 cm. Non è necessario un trattamento di coltura tissutale.</td></tr><tr><td>Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 parete (50 piedi)</td><td>Tygon</td><td>AACUN017</td><td>Questo è fornito come esempio. Funzionerebbe anche qualsiasi tubo di dimensioni simili.</td></tr></tbody></table>

utilizzo del modello di membrana coroallantoica di pollo in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici

Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers

I modelli murini sono i test di riferimento per gli studi sul cancro in vivo. Tuttavia, i costi, i tempi e le considerazioni etiche hanno portato a richieste di modelli alternativi di cancro in vivo. Il modello di membrana corioalltoica di pollo (CAM) fornisce un'alternativa rapida e economica che consente la visualizzazione diretta dello sviluppo del tumore ed è adatta per l'imaging in vivo. Come tale, abbiamo cercato di sviluppare un protocollo ottimizzato per l'ingoiare i tumori ginecologici e urologici in questo modello, che presentiamo qui. Circa 7 giorni dopo la fecondazione, la cella d'aria viene spostata sul lato vascolarizzato dell'uovo, dove viene creata un'apertura nel guscio. I tumori da linee cellulari murine e umane e tessuti primari possono quindi essere innestati. Questi sono tipicamente semi in una miscela di matrice extracellulare e mezzo per evitare la dispersione cellulare e fornire supporto nutritivo fino a quando le cellule reclutano una fornitura vascolare. I tumori possono quindi crescere fino a 14 giorni aggiuntivi prima della schiusa delle uova. Impiantando cellule correttamente trasdotte con luciferasi della lucciola, l'imaging della bioluminescenza può essere utilizzato per il rilevamento sensibile della crescita tumorale sulla membrana e le cellule tumorali si diffondono in tutto l'embrione. Questo modello può essere potenzialmente utilizzato per studiare la tumorigenicità, l'invasione, la metastasi e l'efficacia terapeutica. Il modello di pollo CAM richiede molto meno tempo e risorse finanziarie rispetto ai modelli murini tradizionali. Poiché le uova sono immunocompromesse e tolleranti immunitarie, i tessuti di qualsiasi organismo possono essere potenzialmente impiantati senza costosi animali transgenici (ad esempio, topi) necessari per l'impianto dei tessuti umani. Tuttavia, molti dei vantaggi di questo modello potrebbero potenzialmente essere anche limitazioni, tra cui il breve tempo di generazione del tumore e lo stato di tolleranza immunocompromessa/immune. Inoltre, anche se tutti i tipi di tumore presentati qui innesto nel modello di membrana corioallantoica di pollo, lo fanno con vari gradi di crescita del tumore.

Finora, abbiamo trovato questo metodo di impianto per avere successo per i tumori ovarici, renali, prostatici e della vescica. Ognuna è stata ottimizzata per identificare condizioni specifiche per l'impianto, anche se ci può essere flessibilità. Tra i tipi di tumore testati, la crescita del cancro ovarico era molto meno pronunciata e in genere non visibile senza l'assistenza dell'imaging a bioluminescenza (Figura 1). Tuttavia, un irrigidimento della CAM potre...

Vi presentiamo il modello di membrana corioallantoica del pollo come modello alternativo, trapiantabile, in vivo per l'innesto di linee cellulari del cancro ginecologico e urologico e tumori derivati dal paziente.

Utilizzo del modello di membrana coroallantoica di pollo in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici

Mouse models are the benchmark tests for in vivo cancer studies. However, cost, time, and ethical considerations have led to calls for alternative in vivo ...

