Name: Sistema di espressione plasmide controllato da Transcriopzionalmente per lanalisi della stabilità delle trascrizioni dellmRNA nelle cellule epiteliali primarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Scopri un sistema di espressione plasmide inducibile per analizzare la stabilità dell'mRNA nelle cellule epiteliali alveolari primarie. Questo metodo di elettroporazione minimizza le alterazioni fisiologiche cellulari.

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Francis Migneault è stato sostenuto da una borsa di studio fornita dal Quebec Respiratory Health Network e dal programma di formazione polmonare del Canadian Institutes of Health Research (CIHR), da uno studente del FRSQ e da una borsa di studio della Faculté des'tudes Supérieures et Post-dottorato, Université de Montréal. Questo lavoro è stato sostenuto dalla cattedra Gosselin-Lamarre nella ricerca clinica e dai Canadian Institutes of Health Research [YBMOP-79544].

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo le linee guida del Canadian Council on Animal Care e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura degli animali del Centro di ricerca del Centro di Ricerca del Centro Ospedaliero de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Progettazione e generazione del plasmide di risposta che esprime il gene di interesse (GOI)
<ol><li>Utilizzare un vettore inducibile di tetraciclina, ad esempio pTRE-Tight.</li>
	<li>Analizzare la sequenza del GOI e del sito di clonazione multipla (MCS) del vettore per identificare i siti di restrizione nel servizio MCS che non sono presenti internamente nel GOI.</li>
	<li>Isolare le cellule epiteliali alveolare primarie dai polmoni di ratto Sprague-Dawley maschili come descritto in precedenza19,20.</li>
	<li>Purificare l'RNA totale dalle cellule epiteliali alveolare mediante l'estrazione dell'RNA utilizzando un metodo standard, come l'estrazione del fenolo/cloroformio o l'uso di colonne di spin dell'RNA a base di silice.</li>
	<li>Trascrivere in modo inverso l'mRNA in DNA complementare (cDNA) usando oligo(dT) e la trascrizione inversa ad alta fedeltà.</li>
	<li>Utilizzare la polimerasi Taq ad alta fedeltà e le tecniche PCR di sovrapposizione standard per affiancare il GOI con due siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione selezionati utilizzando primer progettati.<ol>
<li>Chiedi al primer in avanti di contenere un sito di legame di consensoKozak 21 per migliorare i livelli di espressione per studiare l'espressione proteica in parallelo con la stabilità dell'mRNA. Una sequenza che codifica l'epitopo V5 a monte del GOI deve essere inclusa per distinguere l'espressione del GOI trasinfezione dall'espressione endogena (Tabella 1).</li>
		<li>Chiedi al primer inverso di contenere un segnale di poliadenilazione dopo lo stop codon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>I mutanti possono essere generati mediante delezione sequenziale per studiare gli effetti di diverse regioni UTR 3' sulla stabilità dell'mRNA del GOI utilizzando primer invertiti che codificano un sito di poliadenazione che elimina gradualmente la fine 3' dell'UTR(Figura 6). In alternativa, la mutagenesi diretta da PCR può essere utilizzata per indirizzare una specifica regione di interesse nell'UTR223' .</li>
	<li>Digerire il vettore inducibile e l'inserto con gli enzimi di restrizione scelti in precedenza alla temperatura di incubazione appropriata per 1 h, seguiti dal trattamento con fosfana durante la reazione vettoriale per 30 min per evitare l'auto-legamento.</li>
	<li>Separare il vettore digerito e i segmenti di inserto per elettroforesi in un gel di agarose 1-1,5% (concentrazione a seconda delle dimensioni dell'inserto).</li>
	<li>Utilizzando una lama e una luce UV, raccogliere i frammenti di DNA contenenti l'inserto e il vettore desiderato da ligated. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	<li>Purificare i segmenti raccolti dal gel di agarose utilizzando un kit di purificazione PCR a base di silice e misurare la concentrazione per spettrofotometria a 260 nm.</li>
	<li>Ligate il GOI e il vettore inducibile con legamento del DNA T4 utilizzando un rapporto molare vector:insert di 1:3 per aumentare la probabilità di legatura. Incubare la reazione a temperatura ambiente (RT) per 3 h.</li>
	<li>Trasformare la reazione di legatura in competente E. coli (DH5).<ol>
<li>Aggiungere 1-10 ng di vettore e gene a un tubo contenente 100 -L di cellule competenti. Incubare le cellule sul ghiaccio per 30 min e poi le cellule di shock termico a 42 s. per 45 s. Mettere il tubo sul ghiaccio per 2 min e aggiungere 900 L di mezzo RT LB. Incubare le cellule per 1 h a 37 s con agitazione a 225 giri/min.</li>
