Caratterizzare l'efficienza di salto di esone nei campioni di pazienti DMD negli studi clinici sugli oligonucleotidi antisenso

Questo protocollo fornisce una metodologia standardizzata per la preparazione e la gestione del tessuto muscolare in contesti precli clinici e studi clinici, che è importante per ottenere risultati affidabili all'interno del campo DMD. Le tecniche sono rilevanti per i provini di salto esonero per DMD. E il vantaggio principale è che, sono ben consolidati e riproducibili se eseguiti collettivamente.

Queste tecniche si concentrano principalmente sul salto dell'esone in DMD, ma con un cambio di primer, le stesse tecniche possono essere applicate ad altre malattie trattate con terapie di splicing. Questi metodi possono essere utilizzati per ottenere l'efficienza di esone saltando sia l'RNA che le proteine. Per preparare un campione per l'analisi, mescolare prima volumi uguali di gomma tragacante e acqua fino a quando la gomma diventa morbida e appiccicosa.

Caricare questa miscela in siringhe da 25 millilitri e distribuire da 0,5 a un centimetro di gomma su singoli dischi di sughero. Etichettare i dischi sul lato opposto e posizionare un contenitore di isopentane in azoto liquido fino a quando parte del liquido non si congela. Posizionare ogni campione nella gomma tragacante sui dischi con un asse longitudinale di ciascun muscolo perpendicolare al sughero.

Posizionare la gomma intorno al fondo di ogni muscolo per aiutare a tenere il muscolo in posizione e utilizzare una pinzetta per congelare gli esemplari nell'isopentane freddo. Spostare i campioni continuamente per un minuto o fino a completa congelamento prima di posizionarli temporaneamente sul ghiaccio secco. Quindi, posizionare gli esemplari in fiale di vetro per una conservazione di 80 gradi Celsius.

Per sessare il tessuto muscolare congelato per l'analisi, impostare un criostato su una temperatura di lavoro di 25 gradi Celsius e montare il blocco muscolare sul supporto. Tagliare il blocco tissutale fino a ottenere sezioni piatte. Per l'analisi reverse transcriptase PCR e Western blot, ottenere fette spesse 10 micrometri.

Per l'analisi immunoistochimica, ottenere fette spesse da sei a otto micrometri e, per la colorazione dell'ematossilina e dell'eosina, ottenere fette spesse da 10 a 12 micrometri. Dopo la loro acquisizione, posizionare le sezioni affettate in due tubi millilitro. Conservare i campioni per PCR e western blotting a 80 gradi Celsius.

Qui vengono mostrati il sistema di elettroforesi a microchip, un gel immagini di reazioni PCR in transcriptasi inversa e i risultati di sequenziamento della banda saltata da due pazienti prima e dopo il trattamento con un oligonucleotide antisense in uno studio di fase uno di escalation della dose. Entrambi i pazienti ospitano derelezioni. Come previsto, prima del trattamento, entrambi i pazienti non hanno mostrato alcun salto e solo una banda non saltata poteva essere visualizzato.

Dopo 12 settimane di trattamento, è stata visualizzata una chiara fascia inferiore saltata per il secondo paziente, tuttavia, era ancora difficile rilevare qualsiasi prodotto saltato per il primo paziente. I risultati del sequenziamento hanno mostrato una concatenazione di esoni 47 e 54 per il secondo paziente, ed esoni, 44 e 54 per il primo paziente. Per calcolare la percentuale saltata, la concentrazione molare per la banda saltata è stata divisa dalle bande saltate e non saltate.

Come previsto, nessuna banda di distrofica è stata rilevata dalla macchia occidentale prima del trattamento. Dopo il trattamento, è stata rilevata una banda dal secondo paziente con un peso molecolare inferiore rispetto a quella osservata nel controllo sano. Il primo paziente, tuttavia, non ha mostrato livelli rilevabili di distrofia dopo il trattamento.

È fondamentale gestire correttamente il tessuto muscolare e posizionare ogni campione sulla gomma tragacante in modo coerente. Le sezioni tissutali possono essere analizzate in diversi modi, tra cui da artificiale a PCR, PCR digitale, western blot, immunoistochimica e con diversi tipi di omica. Queste tecniche possono essere accelerate, lo sviluppo, ulteriori farmaci che saltano l'esone prendendo di mira diversi esoni e possono essere applicate allo sviluppo di base virale e di nuovo nell'editing per DMD.