L'innesto di tumori sulla membrana corioallantoica del pollo, o CAM, può essere utilizzato per studi di tumorigenicità, efficacia del trattamento o crosstalk cellulare. Questo metodo consente una rapida crescita del tumore in un ambiente immunotollerante in vivo. Utilizzando il modello CAM, nuovi approcci terapeutici possono essere rapidamente testati utilizzando linee cellulari o persino campioni di tumore del paziente.Gli aspetti più cruciali di questo protocollo sono garantire una corretta formazione CAM e non interrompere il CAM o la vascucolatura durante l'apertura delle uova. Il giorno di sviluppo sette o otto quando il CAM si è completamente sviluppato, spegnere il rotatore dell'uovo e posizionare circa una o tre uova nel portaovo nell'armadietto della biosicurezza. Con le luci spente, posizionare un candelabro d'uovo contro il guscio d'uovo per identificare e contrassegnare la posizione della cellula d'aria di un uovo, quindi spostare il candeliere dell'uovo sul guscio per trovare una grande rete di vasi sanguigni, ruotando l'uovo se necessario.Una vascucolatura ideale si ramifica vicino al centro dell'uovo. Utilizzare un marcatore per tracciare la vascu caratteristica da utilizzare per l'impianto. Dopo aver riacceto la luce nel cofano, utilizzare uno strumento rotativo cordless dotato di una pietra di rettifica in carburo di silicio per praticare un piccolo foro nel guscio direttamente sopra il centro della cella d'aria.Quando la maggior parte del guscio è stata rimossa ma con la membrana interna bianca intatta, praticare un altro piccolo foro in cui verrà aperta la finestra vascolare come appena dimostrato. Quando il secondo foro è pronto, utilizzare un ago calibro 18 per perforare delicatamente la membrana interna bianca sopra la cella d'aria e la vascucolatura facendo attenzione che la membrana interna bianca, ma non il CAM, sia interrotta in tutta l'area forata. Con il cappuccio di nuovo spento, utilizzare il candeliere dell'uovo per verificare che la cellula dell'aria sia stata trasferita dall'estremità dell'uovo all'area sopra la vascucolatura.Se necessario, posizionare i tubi sottovuoto inseriti in un controller di pipetta attorno al foro sopra la cella d'aria originale e applicare delicatamente l'aspirazione in brevi raffiche per spostare la cella d'aria. Contrassegnare il contorno della nuova posizione della cella d'aria di circa 0,5 centimetri all'interno del limite CAM dell'aria e fissare un pezzo di nastro di imballaggio abbastanza grande da coprire il foro sopra la nuova cella d'aria. Dopo aver preparato le altre due uova come appena dimostrato, riportare le uova nell'incubatrice e aprire eventuali uova aggiuntive per l'esperimento in gruppi da uno a tre come dimostrato.Una volta aperte tutte le uova, trasferire da una a tre uova con celle d'aria ricollocate al portaovo in un armadio per la biosicurezza e utilizzare uno strumento rotativo cordless dotato di una ruota di taglio circolare per tagliare una piccola linea oltre il confine della cellula d'aria completamente attraverso la cella senza interrompere il CAM o la vascucolatura. Utilizzando forbici curve, tagliare intorno alla cella d'aria rimanente per creare una finestra nel guscio e verificare la vitalità dell'embrione. Embrioni vitali mostrerà una vascucolatura estesa, un'albumina chiara, un movimento embrionale e / o un battito cardiaco visibile.Negli embrioni non praticabili, il CAM può apparire opaco con pochi, se non nessuno, vasi presenti e gli embrioni possono essere piccoli o assenti senza movimento o battito cardiaco. Utilizzando le forcep Semkin, estrarre piccoli pezzi di cotone da un batuffolo di cotone sterile e tamponare delicatamente la superficie CAM degli embrioni vitali per rimuovere polvere e detriti del guscio, quindi coprire l'apertura del guscio con un pezzo di un quarto di pellicola trasparente di sei per sette centimetri che si veste senza toccare il CAM e riportare le uova nell'incubatrice con la finestra aperta rivolta verso l'alto. Usa un pezzo di cremagliera per uova, il bordo del rotatore dell'uovo o un altro oggetto adatto per puntellare le uova che continuano a rotolare.Per preparare la sospensione delle cellule