Name: Il metodo CryoAPEX per lanalisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana allinterno delle cellule ultrastrutturalizzate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Impara il metodo cryoAPEX per localizzare proteine di membrana con microscopia elettronica preservando l'ultrastruttura cellulare. Questa tecnica avanzata utilizza il tag APEX2 e cellule HEK293 per studiare i meccanismi di replicazione virale.

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Il protocollo qui descritto deriva da una pubblicazione di Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni R01GM10092 (a S.M.) e AI081077 (R.V.S.) dei National Institutes of Health, CTSI-106564 (a S.M.) dell'Indiana Clinical and Translational Sciences Institute, e PI4D-209263 (a S.M.) dall'Istituto Universitario Purprovvisorio per l'Infiammazione.

1. Cultura cellulare e trasfezione
<ol><li>Seme HEK-293T cellule su un 60 mm di diametro o più grande piatto di coltura tissutale e crescere al 60%-90% di confluenza in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi centigradi e 5% CO2.</li>
	<li>Cellule transfettrali con plasmidi di espressione dei mammiferi marcati APEX2 che utilizzano il reagente di trasfezione (vedi Tabella dei materiali)secondo le indicazioni del produttore.</li>
	<li>A 12-15 h dopo la trasfezione, lavare le cellule una volta con salina tamponata da fosfato (PBS). Rimuovere le cellule dal piatto lavando delicatamente con PBS. Un reagente di dissociazione come la trypsin può essere utilizzato se necessario per un determinato tipo di cella. Centrifuga a 500 x g per 5 min per formare un pellet.
</li>
</ol>2. Fissazione chimica e reazione perossidasi
<ol><li>Rimuovere con attenzione il supernatante e risospendere il pellet in 2 mL del 2% di glutaraldeide (v/v) nel buffer di cacodylate di sodio da 0,1 M, pH 7.4, a temperatura ambiente. Mettere il campione sul ghiaccio e incubare per 30 min. Pellet il campione a 500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Da questo punto fino al passaggio 2.3.3, conservare il campione e le soluzioni sul ghiaccio ed eseguire la centrifuga a 4 gradi centigradi. AVVISO: Sia la glutaraldeide che il tampone di cacodylato di sodio (contenente arsenico) sono tossici. Durante la movimentazione devono essere utilizzate procedure di sicurezza adeguate e attrezzature di protezione personale. Le soluzioni contenenti glutaraldeide e/o tampone di cacodylato di sodio devono essere smaltite come rifiuti chimici pericolosi.</li>
	<li>Lavare il pellet 3x per 5 min con 2 mL di tamponi di sodio da 0,1 M. Per questi e successivi fusi, risospendere delicatamente il pellet cellulare nella soluzione richiesta, quindi centrifugare per 5 min a 500 x g e rimuovere e scartare con attenzione il supernatante. Prestare attenzione con le ripetute fasi di pelletazione e sospensione, al fine di ridurre al minimo la perdita del campione.</li>
	<li>Eseguire la reazione perossidasi<ol>
<li>Preparare una soluzione fresca contenente 1 mg/mL di 3,3'-diaminobenzidine tetraidrocchioro (DAB) in buffer cacodilate di sodio da 0,1 M. Sciogliere il DAB vortice vigoroso per 5-10 min. LEGGIA': IL DAB è tossico e potenziale cancerogeno e deve essere maneggiato con procedure di sicurezza adeguate e dispositivi di protezione personale. Le soluzioni contenenti DAB devono essere trattate come rifiuti chimici pericolosi.</li>
		<li>Lavare il pellet risuspendendo in 3 mL di soluzione DAB seguito da pelletta a 500 x g per 5 min.</li>