		<li>Stendere 100 l della reazione su una piastra di agar LB con un antibiotico adatto (ad esempio, 100 ampicillina g/mL per il vettore pTRE-Tight) per selezionare i batteri trasformati. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Selezionare le singole colonie utilizzando un ciclo di inoculazione o una punta di 20 -L e incubare durante la notte in mezzo 5 mL LB contenente l'antibiotico adatto a 37 gradi centigradi con agitazione. I batteri trasformati possono essere immagazzinati in scorte di glicerolo a -80 gradi centigradi ad un rapporto di 400:600 di LB medio a glicerolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estrarre il DNA plasmide utilizzando colonne di plasmico a base di silice e misurare la concentrazione per spettrofotometria a 260 nm. Confermare l'inserimento del GOI mediante l'analisi delle restrizioni e il suo orientamento e l'assenza di mutazioni potenzialmente introdotte durante RT-PCR mediante sequenziamento.</li>
</ol>2. Trasfezione del plasmide di risposta che esprime il gene di interesse (GOI) in cellule epiteliali alveolar primarie
<ol><li>Isolare le cellule epiteliali alveolare di tipo II dai polmoni del ratto.</li>
	<li>Semina le cellule ad una densità di 1 x 106 celle/cm2 in 100 mm piatti Petri con mezzo essenziale minimo completo (MEM completo). MEM completo è MEM integrato con 10% FBS, 0.08 mg/L tobramycin, Septra (3 g/mL trimethoprim e 17 zollo-mL sofamethoxazole), 0.2% NaHCO3, 0.01 M HEPES (pH - 7.3), e 2 mM L-glutamine. Colture le cellule per 24 h a 37 gradi centigradi in 5% CO2 in un'incubatrice umidificata.</li>
	<li>Il giorno successivo, mettere 500 l una di MEM completa senza antibiotico in ogni pozzo di una nuova piastra da 12 pozze e preriscaldare la piastra a 37 gradi centigradi per 30 minuti. Durante questo passaggio, è importante utilizzare siero bovino fetale privo di tetracicline contaminanti o con un livello troppo basso per interferire con l'inducibilità.</li>
	<li>Preparare tubi da 1,5 mL contenenti il plasmide con il GOI inducibile (plasmide GOI) e il vettore regolatore (ad esempio, pTet-Off) aggiungendo 1 g di plasmide GOI e 1 g di vettore regolatore per pozzo a RT. Per gli esperimenti di coespressione con le proteine leganti l'RNA (RBP), al mix di DNA(Figura 7)viene aggiunto uno g di un vettore costitutivo (ad esempio, pcDNA3) che esprime l'RPB di interesse al mix di DNA ( Figura 7 ).</li>
	<li>Aspirare il mezzo e sciacquare delicatamente le cellule con PBS (senza calcio e magnesio) preriscaldato a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di 0,05% di metapsina preriscaldata a 37 gradi centigradi e incubare le cellule fino a quando le cellule non vengono staccate (2-4 min). Neutralizzare la prova aggiungendo 10 mL di MEM completo senza antibiotici.</li>
	<li>Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL, lavare la piastra Petri con 4 mL di mezzo per raccogliere il maggior numero possibile di cellule rimanenti, quindi centrificare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Aspirare delicatamente e scartare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS. Contare e calcolare il numero di celle utilizzando un emocitometro.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min. Aspirare delicatamente il supernatante e riutilizzare il buffer di sospensione del pellet ad una concentrazione di 4 x 107 celle / mL. Aggiungere le cellule del tubo da 1,5 mL preparate al punto 2,4 con una concentrazione di 400.000 cellule per pozzo e mescolarle delicatamente pipetting su e giù.</li>
	<li>Posizionare il tubo nel dispositivo di elettroporazione e riempirlo con 3,5 mL di tampone elettrolitico.</li>
	<li>Inserire una punta di elettrodo placcato oro in una pipetta premendo completamente il pistone. Mescolare delicatamente il contenuto del tubo da 1,5 mL e aspirare con cura le cellule con la pipetta. Fare attenzione a evitare che le bolle d'aria entrino nella punta, in quanto ciò causerà l'arco elettrico durante l'elettroporazione e porterà a una diminuzione dell'efficienza della trasfusione.</li>
	<li>Inserire la pipetta nella stazione di elettroporazione fino a quando non c'è un suono di clic.</li>
	<li>Selezionare il protocollo di elettroporazione appropriato per le celle epiteliali alveolare, corrispondente a una tensione a impulsi di 1.450 V e 2 impulsi con una larghezza di 20 ms, quindi premere Start sul touchscreen.</li>
	<li>Subito dopo la trasfezione, rimuovere la pipetta e trasferire le cellule in un MEM completo precedentemente riempito senza antibiotico che è stato preriscaldato a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2,11 a 2,14 per i campioni rimanenti.</li>
	<li>Scuotere delicatamente la piastra per stendere le cellule in modo uniforme sulla superficie del pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 in un'incubatrice umidificata. Dopo 2 giorni, sostituire il mezzo con MEM completo con antibiotici.</li>
	<li>Confermare il successo della trasfezione osservando l'espressione di eGFP al microscopio a fluorescenza o per citometria di flusso utilizzando un vettore di controllo (Figura 1). NOTA: questo passaggio è facoltativo e richiede una fase di trasfezione aggiuntiva utilizzando un diverso plasmide che esprime eGFP, ad esempio pcDNA3-EGFP.</li>
</ol>3. Induzione dell'inibizione della trascrizione del GOI
NOTA: Le cellule possono essere pretrattate con i trattamenti desiderati prima dell'induzione della doxyciclina per valutarne l'impatto sulla stabilità dell'mRNA (Figura 5).
