Produzione di particelle pseudotioniche di influenza ad alto livello con le legiole di busta dei virus altamente patogeni H5N1 e Avian H7N9

Questa tecnica di produzione di PP virale influenzale e determinarne l'infettività può semplificare la ricerca del virus influenzale in una città BSL-2. Abbiamo normalizzato lo SPA per le infezioni sulla base dei dati qRT-PCR di PPS. Vengono codificati due plasmidi di espressione della glicoproteina, che possono semplificare la ricerca sul riassegnazione dei virus.

Un giorno dopo la semina cellulare, controllare la morfologia e la densità delle cellule al microscopio a luce invertita. Idealmente la cella dovrebbe essere circa l'85% confluente alla trasfezione. Sostituire il mezzo con un millilitro di DMEM senza siero per pozzo e rimettere la piastra nell'incubatore.

Per ogni pozzo di cellule da trasfetto, diluire otto microlitri del reagente di trasfezione a un volume di 150 microlitri con mezzo siebro ridotto. Mescolare delicatamente la soluzione e lasciarla riposare a temperatura ambiente per cinque minuti. Nel frattempo, diluire 2,5 microgrammi di DNA plasmide in 158 microlitri di mezzo siebro ridotto.

Dopo i cinque minuti di incubazione, unire il DNA diluito con il reagente di trasfezione diluito, mescolare delicatamente la soluzione e lasciarla a temperatura ambiente per 15 minuti. Aggiungere il complesso lipidico del DNA ai pozzi corrispondenti con le cellule in mezzo privo di siero. Quindi mescolare delicatamente il piatto dondolando avanti e indietro.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro o sei ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo e sostituirlo con due millilitri di DMEM per pozzo. Quindi incubarlo per altre 36-48 ore.

Seme ogni tipo di cellula sensibile a 10.000 cellule per pozzo e una piastra di 96 po '. Quindi lasciare il piatto durante la notte in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e del 5%. Il terzo giorno dopo la trasfezione, controllare il colore del mezzo che dovrebbe illuminare il rosa o leggermente arancione ed esaminare le cellule con un microscopio biologico florescente invertito sotto la lunghezza d'onda da 440 a 460 nanometri.

A 38-48 ore dopo la post-trasfezione, raccogliere le particelle pseuotipate o PPS passandole attraverso un filtro a membrana in fluoruro di polivinilidene da 0,45 micrometri per eliminare i detriti cellulari, quindi dividerli in piccole aliquote di volume e conservarli a meno 80 gradi Celsius. Per quantificare il PPS, trasferire 30 microlitri delle particelle virali purificate in un tubo privo di RNasi da 1,5 microlitri e aggiungere un microliter di Benzonasi Nucleasi. Incubare il tubo a 37 gradi Celsius per un'ora per eliminare qualsiasi contaminazione da DNA e RNA.

Dopo l'incubazione, congelare il campione a meno 70 gradi Celsius per attivere la nucleasi e aggiungere due microlitri di Proteinasi K.Incubare la miscela per 30 minuti per digerire le proteine dell'involucro e rilasciare l'RNA CMV-GFP. Quindi inattivo la Proteinasi K a 100 gradi Celsius per tre minuti. Quantificare il PPS con rtpcr di trascrizione quantitativa inversa utilizzando l'Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit nei primer e nelle sonde specificate nel manoscritto testuale.

Normalizzare lo SPA a quattro per 10-quinta copia di RNA per millilitro. Quindi aggiungere TPCK-tripina a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro nel PPS che ospita l'emagglutinina H7N9. Incubare il PPS a 37 gradi Celsius per un'ora per formare le subunità funzionali HA1 e HA2.

Mescolare il PPS normalizzato con il mezzo DMEM con un rapporto uno a uno, quindi portare la piastra contenente cellule sensibili nell'armadio di biosicurezza. Aspirare il supernatante e lavare le cellule una volta con 100 microlitri di PBS pre-riscaldato. Aggiungere 100 microlitri di miscela PPS-DMEM in ogni pozzo, triplicando le prove di infettività di ogni tipo di SPA a una linea cellulare sensibile.

Incubare la piastra per quattro o sei ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi aspirare il supernatante e sostituirlo con 100 microlitri di DCM Incubare la piastra per altre 24-36 ore prima del rilevamento dell'infettività. I nostri risultati sono che gli SPA sono considerati ora infettivi per le persone.

Quindi si raccomandano procedure di protezione necessarie da adottare come indossare una maschera ed eseguire i test di infettività in un armadietto di biosicurezza. Questo protocollo è stato generato per generare 10 tipi di particelle pseudotipate o SPA con due emaglutinina raggruppata e neuraminidasi virus della stomatite vescicolare G glicoproteina o nessuna glicoproteine avvolta. I PPS sono stati imageati con microscopia elettronica a trasmissione e la loro infettività è stata valutata in due linee cellulari, A549 e MDCK.

Nel gruppo PPS che ospita H5, l'infettività di H5N1, H5 più N9 e H5 era di circa il 90%18% e il 10% per le linee cellulari A549 e 40%5% e 5% per MDCK, rispettivamente. Nel gruppo PPS che ospita H7, l'infettività di H7N9, H7 più N1 e H7 era di circa il 10%7% e l'1% per la linea cellulare A549 e 8%4% e 1% per MDCK, rispettivamente. L'infettività del virus della stomatite vescicolare G glicoproteina PP era di circa il 21% per L'A549 e del 16% per le cellule MDCK.

Mentre la busta delta glicoproteine PP non mostrava infettività. È fondamentale ricordare che le cellule HEK-293T/17 del produttore di PP costituiscono alla base di questa procedura. Quindi la crescita ottimale ci insegna che le cellule HEK-293T/17 sono le più importanti.

Seguendo questa procedura o qualche altro test come L2 si può ricettare il saggio di delimitazione. Questo saggio può quasi eliminare le peculiarità biologiche della preferenza del recettore e il modello rivelerà il tropismo del PPS. Dal momento che hanno preso le glicoproteine dal virus influenzale sono clonati in due più max.

Ha e le proteine NA possono essere studiate separatamente in modo da riasordinare tra di loro. I mutanti e gli effetti maturi possono essere esplorati.