Identificare gli inibitori dell'interazione HBx-DDB1 utilizzando un sistema di valutazione di Luciferase diviso
December 21st, 2019
Qui, presentiamo un metodo per lo screening degli agenti virali anti-epatite B che inibiscono l'interazione HBx-DDB1 utilizzando un sistema di analisi luciferasi divisa. Questo sistema consente una facile individuazione delle interazioni proteina-proteina ed è adatto per identificare gli inibitori di tali interazioni.
L'interazione HBX-DDB1 è un passo cruciale per promuovere la trascrizione HPV da cccDNA, quindi questo protocollo può diventare una risorsa chiave per scoprire nuovi agenti terapeutici per la cura funzionale HPV. La nostra procedura è semplice e richiede solo un breve tempo per lo schermo. L'interazione che mescolo può essere rilevata in tempo reale senza richiedere lisi cellulare.
Inoltre, la qualità dello screening è soddisfacente con un punteggio primo Z elevato. L'inibizione dell'interazione HBX-DDB1 porta al ripristino di Smc5/6, che si traduce nella soppressione della trascrizione HPV, dell'espressione proteica e della produzione di cccDNA. Questo nuovo meccanismo di azione antivirale può superare le inadeguatezze delle attuali terapie HPV.
Le interazioni proteina-proteina sono un'importante classe di bersagli farmacologici. L'acido a base di split-luciferasi qui descritto, che prende di mira le interazioni tra proteine virali e hasS, può fornire una nuova strategia per sviluppare cure per altre malattie infettive. Sebbene il nostro protocollo sia semplice e facile da capire, alcuni passaggi potrebbero essere difficili da riprodurre senza la dimostrazione visiva.
Pertanto, la dimostrazione visiva sarà di grande aiuto per comprendere il nostro protocollo. Inizia seminando cinque volte 10 fino alla 5 ° cellule HEK293T in un piatto da 100 millimetri con 10 millilitri di DMEM e incubandoli durante la notte a 37 gradi celsius. Il giorno successivo, diluire un microgrammo ciascuno di HBx-LgBit e SmBit-DDB1 esprimendo plasmidi di DNA e tampone di condensazione del DNA per un volume totale di 300 microlitri.
Aggiungere 16 microlitri di soluzione di esaltatore e mescolare i tubi vortice per un secondo. Incubare il campione a temperatura ambiente per tre minuti, quindi aggiungere 60 microlitri di reagente di trasfezione. Vortice il tubo per 10 secondi e incubare il campione per altri otto minuti.
Nel frattempo, aspirare il mezzo dal piatto con le cellule e lavarle con cinque millilitri di PVS. Aspirare il PVS e aggiungere sette millilitri di DMEM. Aggiungere tre millilitri di DMEM al tubo con i complessi di trasfezione, pipettare su e giù per mescolare e aggiungere la miscela alle cellule.
Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per 10 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo di coltura trascorso e lavare le cellule con cinque millilitri di PVS. Rimuovere il PVS con un millilitro dello 0,25% di tripside EDTA e incubare le cellule a 37 gradi celsius per staccarle.
Successivamente, aggiungere quattro millilitri di DMEM e disperdere il mezzo tubazione più volte sulla superficie dello strato cellulare e trasferire la sospensione su un tubo. Centrifugare le cellule a 500 volte G per cinque minuti, quindi scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in un millilitro di PVS. Ripetere la cetrifugazione e scartare il supernatante.
Quindi, sospendere nuovamente il pellet cellulare con un mezzo di coltura cellulare tamponato integrato con 10%FBS a una densità di semina di un milione di cellule per millilitro. Pipettare 50 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra di 96 po 'e riportare le cellule all'incubatore di 37 gradi celsius per 10 ore. Mentre le cellule stanno incubando, diluire i composti di screening e il solvente alla concentrazione del 13,5%.
Aggiungere 12,5 microlitri di substrato luminescente ad ogni pozzo e incubare la piastra per cinque minuti a temperatura ambiente. Misurare la luminescenza di base con un luminometro e aggiungere cinque microlitri dei composti e del DMSO controllato a ciascun pozzo immediatamente dopo. Misurare la luminescenza ogni 30 minuti per due ore, quindi calcolare gli effetti inibitori dei composti rispetto al trattamento DMSO.
Sono stati misurati i segnali di luminescenza di base e il rapporto segnale-sfondo è stato calcolato essere maggiore di 80. Il primo Z era maggiore di 0,5, indicando che questo sistema di dosaggio è accettabile per lo screening ad alta produttività. Impostando la soglia su un'inibizione superiore al 40% rispetto al controllo solo DMSO, il nitazoxanide è stato identificato come un farmaco candidato.