		<li>Risospendere il pellet in una soluzione DAB da 3 mL a cui è stato aggiunto perossido di idrogeno per raggiungere una concentrazione finale di 5,88 mM. Incubare per 30 min a temperatura ambiente. Il pellet diventa visibilmente marrone-colorato indicando la presenza del prodotto di reazione DAB insolubile. NOTA: potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo di incubazione DAB per ogni campione. Il cambio di colore può essere monitorato al microscopio luminoso. Nella nostra esperienza, un'incubazione di 15-45 min è adeguata per la maggior parte delle proteine. Il perossido di idrogeno deve essere ottenuto da una bottiglia appena aperta o da una bottiglia che è stata tenuta ben sigillata dopo l'apertura.</li>
		<li>Pellet le cellule, quindi lavare 2x per 5 min con 0,1 M tamponi cacodialato, seguito da un lavaggio nel mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) o sui supporti cellulari di scelta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare a 500 anni di una soluzione crio-protettrice di DMEM (o altri supporti cellulari di scelta) contenente il 10% di siero bovino fetale e il 15% di albumina del siero bovino bovino. Pellet, aumentando leggermente la velocità di centrifuga da 500 x g se necessario per ottenere un pellet nella soluzione crio-protettrice spessa. Scartare la maggior parte del supernatante, assicurandosi che sia rimasto abbastanza liquido in modo che il pellet non si asciughi. Trasportare il pellet cellulare allo strumento di congelamento ad alta pressione.</li>
</ol>3. Congelamento ad alta pressione
<ol><li>Riempire il serbatoio del congelatore ad alta pressione con azoto liquido (LN2) e avviare la pompa per riempire la camera campione con LN2. MASSIMA': utilizzare procedure di sicurezza adeguate e dispositivi di protezione personale quando si lavora con azoto liquido. NOTA: questi passaggi sono specifici del congelatore ad alta pressione Leica EMPACT2.</li>
	<li>Wick via qualsiasi liquido rimanente dal pellet cellulare utilizzando l'angolo di una salvietta di laboratorio o un tovagliolo di carta. Deve rimanere abbastanza liquido che il pellet formi una pasta simile in consistenza al dentifricio. Dovrebbe essere abbastanza sottile da essere aspirato in una punta di pipet da 20 l.</li>
	<li>Aspirate 2-3 - L del pellet cellulare e depositarlo su un supporto a membrana. Riempire completamente il pozzo del supporto della membrana, in modo che la tensione superficiale crei una leggera cupola sulla parte superiore, ma il liquido non fuoriesce dal pozzo. Non devono essere presenti bolle d'aria.</li>
	<li>Far scorrere il supporto della membrana nella cartuccia e fissarlo. Posizionare la cartuccia nella macchina HPF che è stata preparata e innescata e premere Start per bloccare.</li>
	<li>Esaminare i grafici di temperatura e pressione rispetto al tempo per verificare che la pressione sia stata raggiunta di 2100 bar e che la temperatura sia stata raggiunta a -196 gradi centigradi entro 200 ms, ed entrambi i parametri siano rimasti stabili per i 600 ms di misurazione.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3,3 a 3,5 fino a quando non è stato utilizzato il pellet della cella o il numero desiderato di campioni è stato bloccato.</li>
	<li>Mantenendo le cartucce immerse in LN2, rimuovere ogni supporto di membrana dalla sua cartuccia, mettere in una capsula di plastica, e posizionare la capsula di plastica in una crio-facciata piena di LN2. NOTA: il protocollo potrebbe essere sospeso qui. Le crio-fiale con campioni possono essere conservate in una dewar LN2 in crio-canne o crio-box.</li>
</ol>4. Bloccare la sostituzione
MASSIMA': utilizzare procedure di sicurezza adeguate e dispositivi di protezione personale quando si lavora con azoto liquido. Inoltre, molte delle sostanze chimiche utilizzate nel passaggio 4 sono tossiche, tra cui acido tannico, tetrossido di osmio, e acetato di uranilo. Queste sostanze chimiche devono essere trattate secondo adeguate procedure di sicurezza e smaltite come rifiuti chimici pericolosi.