<ol><li>Preparare una soluzione di stock doxycycline di 1 mg/mL in acqua deionizzata. Conservare la soluzione di riserva a -20 gradi centigradi, protetta dalla luce. La doxyciclina, derivata da tetraciclina, viene utilizzata al posto della tetraciclina perché ha un'emivita più lunga (2x) della tetraciclina. Inoltre, è necessaria una minore concentrazione di doxycycline per la completa inattivazione del tet operon23. NOTA: La doxycyclina potrebbe influenzare l'espressione mRNA del GOI endogeno. Per verificare questo, l'effetto di un trattamento di 24 ore con doxycyclina sulle cellule alveolar deve essere testato per confermare l'assenza di eventuali cambiamenti nell'espressione GOI (Figura 2).</li>
	<li>Preparare una soluzione doxycycline fresca di 1 g/mL in completa meM 72 h post-trasfezione e scaldarla a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Sostituire il mezzo con 1 mL di MEM completo contenente 1 g/mL di doxycyclina per bene per inibire la trascrizione del GOI.</li>
	<li>Incubare più pozzi a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 per diverse quantità di tempo da 15 min-6 h per valutare l'emivita dell'mRNA del GOI.</li>
	<li>Alla fine del trattamento, lavare le cellule con PBS ghiacciato e visualizzarle con un kit di estrazione dell'RNA fenolo-cloroformio disponibile in commercio aggiungendo 500 L di tampone per pozzo e agitando la piastra per omogeneizzare le cellule.</li>
	<li>Isolare l'RNA in base al protocollo del produttore. Determinare la resa e la purezza dell'RNA mediante spettrofotometria a 230, 260 e 280 nm. I campioni di RNA con rapporti 260:230 e 260:280 di 1,8 e 2,0, rispettivamente, sono considerati puri. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
</ol>4. Determinazione della stabilità dell'mRNA del GOI
<ol><li>Trattare 1 g di RNA totale con DNAse I (grado amplificazione) privo di RNAse per rimuovere qualsiasi traccia di DNA plasmide che potrebbe interferire con la successiva amplificazione del DNA.<ol>
<li>In un tubo PCR da 0,2 mL, unire 1 g di RNA totale, 1 -L di 10 volte buffer di reazione DNase I, 1 -L di DNAse I (1 U/L) e acqua senza RNAse per ottenere un volume totale di 10 L.</li>
		<li>Incubare la reazione a RT per 20 min.</li>
		<li>Disattivare il DNeAe I aggiungendo 1 OL di 25 mM di EDTA al mix di reazione da 10 litri e incubando la reazione a 70 gradi centigradi per 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Transizza l'RNA totale impoverito dal DNA in cDNA utilizzando un kit di sintesi cDNA disponibile in commercio con una miscela di oligo(dT) e primer esalofi casuali per migliorare l'efficienza della trascrizione inversa.<ol>
<li>Aggiungete in breve 4 l di mix di reazione da 5 x, 1 luna di trascrizione inversa e 4 luna di acqua priva di RNAse a 11 l del mix di RNA totale impoverito di DNA per ottenere un volume di reazione totale di 20 L. Mescolare bene la reazione perpiperla su e giù.</li>
		<li>Incubare la reazione per 5 minuti a 25 gradi centigradi, seguita da 20 minuti a 46 gradi centigradi, quindi inattivare la reazione incubandola a 95 gradi centigradi per 1 min. Ogni reazione produrrà 50 ng/L di prodotto cDNA.</li>
		<li>Diluire la reazione cDNA a una concentrazione di 5 ng/L aggiungendo 180 l'acqua di biologia molecolare al mix di reazione 20 . Conservare i prodotti cDNA a -80 gradi centigradi o procedere immediatamente all'esecuzione di PCR quantitativo in tempo reale (qPCR). NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
	</ol></li>
	<li>Progettare i primer qPCR in avanti e indietro specifici per il GOI.<ol>
<li>A causa dell'espressione endogena del GOI nelle celle, i primer devono essere progettati per amplificare un amplificatore da 100-150 bp dell'epitopo V5 accoppiato al GOI (Tabella 1).</li>
		<li>I primer genici di riferimento interno devono essere utilizzati anche come controlli di normalizzazione. Di solito, i geni delle pulidi, come i geni beta-actina e ipoxanthine fosfororaltransferyase 1, vengono utilizzati come geni di riferimento. Tuttavia, questi non possono essere utilizzati con questo sistema di induzione a causa della variazione dell'efficienza di trasfezione. Invece, l'espressione della trascrizione tTA-Ad viene valutata ai fini della normalizzazione, perché la sua espressione è costituitiva nelle cellule a causa dell'attività del promotore del citomegalovirus. Qualsiasi variazione nella sua espressione misurata da qPCR sarà rappresentativa dell'efficienza della trasfezione (primer: forward 5'-GCC TGA CGA CAGA CAA GGA AAC TC-3' e reverse 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) e consentirà la normalizzazione dell'espressione dei cloni transfettati (Figura 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare ogni reazione qPCR in triplice copia utilizzando un mix di master colorante verde SYBR.<ol>