tumorali per il trapianto, raccogliere le cellule dalla coltura cellulare tumorale di interesse e sedimentare le cellule mediante centrifugazione. Aspirare il supernatante e rimescolare meccanicamente le cellule nel mezzo residuo. Posizionare la sospensione cellulare sul ghiaccio e utilizzare una pipetta per misurare il volume delle cellule in mezzo.Quindi rimostrare le cellule ad una concentrazione da una a due milioni di cellule in 20-100 microlitri di mezzo integrati con matrice extracellulare da 2,7 a 4 milligrammi per millilitro e qualsiasi fattori di crescita o altri additivi di interesse. Per l'impianto di cellule tumorali, utilizzando un anello antiaderente, posizionare fino a sei uova da impiantare sul rack delle uova e arrotolare i bordi della pellicola trasparente che si veste verso la finestra aperta per rimuovere il film dai gusci. Controlla se le uova sono vitali e sane.Le uova ideali avranno una grande nave con vasi ramificati più piccoli all'interno del centro dell'area aperta. Utilizzando le forcep del diaframma curve, posizionare un anello sterile antiaderente sul CAM sopra il recipiente idealmente su un punto di diramazione. Utilizzare un'asta di agitazione in vetro sterile per abrasare delicatamente il CAM e pipettare la sospensione della cellula tumorale al centro dell'anello.Una volta che tutte le cellule sono state consegnate, sigillare l'apertura con un pezzo di un quarto di pellicola trasparente di sei per sette centimetri ed etichettare l'uovo con un'appropriata designazione implantare. Quindi posizionare le uova saldamente nell'incubatrice con l'apertura del guscio rivolto verso l'alto. Per impiantare le cellule tumorali senza l'uso di un anello antiaderente, aspirare la sospensione cellulare in una punta di pipetta di dimensioni appropriata e tenere la parte superiore della punta espellere con cura la punta della pipetta e posizionare la punta orizzontalmente in un piatto sterile di coltura tissutale di 10 centimetri.Dopo aver caricato le punte, posizionare il piatto in un incubatore di 37 gradi Celsius per 15-30 minuti, controllando la polimerizzazione dopo 15 minuti. Una piccola quantità di liquido in genere fuoriescono quando ogni punta viene posizionata nel piatto. Utilizzare questo liquido per stimare l'estensione della polimerizzazione all'interno della punta.Quando la matrice è pronta, posizionare una punta su una pipetta di dimensioni appropriata e deprimere lo stantuffo per forzare la sospensione cellulare parzialmente polimerizzata sul CAM idealmente sopra il punto ramificato di un grande contenitore ben sviluppato. Utilizzando questi metodi, sia le linee cellulari tumorali ovariane umane che murine e i pezzi tumorali primari hanno portato al successo dell'innesto dei tumori con morfologie coerenti con quelle osservate in altri modelli in vivo. Tra i tipi di tumore testati, la crescita del cancro alle ovaie era molto meno pronunciata e tipicamente non visibile senza l'assistenza dell'imaging a bioluminescenza.Gli effetti dell'aggiunta di fattori di crescita o ormoni al momento dell'impianto possono anche essere testati utilizzando questi metodi. Per il cancro ai reni, l'impianto di cellule carcinoma a cellule renali a cellule chiare da linee cellulari consolidate o pezzi di tumori renali umani primari produce una formazione tumorale rapida e robusta. Inoltre, per stabilire i tumori utilizzando questo modello erano state utilizzate molteplici linee cellulari tumorali della prostata umana e murina e linee cellulari tumorali della vescica umana e pezzi tumorali primari.È fondamentale evitare di interrompere il CAM e la vascucolatura e assicurarsi che il CAM non aderisca al guscio durante l'apertura della finestra. Dopo un accinnesto riuscito, il modello CAM può essere utilizzato per valutare l'efficacia terapeutica dei trattamenti di interesse o delle interazioni tra diversi tipi di cellule all'interno di un tumore.

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Il<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick corioallantoidea membrana (CAM) Saggio come un efficiente dello xenotrapianto Modello di carcinoma epatocellulare

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