<ol><li>Riempire l'unità di sostituzione automatica di congelamento con LN2. Portare la temperatura a -90 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare FS Mix 1 e iniziare FS.<ol>
<li>In un cofano chimico, preparare una soluzione di 0,2% acido tannico (w/v) e 5% DI acqua in acetone e 1 mL per campione in crio-viali. Mettere in LN2 per congelare.</li>
		<li>Collocare le fiale FS Mix 1 e le crio-fiale contenenti i pellet cellulari congelati nella camera campione dell'unità FS. Trasferire la capsula interna contenente il supporto della membrana dalla fiala LN2 nella corrispondente fiala contenente FS Mix 1.</li>
		<li>Avviare un protocollo FS con il suo primo passo di 24 h a -90 . Dopo le 24 h, mettere in pausa l'FS e lavare i campioni 3x per 5 min con acetone che è stato raffreddato a -90 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare FS Mix 2 e completare FS DESTRA: il tetrossido di Osmio è una sostanza chimica altamente tossica e ossidante che deve essere maneggiata solo da individui addestrati secondo protocolli di sicurezza stabiliti. Devono essere seguiti i protocolli per lo stoccaggio e lo smaltimento di soluzioni contenenti osmio, nonché l'etichettatura delle aree di laboratorio in cui è in uso il tetrossido di osmio. Il tetrossido di Osmio deve essere maneggiato in una cappa chimica con dispositivi di protezione personale, tra cui protezione degli occhi, un camice da laboratorio che fornisce protezione completa del braccio, guanti a doppio Nitrile e un respiratore opzionale.<ol>
<li>In un cofano chimico, preparare una soluzione di 1% tetrossido di osmio, 0,2% di acetato uranino, e 5% di acqua in acetone. Aliquota 1 mL per campione in crio-fiale e posto in LN2 per congelare. NOTA: le soluzioni stock di acido tannico (10% w/v in acetone), il tetrossido di osmio (10% w/v in acetone) e l'acetato di uranilo (8% w/v in metanolo) possono essere preparate e conservate in crio-fiale in unln2 dewar per facilitare la preparazione delle mix FS.</li>
		<li>Mettere le crio-fiale con FS Mix 2 nell'unità FS e trasferire le capsule dal terzo lavaggio dell'acetone nelle fiale FS Mix 2. Incubare in FS Mix 2 per 72 h a -90 gradi centigradi, seguito da un graduale riscaldamento a 0 gradi centigradi su 12-18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenere la temperatura a 0 gradi centigradi e lavare 3x per 30 min con acetone pre-raffreddato da una bottiglia appena aperta.</li>
</ol>5. Infiltrazione e incorporamento della resina
AVVISO: La resina qui utilizzata (vedi Tabella dei materiali)è tossica prima della polimerizzazione e deve essere maneggiata con procedure di sicurezza adeguate e dispositivi di protezione personali. Qualsiasi resina non polimerizzata deve essere smaltita come rifiuti chimici pericolosi.
<ol><li>Infiltrare i campioni con crescenti concentrazioni di resina disciolta in acetone da una bottiglia appena aperta. Preparare una miscela di componenti di resina A, B e D in un becher di plastica secondo le indicazioni del produttore e incubare i campioni nelle seguenti concentrazioni di resina: 2%, 4% e 8% per 2 h ciascuno a 0 gradi centigradi. Incubare nel 15%, 30%, 60%, 90% e 100% resina per 4 h ciascuno a temperatura ambiente. Incubare per 4 h in una miscela di componenti A, B, C e D.</li>
	<li>Posizionare i supporti a membrana con il lato del pellet cellulare in stampi piatti di incorporamento e riempire con resina (A, B, C e D). Le etichette di carta per i campioni possono essere aggiunte ai pozze in questo momento.</li>
	<li>Polimerizzare in forno a 60 gradi centigradi per 24-36 h. NOTA: il protocollo può essere sospeso dopo la polimerizzazione.</li>
	<li>Rimuovere i blocchi dallo stampo e lasciare raffreddare. Per rimuovere il supporto della membrana, posizionare prima il campione nel mandrino verticale dell'ultramicrotoma dove può essere visualizzato con ingrandimento. Separare il supporto della membrana dal blocco da una combinazione di azoto liquido dabbing sul supporto della membrana per separare il metallo dalla plastica, e utilizzando una lama di rasoio per scheggiare la resina intorno al supporto della membrana. Una volta separato, sollevare delicatamente il supporto della membrana lasciando la cupola di pellet cellulare sulla faccia del blocco.</li>
	<li>Posizionare il blocco con il pellet della cella esposta rivolto verso l'alto in uno stampo di incorporamento piatto leggermente più profondo del primo stampo e riempire con resina. Polimerizzare a 60 gradi centigradi per 24-36 h. NOTA: il protocollo può essere sospeso dopo la polimerizzazione.</li>
</ol>6. Sezionamento
<ol><li>Tagliare il blocco intorno al pellet della cella utilizzando una lama di rasoio. Quindi posizionare il blocco nel mandrino campione sul braccio di sezionamento di un ultramicrotoma. Utilizzando un coltello di vetro o diamante, tagliare il blocco in una forma trapezoidale che circonda da vicino il pellet cellulare.</li>
	<li>Ottenere 90 nm sezioni ultrasottili del pellet cellulare utilizzando un coltello di vetro o diamante.</li>
	<li>Raccogliere una barra multifunzione di sezioni in una griglia TEM. Le griglie in rame rivestite in forma di formvar (1 x 2 mm2 slot) sono utili per l'imaging di sezioni seriali. Asciugare la griglia scando il bordo su un pezzo di carta da filtro e conservarla in una scatola di memorizzazione della griglia TEM. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa dopo la sezionamento.</li>