In precedenza abbiamo identificato il nitazoxanide come un inibitore dell'interazione HBX-DDB1 vagliando una libreria composta su piccola scala di reattività con questo metodo. Usando il nitazoxanide, confermiamo che l'inibizione dell'interazione HBX-DDB1, quella riduzione della trascrizione virale e i successivi livelli di prodotto virale. La porzione ottimale della luciferasi divisa fusa a una proteina bersaglio deve essere determinata in anticipo.
In questo caso, HPX fuso a Large Bit al capolinea C di HPX e DDB1 fuso a Small Bit al termine finale di DDB1 ha fornito i migliori risultati.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per lo screening di agenti antivirali anti-hepatitis B che inibiscono l'interazione HBx-DDB1 utilizzando un sistema di assay di luciferasi divisa. Il protocollo consente il rilevamento in tempo reale delle interazioni proteina-proteina senza lisi cellulare, facilitando la scoperta di nuovi agenti terapeutici per la cura funzionale dell'HPV.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Virologia
- Farmacologia
Contesto
- L'interazione HBX-DDB1 è essenziale per la trascrizione dell'HPV da cccDNA.
- Le attuali terapie HPV presentano inadeguatezze che questo metodo mira ad affrontare.
- Il ripristino di Smc5/6 attraverso l'inibizione di HBX-DDB1 può sopprimere la trascrizione dell'HPV.
- Il sistema di assay di luciferasi divisa fornisce un elevato punteggio Z prime per la qualità dello screening.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per identificare gli inibitori dell'interazione HBX-DDB1.
- Facilitare la scoperta di nuovi agenti terapeutici per l'HPV.
- Migliorare l'efficienza e la qualità dello screening nella ricerca antivirale.
Metodi utilizzati
- Sistema di assay di luciferasi divisa per rilevare le interazioni proteina-proteina.
- Monitoraggio in tempo reale delle interazioni senza lisi cellulare.
- Valutazione della qualità dello screening utilizzando il punteggio Z prime.
- Valutazione dei meccanismi antivirali che prendono di mira HBX-DDB1.
Principali risultati
- Il metodo rileva con successo l'interazione HBX-DDB1 in tempo reale.
- L'inibizione di HBX-DDB1 porta al ripristino di Smc5/6.
- È stata osservata la soppressione della trascrizione dell'HPV e della produzione di cccDNA.
- L'approccio potrebbe fornire un nuovo meccanismo di azione antivirale.
Conclusioni
- Questo metodo offre una promettente via per scoprire nuove terapie HPV.
- Indirizza le limitazioni dei trattamenti esistenti prendendo di mira HBX-DDB1.
- L'assay di luciferasi divisa è uno strumento prezioso per la futura ricerca antivirale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Targeting the HBx-DDB1 interaction addresses a critical mechanistic bottleneck in hepatitis B virus (HBV) drug discovery, enabling direct intervention at the level of viral protein expression. The split luciferase assay system provides real-time, quantitative readouts for inhibitor screening, supporting predictive confidence in early-stage target validation. This platform strengthens portfolio triage by enabling high-throughput identification of compounds with novel antiviral mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of the HBx-DDB1 protein-protein interaction central to HBV pathogenesis.
- Supports biological de-risking by linking inhibition to restoration of Smc5/6 and suppression of viral transcription.
- Facilitates predictive confidence in target engagement through real-time, live-cell measurement.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, high Z prime assay suitable for high-throughput compound screening.
- Provides robust, quantitative luminescence outputs for reliable compound ranking.
- Enables reproducible, scalable workflows for screening libraries against protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by targeting viral protein expression from cccDNA.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by linking molecular inhibition to functional outcomes.
- Reduces translational risk by focusing on a mechanistically validated antiviral target.
Pipeline & Workflow Integration
This split luciferase assay system integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging target validation and high-throughput screening for HBV and potentially other viral targets.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing of protein-protein interaction inhibitors in live cells.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility with high signal-to-background and Z prime metrics.
- Analytics: Generates quantitative inhibition data to compare compound efficacy and selectivity.
- Translational Research: Connects molecular inhibition to restoration of host restriction factors and suppression of viral transcription.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other protein-protein interaction targets in infectious disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for HBV drug discovery.
- Operational Value: Standardizes and accelerates screening workflows with robust, reproducible outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of novel antiviral candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds with unique mechanisms of action.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein-protein interaction assays and live-cell luminescence measurements.
- Needs access to cell culture, transfection reagents, and plate-based luminometry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis for reproducibility.
- May require optimization of fusion protein constructs for different target pairs.
- Visual protocol demonstration aids reproducibility for complex assay steps.