<li>Diluire il mix di cDNA 5 ng/L l a una concentrazione di 1,25 ng/L utilizzando acqua di biologia molecolare.</li>
		<li>Unire 5 gradi di Miscela Master di Coloranti Verde (2x), 0,1 l di acqua di biologia molecolare, 0,45 l di 7,5 M di primer in avanti, 0,45 L di 7,5 M di primer inverso e 4 gradi di 1,25 ng/L cDNA per ottenere un volume di reazione totale di 10,5 M ben da pipettaggio e giù in un piatto di 96 PC. Utilizzare pellicola adesiva ottica per garantire che il coperchio della piastra sia sigillato e per evitare la contaminazione e l'evaporazione.</li>
		<li>Abbassare brevemente il mix di reazione mediante centrifugazione e posizionare la piastra in un termociclista qPCR.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificare gli amplificatori GOI e tTA-Ad con tag V utilizzando le seguenti condizioni qPCR: 95 s per 10 min come fase di denaturazione, seguiti da 40 cicli di 95 gradi centigradi per 10 s, 58 gradi centigradi per 15 s e 72 gradi centigradi per 20 s. Una curva di fusione ad alta risoluzione deve essere generata dopo l'esecuzione dei cicli di amplificazione per valutare le temperature di fusione specifiche degli amplificatori desiderati e per garantire l'assenza di picchi di amplificatori rumore.<ol>
<li>Includere controlli negativi per il qRT-PCR eseguendo qPCR con RNA come modello senza trascrizione inversa per fungere da controllo per la potenziale contaminazione del DNA plasmide e qPCR senza cDNA aggiunto al mix qPCR per garantire la mancanza di dimeri primer o Contaminanti.</li>
		<li>La concentrazione ottimale di cDNA, l'efficienza del primer e la concentrazione devono essere ottimizzate secondo il GOI da un analisi della curva standard. A tale scopo, eseguire una diluizione seriale utilizzando cDNA da cellule non trattate (coltivate senza doxyciclina). La curva standard viene generata tracciando i valori Cq rispetto al registro del fattore di diluizione cDNA e l'efficienza di amplificazione (E) viene calcolata in base alla pendenza della curva standard utilizzando la seguente formula: E - 10-1/pendenza NOTA: l'efficienza di amplificazione dovrebbe essere di circa 0,9 a 1,05. In caso contrario, i primer devono essere riprogettati.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizzare i dati qPCR utilizzando il metodo Cq comparativo normalizzando i valori di espressione del GOI in base all'espressione di tTA-Ad per ottenere i livelli di espressione relativi del GOI e per segnalare la sua espressione come percentuale dell'espressione mRNA del GOI nelle celle dello stesso animale al punto di partenza (t ) (Figura 4).</li>
	<li>L'emivita è determinata dalla costante di frequenza (K) della curva di degradazione dell'mRNA GOI utilizzando la seguente equazione: t1/2 - ln 2/K.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Il basso tasso di trasfezione delle cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria è stata una grave limitazione per l'uso del sistema Tet-Off per valutare la stabilità dell'mRNA in queste cellule. Tuttavia, questa limitazione è stata superata dall'elettroporazione delle pipette, consentendo un'efficienza di trasfezione del 25-30%(Figura 1 e Figura 3)26.
La misurazione della stabilità della trascrizione è ...

Sono state sviluppate diverse tecniche per determinare l'emivita degli mRNA. La tecnica di decadimento dell'impulso-chase, che utilizza mRNA etichettati, consente la valutazione simultanea di un grande pool di mRNA con disturbo cellulare minimo. Tuttavia, questo approccio non consente una stima diretta dell'emivita di una singola trascrizione genica e non può essere implementato per studiare la modulazione post-trascrizione di un mRNA in seguito alla stimolazione con fattori di crescita, ROS, alarmins o infiammazione1.
L'uso di inibitori della trascrizione, come l'actinomycin D e la z-amanitina, è un metodo relativamente semplice per misurare la cinetica da degradazione dell'mRNA nel tempo. Uno dei principali vantaggi di questo approccio rispetto a quello delle tecniche precedenti (cioè l'inseguimento a impulsi) si basa sulla capacità di stimare direttamente l'emivita di una determinata trascrizione e di confrontare il modo in cui i diversi trattamenti potrebbero influenzare la sua cinetica degradante. Tuttavia, il significativo impatto deleterio degli inibitori della trascrizione sulla fisiologia cellulare rappresenta un grave inconveniente dell'approccio2. Infatti, l'inibizione dell'intero trascrittoma cellulare con questi farmaci ha l'effetto collaterale negativo di perturare la sintesi di elementi chiave coinvolti nella stabilità dell'mRNA, come i microRNA (miRNA), nonché l'espressione e la sintesi delle proteine che legano l'RNA, che sono importanti per la degradazione e la stabilità dell'RNA. La grave perturbazione della trascrizione genica da parte di questi farmaci potrebbe quindi modificare artefatto le curve di degradazione delle trascrizioni.