</ol>7. Immagini TEM
<ol><li>Montare la griglia sul supporto TEM e posizionarla al microscopio. Usiamo abitualmente un Tecnai T12 a 80 kV per lo screening di campioni crioAPEX. Acquisire immagini di cellule e strutture subcellulari di interesse con l'etichettatura APEX2.</li>
	<li>Se lo si desidera, ottenere un contrasto di membrana supplementare mediante l'uso di piombo post-colorazione. Vedere la figura 2 per il confronto degli esempi non post-colorato(Figura 2I–K) e dei campioni post-colorato(Figura 2A–H).<ol>
<li>Far galleggiare le griglie asciutte sezionate su una goccia di soluzione di cloruro disuso (1,5 mM), 2 volte per 1 min ciascuna, quindi 1x per 10 min.</li>
		<li>Galleggiare le griglie su una goccia della soluzione di piombo di Sato per 1 min. Lavare galleggiando sulla soluzione di cloruro di sodio 3x per 1 min, quindi su acqua DI 3x per 1 min. Blot liquido in eccesso dalle griglie e conservare in una scatola griglia. AVVISO: Il piombo è una sostanza chimica tossica e deve essere maneggiato con procedure di sicurezza adeguate e dispositivi di protezione personale. Le soluzioni contenenti piombo devono essere smaltite come rifiuti chimici pericolosi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immagine di campioni post-macchiati sul TEM. NOTA: nella preparazione tradizionale dei campioni per TEM, il passo di contrasto principale viene eseguito prima dell'imaging TEM. Tuttavia, si raccomanda che per i campioni crioAPEX, l'imaging viene eseguito per primo su campioni non con trapelato. Questo assicura che il segnale dal tag possa essere facilmente posizionato dal suo forte contrasto con le strutture cellulari più leggermente macchiate. Per molti campioni, non sarà necessaria alcuna ulteriore colorazione; tuttavia, se si desidera un ulteriore contrasto della membrana, è possibile eseguire il post-colorazione del piombo (passaggio 7.2) e il campione ri-immagine.</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Il protocollo cryoAPEX qui presentato fornisce un metodo robusto per caratterizzare la localizzazione delle proteine della membrana all'interno dell'ambiente cellulare. Non solo l'uso di un tag APEX2 geneticamente codificato fornisce una localizzazione precisa di una proteina di interesse, ma l'uso della criofissia e della disidratazione a bassa temperatura fornisce un'eccellente conservazione e colorazione dell'ultrastruttura cellulare circostante. Combinati, questi approcci sono un potente strumento per localizzare una...

Gli studi biologici spesso includono questioni di risoluzione della localizzazione delle proteine subcellulari all'interno di cellule e organelli. La microscopia a immunofluorescenza fornisce un'utile visione a bassa risoluzione della localizzazione delle proteine, e recenti progressi nell'imaging a super-risoluzione stanno spingendo i limiti di risoluzione per le proteine fluorescentimarcate 1,2,3. Tuttavia, la microscopia elettronica (EM) rimane lo standard d'oro per l'imaging dell'ultrastruttura cellulare ad alta risoluzione, anche se l'etichettatura delle proteine è una sfida.
Storicamente, diversi metodi EM sono stati utilizzati per affrontare questioni di localizzazione delle proteine ultrastrutturali. Uno dei metodi più comunemente utilizzati è la microscopia immunoelettronica (IEM), in cui gli anticorpi primari specifici dell'antigene vengono utilizzati per rilevare la proteina di interesse. Il segnale EM è generato dall'applicazione di anticorpi secondari coniugati con particelle ad alta densità di elettroni, più comunemente oro colloidale4,5. In alternativa, gli anticorpi coniugati con enzimi come la perossidasi di ravanello (HRP) possono essere utilizzati per produrre un precipitato ad alta densità di elettroni6,7,8. Esistono due approcci principali per IEM, denominati pre-incorporamento e post-incorporazione. Nel pre-incorporamento IEM, gli anticorpi vengono introdotti direttamente nelle cellule, il che richiede la fissazione della luce e la permeabilizzazione delle cellule9,10,11. Entrambi i passaggi possono danneggiarel'ultrastruttura 12,13. Lo sviluppo di anticorpi significativamente più piccoli costituiti da un frammento di Fab di corpo coniugato con 1,4 nm nanogold consente di utilizzare condizioni di permeabilizzazione molto delicate; tuttavia, il nanooro è troppo piccolo per la visualizzazione diretta in TEM e richiede ulteriori passaggi di miglioramento per diventare visibile14,15,16. Nell'IEM post-incorporamento, gli anticorpi vengono applicati su sottili sezioni di cellule che sono state completamente elaborate per fissazione, disidratazione e incorporamento in resina17. Mentre questo approccio evita la fase di permeabilizzazione, preservare l'epitopo di interesse durante la preparazione del campione è impegnativo18,19,20. Il metodo Tokuyasu di fissazione della luce seguito da congelamento, crio-sezione, e il rilevamento degli anticorpi fornisce una migliore conservazione dell'epitopo21,22. Tuttavia, i requisiti tecnici della crio-ultramicrotomia, così come il contrasto non ottimale ottenuto nella cellula, sono svantaggi23.