Il sistema di induzione del promotore rappresenta un terzo approccio per misurare l'emivita di un mRNA specifico. Questo metodo misura la degradazione di un mRNA specifico in modo simile ai metodi che utilizzano inibitori della trascrizione. Vengono spesso utilizzati due tipi di sistemi di induzione: ilpromotore c-fos 3 indotto dal siero e il sistema inducibile Tet-Off4. Con il sistema c-fos, l'uso di inibitori della trascrizione che possono essere tossici per la cellula non è necessario. Tuttavia, questo metodo richiede la sincronizzazione del ciclo cellulare, che impedisce la valutazione della stabilità effettiva di una trascrizione durante l'interfase5. Al contrario, il sistema Tet-Off consente la forte espressione del gene di interesse (GOI) sotto il controllo di un promotore sintetico regolato dalla tetraciclina. Questo sistema richiede la presenza di due elementi che devono essere cotrastati nella cellula per essere funzionale. Il primo plasmide (pTet-Off) esprime la proteina regolatrice tTA-Adv, un fattore di trascrizione sintetica ibrido composto dal repressore procatotico TetR (da Escherichia coli) fuso a tre domini di trasattivazione della trascrizione dalla proteina virale HSV VP16. Il GOI è clonato nel plasmidp pTRE-Tight sotto il controllo di un promotore sintetico (PTight), che comprende la sequenza minima del promotore di citomegalovirus (CMV) fuso a sette ripetizioni della sequenza dell'operatore tetO. La trascrizione del gene a valle di PTight dipende dall'interazione di TetR con il tetO. In presenza di tetraciclina o della sua derivata, doxycycline, il repressore TetR perde la sua affinità per l'operatore tetO, portando ad una cessazione della trascrizione4. Le caratteristiche del sistema Tet-Off lo rendono un modello ideale per lo studio dell'espressione specifica dell'mRNA nelle cellule eucariotiche, evitando potenziali effetti pleiotropici che sono secondari all'assenza di sequenze regolatorie procariotiche nella cellula eucastica6. Di solito, doppiamente stabile Tet-Off linee cellulari (HEK 293, HeLa, e PC12) sono utilizzati con questo sistema per integrare copie del regolatore e plasmidi di risposta per un comodo accesso all'espressione genica controllabile7,8,9.
Diversi modelli di cellule epiteliali alveolare in coltura sono stati utilizzati per studiare la biologia cellulare e molecolare dell'epitelio alveolare. Per anni, i ricercatori hanno ampiamente utilizzato cellule primarie umane o roditori10,11 così come immortalato linee cellulari come a549 umano o ratto RLE-6TN cellule12,13. Anche se sono generalmente meno proliferale e più difficili da coltura e da transfettare, le cellule epiteliali alveolare nella coltura primaria rimangono il gold standard per lo studio della funzione e della disfunzione dell'epitelio alveolare in condizioni fisiologiche e patologiche. Infatti, le linee cellulari immortalate come le cellule A549 non presentano le caratteristiche complesse e i fenotipi delle cellule primarie, mentre le cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria riassumono le principali proprietà dell'epitelio alveolare, in particolare la capacità di formare una barriera polarizzata e stretta14,15. Sfortunatamente, queste cellule sono molto resistenti alle tecniche di trasfezione convenzionali, come quelle che utilizzano liposomi, rendendo molto difficile l'uso di un sistema indotto dal promotore come il Tet-Off.
La modulazione posttranziale dei mRNA è uno dei metodi più efficaci per modulare rapidamente l'espressione genica di una trascrizione16. La regione non tradotta di mRNA 3' (3' UTR) svolge un ruolo importante in questo meccanismo. È stato dimostrato che, a differenza dell'UTR 5', esiste una correlazione esponenziale tra la lunghezza dell'UTR 3' e le complessità cellulari e morfologiche di un organismo. Questa correlazione suggerisce che l'UTR 3', come le regioni di codifica dell'mRNA, è stato sottoposto a selezione naturale per consentire una modulazione posttranscrittivale sempre più complessa nel corso dell'evoluzione17. L'UTR 3' contiene diversi siti di legame per proteine e miRNA che influenzano la stabilità e la traduzione della trascrizione.
Nel lavoro attuale, abbiamo sviluppato uno strumento per studiare il ruolo dei domini altamente conservati nell'UTR 3' di un GOI per il controllo della stabilità della trascrizione. Ci siamo concentrati sul canale epiteliale di sodio, sottounità alfa ( , che svolge un ruolo chiave nella fisiologia epiteliale alveolare18. Le cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria sono state trascate con successo con i due componenti del sistema Tet-Off, il che consente di studiare il ruolo del 3' UTR nella stabilità dell'mRNA con un sistema che influisce minimamente sulla fisiologia cellulare e sul metabolismo rispetto all'uso di inibitori della trascrizione con altri protocolli. È stata sviluppata una strategia di clonazione per differenziare l'espressione del GOI da quella del gene endogeno utilizzando un epitopo non endogenamente espresso (V5). La risposta e i plasmidi normativi sono stati poi trasferiti nelle cellule epiteliali alveolare utilizzando una tecnica di elettroporazione pipetta. Successivamente, l'espressione della trascrizione è stata misurata incubando le cellule con doxycyclina a diversi intervalli di tempo. L'emivita della trascrizione è stata valutata da RT-qPCR con un metodo Cq modificato utilizzando il prodotto transfetto tTA-Ad mRNA per la normalizzazione. Attraverso il nostro protocollo, offriamo un modo conveniente per studiare la modulazione posttrancrionale di una trascrizione in diverse condizioni e definire il coinvolgimento delle regioni non tradotte in modo più dettagliato.