L'uso di tag geneticamente codificati elimina molte delle difficoltà dell'IEM legate alla rilevazione della proteina di interesse. Sono disponibili diversi tag, tra cui HRP, ferritin, ReAsH, miniSOG e metallothionein24,25,26,27,28,29,30,31,32. Ognuno di questi ha vantaggi rispetto ai metodi precedenti, ma ognuno ha anche svantaggi che impediscono l'uso diffuso. Questi inconvenienti vanno dall'inattività di HRP nel citosol alle grandi dimensioni del tag di ferritina, sensibilità alla luce di ReAsH, e piccole dimensioni e mancanza di compatibilità con la colorazione cellulare di metallothionein. Recentemente, una proteina derivata da ascorbate peroxidase è stata progettata come tag EM, chiamato APEX233,34. Come perossidasi, APEX2 può catalizzare l'ossidazione di 3,3' didiaminobenzidina (DAB), producendo un precipitato che reagisce con teossido di osmio per fornire contrasto EM locale con una diffusione minima dalla proteina di interesse (meno di 25 nm)33,35. A differenza dei metodi tradizionali basati su HRP, APEX2 è estremamente stabile e rimane attivo in tutti i compartimenti cellulari33. I campioni possono essere elaborati per TEM utilizzando la colorazione tradizionale dei campioni EM e metodi che consentono una buona visualizzazione delle strutture circostanti33,34,36. Grazie alle sue piccole dimensioni, stabilità e versatilità, APEX2 è emerso come un tag EM con un grande potenziale.
Molti degli approcci discussi in precedenza non possono essere o non sono ancora stati combinati con lo stato attuale dell'arte nella conservazione ultrastrutturale, nella criofissia e nella sostituzione del congelamento a bassa temperatura. Così, soffrono di una mancanza di conservazione della membrana e/o colorazione cellulare per determinare la localizzazione accurata delle proteine. Ciò limita necessariamente la risoluzione e l'interpretazione dei dati che possono essere ottenuti. La criofixazione mediante il congelamento ad alta pressione (HPF) comporta il congelamento rapido di campioni in azoto liquido ad alta pressione (2.100 bar), che causa la vetrificazione piuttosto che la cristallizzazione dei campioni acquosi, preservando così le cellule in uno stato quasi nativo37,38,39. L'HPF è seguita da una sostituzione di congelamento (FS), una disidratazione a bassa temperatura (-90 gradi centigradi) in acetone combinata con incubazione con le tipiche macchie EM come il tetrossido di osmio e l'acetato uranico. HPF e FS insieme offrono un netto vantaggio rispetto alla fissazione chimica tradizionale (un processo più lungo che può portare a manufatti) e alla disidratazione dell'alcol a temperatura ambiente o sul ghiaccio (che può portare all'estrazione di lipidi e zuccheri), e quindi possono combinarsi con i migliori tag EM per il rilevamento delle proteine.
Uno dei motivi per cui HPF/FS non è stato combinato con l'etichettatura APEX2 è che la fissazione chimica della luce è un prerequisito per la reazione alla perossia, limitando la diffusione del prodotto di reazione DAB. Negli studi APEX2 finora, fissazione e reazione alla perossida sono seguiti dai metodi Tradizionali EM per la colorazione e la disidratazione dell'alcol33,36. Tuttavia, è stato dimostrato che dopo la fissazione chimica con HPF/FS fornisce un netto vantaggio nella conservazione rispetto alla fissazione chimica tradizionale e alla disidratazione dell'alcool da solo40. La perdita di integrità ultrastrutturale osservata nei campioni TEM tradizionali appare meno connessa alla fissazione che alla disidratazione, che in genere avviene usando alcol a temperatura ambiente o sul ghiaccio, e può portare all'estrazione di lipidi e zuccheri40,41. Per sviluppare il metodo cryoAPEX, abbiamo ipotizzato che la fissazione chimica e la reazione perossidasi, seguite da HPF e FS, produrrebbero un risultato ottimale in termini di conservazione ultrastrutturale.