<table><tbody><tr><td>Actinomicina D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Ematocitometro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio - Grado di biologia molecolare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Microscopio invertito Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DM IL LED con contrasto di fase</td><td></td><td></td> Leica-DNase <td></td></tr><tr><td>I, grado di amplificazione</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>doxiciclina iclilato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (D-PBS), senza calcio e magnesio</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo - Grado di biologia molecolare</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td><td>Eppendorf</td><td>1220G76</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td><td>ThermoFisher Scientific 51026420</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di sintesi iScript cDNA</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td> 1708890 <td></td></tr><tr><td>Isopropanolo - Grado di biologia molecolare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB Brodo con agar (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaridi daPseudomonas aeruginosa10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9143</td><td></td></tr><tr><td>MEM, polvere</td><td>Gibco</td><td>61100103</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Cabine di sicurezza biologica MSC-Advantage Classe II Sistema</td> di <td></td> elettroforesi Mupid-exU <td>ThermoFisher Scientific</td> 51025413 <td></td></tr><tr><td></td><td>Takara Bio</td><td>AD140</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di trasfezione al neon 10 &; L Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di trasfezione al neon Starter Pack</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>One Shot OmniMAX 2 T1RCemicamente competenteE. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C854003</td><td></td></tr><tr><td>pcVettore DNA3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP plasmide</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>PlatinumTaqDNA Polimerasi Alta Fedeltà</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off Vettore avanzato</td><td>Takara Bio</td><td>631070</td><td></td></tr><tr><td>pTRE-Tight vettore</td><td>Takara Bio</td><td>631059</td><td></td></tr><tr><td>Cellule epiteliali alveolari purificate</td> n.a.n.a.QIAEX <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>II Kit di estrazione su gel</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 e 7 Flex Software per sistema PCR in tempo reale Applied</td><td>Biosystems</td><td>n.a.QuantStudio</td><td></td></tr> <tr><td>6 Flex Sistema PCR in tempo reale, 96 pozzetti Fast</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>proteina TNF-alfa di ratto ricombinante</td><td>R& Amp; D Systems</td><td>510-RT-010</td><td></td></tr><tr><td>Septra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2487</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina per gamberetti (rSAP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S Bicarbonato</td><td></td></tr> di <tr><td>sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa SuperScript IV</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligasi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tet System Approved FBS</td><td>Takara Bio</td><td>631367</td><td></td></tr><tr><td>Tobramicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di agarosio ultrapuro</td><td></td><td>16500500</td><td></td></tr> biologia <tr><td>molecolare</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-EL</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema di espressione plasmide controllato da transcriopzionalmente per l'analisi della stabilità delle trascrizioni dell'mrna nelle cellule epiteliali primarie

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Studiare la regolazione posttranscrittivale è fondamentale per comprendere la modulazione di un dato RNA messaggero (mRNA) e il suo impatto sull'omeostasi cellulare e sul metabolismo. Infatti, le fluttuazioni nell'espressione della trascrizione potrebbero modificare l'efficienza della traduzione e, in ultima analisi, l'attività cellulare di una trascrizione. Sono stati sviluppati diversi approcci sperimentali per studiare l'emivita dell'mRNA, anche se alcuni di questi metodi hanno limitazioni che impediscono il corretto studio della modulazione posttranziale. Un sistema di induzione promotore può esprimere un gene di interesse sotto il controllo di un promotore sintetico regolato dalla tetraciclina. Questo metodo consente la stima dell'emivita di un dato mRNA in qualsiasi condizione sperimentale senza disturbare l'omeostasi cellulare. Uno dei principali inconvenienti di questo metodo è la necessità di traffecare le cellule, che limita l'uso di questa tecnica in cellule primarie isolate che sono altamente resistenti alle tecniche di trasfezione convenzionali. Le cellule epiteliali alveolar nella coltura primaria sono state ampiamente utilizzate per studiare la biologia cellulare e molecolare dell'epitelio alveolare. Le caratteristiche uniche e il fenotipo delle cellule alveolare primarie rendono essenziale studiare le modulazioni posttrantalionali dei geni di interesse in queste cellule. Pertanto, il nostro obiettivo era quello di sviluppare un nuovo strumento per studiare le modulazioni posttranscriptionali degli mRNA di interesse per le cellule epiteliali alveolar nella cultura primaria. Abbiamo progettato un protocollo di trasfezione transitoria veloce ed efficiente per inserire un sistema di espressione plasmid a controllo transciriptionally nelle cellule epiteliali alveolare primarie. Questa strategia di clonazione, usando un epito virale per etichettare il costrutto, consente la facile discriminazione dell'espressione costruttiva da quella degli mRNA endogeni. Utilizzando un metodo modificato del ciclo di quantificazione (Cq), l'espressione della trascrizione può quindi essere quantificata a intervalli di tempo diversi per misurarne l'emivita. I nostri dati dimostrano l'efficienza di questo nuovo approccio nello studio della regolazione posttrancriale in varie condizioni patologiche nelle cellule epiteliali alveolari primarie.

Questo protocollo è stato utilizzato con successo per generare un sistema di espressione plasmid etransriptionally controllata Tet-Off per valutare l'importanza di diverse porzioni dell'UTR di ENaC 3' nella modulazione della stabilità della trascrizione nelle cellule epiteliali alveolar primarie.
Il primo passo nell'implementazione di questo sistema è stato quello di stabilire una tecnica di trasfezione rapida, facile ed efficie...

Qui, presentiamo uno strumento che può essere utilizzato per studiare la modulazione posttranscriptionale di una trascrizione nelle cellule epiteliali alveolare primarie utilizzando un sistema di espressione inducibile accoppiato a una tecnica di elettroporazione pipetta.

Sistema di espressione plasmide controllato da Transcriopzionalmente per l'analisi della stabilità delle trascrizioni dell'mRNA nelle cellule epiteliali primarie

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Quindi il nostro modello permette lo studio della modulazione post-trascrizionale di una trascrizione specifica nelle cellule epiteliali alveolari nella coltura primaria e nelle loro condizioni fisiologiche e fisiopatofiche. Quindi la transitoria transitoria delle cellule epiteliali alveolari primarie ha un effetto minimo sulla fisiologia cellulare e sul metabolismo, il che pone un chiaro vantaggio rispetto ai protocolli classici usando gli inibitori della trascrizione. Per la generazione di un plasmide di risposta che esprime un gene di interesse, la sequenza del gene e i siti di clonazione multipla del vettore inducibile devono essere analizzati per identificare le sequenze di riconoscimento nei siti di clonazione multipla che non sono presenti internamente nel gene.Utilizzando la taq polimerasi ad alta fedeltà e le tecniche PCR di sovrapposizione standard, affiancare il gene di interesse con due siti di riconoscimento enzimatico di restrizione selezionati utilizzando primer di progettazione. Una sequenza nella codifica dell'epitopo V5 a monte del gene di interesse deve essere inclusa per distinguere l'espressione del gene trasfetto dall'espressione endogena. I mutanti possono essere generati dalla cancellazione sequenziale per studiare gli effetti di diverse tre regioni prime non tradotte sulla stabilità dell'mRNA del gene usando primer inversi che codificano un sito di poliadenilazione che gradualmente elimina le tre estremità prime della regione non tradotta.In definitiva, l'inserimento del gene di interesse può essere confermato dall'analisi delle restrizioni. L'orientamento genico e l'assenza di mutazioni potenzialmente introdotte durante l'rtPCR possono essere confermati sequenziando. Per la trasfezione del polmone del ratto primario di tipo due cellule epiteliali alveolari, seminare le cellule a una volta 10 alla sesta cellule per centimetro quadrato in piastre di Petri di 100 millimetri in presenza di un mezzo essenziale minimo completo.Coltura per 24 ore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% con umidità. Il giorno dopo, aggiungere 500 microlitri di mezzo completo senza antibiotico ad ogni pozzo di una nuova piastra da 12 porri e preripidare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Durante questa incubazione, aggiungere un microgrammo del plasmide di risposta e un microgrammo di vettore regolatore a un tubo da 1,5 millilitri per pozzo.Lavare le cellule epiteliali alveolari con 10 millilitri per pozzo di 37 gradi Celsius PBS senza calcio o magnesio e trattare le cellule con cinque millilitri per pozzo di 37 gradi Celsius 0,05% tripside per due o quattro minuti nell'incubatore di coltura cellulare. Quando le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripina con 10 millilitri per pozzo di mezzo completo senza antibiotico e raccogliere le cellule in un nuovo tubo da 50 millilitri. Lavare il piatto con quattro millilitri di mezzo fresco per raccogliere eventuali cellule rimanenti e sedimentare le cellule mediante centrifugazione.Resuspend il pellet in un millilitro di PBS per contare e centrifugare nuovamente le cellule. Resuspend il pellet ad una densità di quattro volte 10 alla settima cellule per millilitro di tampone di resuspensione e aggiungere quattro volte 10 alla quinta colonna ad ogni tubo di plasmide e vettore con miscelazione delicata. Posizionare un tubo nel dispositivo di elettroporazione e riempire il tubo con 3,5 millilitri di tampone elettrolitico.Deprimere completamente il pistone per inserire una punta dell'elettrodo placcato oro in una pipetta e mescolare delicatamente il contenuto del tubo. Aspirare con cura le celle con una pipetta e inserire la pipetta nella stazione di elettroporazione fino a quando non si sente un suono di clic. Selezionare il protocollo di elettroporazione appropriato per le cellule epiteliali alveolari e premere Start sul touchscreen.Immediatamente dopo la trasfezione, rimuovere la pipetta e trasferire le cellule in un unico pozzo della piastra pre-riscaldata di 12 pozza. Quando tutte le cellule sono state elettroporate e placcate, posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare, sostituendo il supernatante in ogni pozzo con un mezzo completo con antibiotici dopo due giorni. Il successo della trasfezione può essere confermato dall'espressione di EGFP osservata dalla microscopia a fluorescenza o dalla citometria del flusso usando un vettore di controllo.Per inibire la trascrizione del gene di interesse, 72 ore dopo la trasfezione sostituiscono il supernatante con un millilitro per pozzo di mezzo completo integrato con un microgrammo per millilitro di adossiciclina appena preparata. Per valutare l'emidità dell'mRNA del gene di interesse, riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare da 15 minuti a sei ore. Lavaggio di un pozzo con un millilitro di PBS ghiacciato prima di lesinare le cellule con 500 microlitri di tampone di lysis da un kit di estrazione dell'RNA cloroformio fenolo disponibile in commercio e scuotimento delicato in ogni momento sperimentale.Quindi, isolare l'RNA secondo le istruzioni del kit e determinare la resa e la purezza dell'RNA mediante spettrofotometria a 230, 260 e 280 nanometri. Per determinare la stabilità dell'RNA isolato, trattare prima un microgrammo dell'RNA totale da ogni campione con DNasi libera da RNasi uno per rimuovere eventuali tracce di DNA plasmide. Utilizzare un kit di sintesi cDNA disponibile in commercio con una miscela di primer oligo dT ed esomeri casuali per migliorare l'efficienza di trascrizione inversa per invertire il trascrivere l'RNA totale impoverito del DNA in cDNA secondo le istruzioni del produttore.Aggiungere 180 microlitri di acqua di grado di biologia molecolare ai 20 microlitri del mix di reazione per diluire la reazione del cDNA a una concentrazione di cinque nanogrammi per microlitri e diluire immediatamente il mix di cDNA con acqua fresca di grado di biologia molecolare per raggiungere una concentrazione di 1,25 nanogrammi per microlitro. Combina cinque microlitri di mix principale di colorante verde cibernetico con 0,1 microlitri di acqua di grado di biologia molecolare, 0,45 microlitri di primer forward micromolare 7,5, 0,45 microlitri di primer inverso micromolare e quattro microlitri di 1,25 nanogrammi per microlitro di cDNA per ottenere un volume di reazione totale di 10 microlitri. Posizionare i campioni in un termociclometro qPCR e amplificare il gene di interesse del tag V5 e gli ampliconi anticipati del transattivo della tetrociclina utilizzando le condizioni qPCR come indicato e generare una curva di fusione ad alta risoluzione per valutare le temperature di fusione specifiche degli ampliconi desiderati e per garantire l'assenza di picchi di analcone acustico.Questa tecnica di elettroporazione delle pipette facilita un tasso di efficienza di trasfezione dal 25 al 30%, come osservato dai rapporti delle cellule EGFP rilevati dalla microscopia a fluorescenza e dalla citometria del flusso. Il trattamento delle cellule epiteliali alveolari con un microgrammo per millilitro di doxiciclina non ha alcun impatto significativo sull'espressione dell'mRNA endogeno alfa ENaC in qualsiasi momento durante il periodo di trattamento. Utilizzando un sistema di espressione plasmide controllato trascrizioni come dimostrato, il segnale V5 alpha ENaC potrebbe essere normalizzato secondo il segnale avanzato del transattiator tetraciclina per determinare l'efficienza della trasfezione usando il metodo del ciclo di quantificazione a doppio delta.L'emivita dell'mRNA alfa ENaC è fino a sette volte più breve in presenza del sistema di sconto tetraciclina rispetto alla presenza di actinomicina D, confermando che l'actinomicina D porta ad una stabilizzazione artefatto dell'mRNA alfa ENaC. Inoltre, il trattamento alfa del fattore di necrosi cicloesamide e tumorale ha diminuito significativamente la stabilità della trascrizione mentre i lipolisaccaridi no. Cambiamenti significativi nella modulazione della stabilità dell'mRNA V5 alpha ENaC possono essere indotti a seconda delle regioni cancellate e incluse delle tre regioni prime non tradotte.Inoltre, l'espressione sovraescrizione di specifiche proteine leganti l'RNA diminuisce la stabilità dell'mRNA ENaC 5-alfa rispetto alla trasfezione con un pcDNA vuoto tre plasmidi. Questo strumento sarà utile per interrogare nuove intuizioni sulla regolazione post-trascrizionale dei geni chiave coinvolti nella funzione dell'epitelio alveolare e sulle loro condizioni fisiologiche o patologiche.

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RNA polimerasi II cinetica trascrizionali sono misurate su specifici geni nelle cellule viventi. mRNA trascritto dal gene di interesse sono fluorescente tag e l'utilizzo di recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) la cinetica in vivo di allungamento della trascrizione si ottengono.

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Sistema di espressione plasmide controllato da Transcriopzionalmente per lanalisi della stabilità delle trascrizioni dellmRNA nelle cellule epiteliali primarie (Video) | JoVE Journal

Sistema di espressione plasmide controllato da Transcriopzionalmente per l'analisi della stabilità delle trascrizioni dell'mRNA nelle cellule epiteliali primarie

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