Qui presentiamo il protocollo cryoAPEX, che combina l'etichettatura APEX2 con i metodi di criofixation e di sostituzione del congelamento (Figura 1). Questo protocollo semplice consiste nella trasfezione di una proteina marcata APEX2 di interesse, fissazione chimica delle cellule e reazione alla perossida. HPF e FS vengono quindi eseguite seguite dall'incorporamento tipico della resina e dal sezionamento sottile. L'imaging TEM rivela un'eccellente conservazione dell'ultrastruttura utilizzando questo metodo. Inoltre, sono state osservate la localizzazione subcellulare ad alta risoluzione e la distribuzione spaziale di una proteina lumena endolasmica (ER). Questo metodo è ampiamente utile per rilevare la localizzazione della proteina membrana all'interno delle cellule per l'analisi della microscopia elettronica. Nelle nostre mani, il metodo ha funzionato con successo per una varietà di linee cellulari coltivate nella coltura dei tessuti, tra cui HEK-293T (rene embrionale umano), HeLa (cancro cervicale umano), Cos7 (fibroblasto renale della scimmia verde africana) e BHK (rene di criceto del bambino). Le istruzioni dettagliate sono descritte di seguito utilizzando le cellule HEK-293T.

<table><tbody><tr><td>3,3'-Diaminobenzidina tetracloridrato idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Acetone (Distillato di vetro)</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze 10016</td><td></td></tr><tr><td>Becher; Plastica, monouso 120 cc</td><td>Microscopia elettronica</td> Sciences <td>60952</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di conservazione criogenica, 2 mL</td><td>VWR</td><td>82050-168</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, resina epossidica monocomponente A, M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44611-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomponente B, indurente 964</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomponente C, acceleratore 960 (DY 060)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44613-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomponente D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44614-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Stampo per inclusione, piatto standard, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>Stampo per inclusione, piatto standard, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino; Nu-Serum IV Growth Medium Supplement</td><td>Corning</td><td>355104</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knife Boats, 6,4 mm</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>71008</td><td></td></tr><tr><td>Glass Knifemaker</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM KMR3</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide 10% Soluzione acquosa</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Sciences 16120</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293 Celle</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Congelatore ad alta pressione con sistema di trasferimento rapido</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM PACT2</td><td>Prodotto archiviato sostituito da Leica EM ICE</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno 30%</td> Soluzione <td>Fisher Scientific</td><td>50-266-27</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 3000 Reagente di trasfezione</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific Supporto membrana per EM PACT2, 1,5 mm x 0,1 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16707898</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio, cristallino</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 20X, grado ultra puro</td><td>VWR</td><td>97062-950</td><td></td></tr><tr><td>Capsule in plastica per AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16702738</td><td></td></tr><tr><td>Griglie a fessura, 2 x 1 mm in rame con pellicola di supporto Formvar</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>FF2010-Cu</td><td></td></tr><tr><td>tampone di cacodilato di sodio, 0,2 m, pH 7,4</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>102090-962</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio, pellet 500 g (ACS)</td><td>Avantor Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr>Scienze della <td>microscopia elettronica</td><td>dell'acido tannico</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali, polistirene, sterile, Corning, 100 mm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Strisce di</td> <td>coltelli in vetro ultraScienze della microscopia elettronica</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile diidrato</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

il metodo cryoapex per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Gli eventi cellulari chiave come la trasduzione del segnale e il traffico di membrana si basano sulla corretta posizione delle proteine all'interno dei compartimenti cellulari. Comprendere con precisione la localizzazione subcellulare delle proteine è quindi importante per rispondere a molte domande biologiche. La ricerca di un'etichetta robusta per identificare la localizzazione delle proteine combinata con un'adeguata conservazione cellulare e colorazione è stata storicamente impegnativa. I recenti progressi nell'imaging della microscopia elettronica (EM) hanno portato allo sviluppo di molti metodi e strategie per aumentare la conservazione cellulare ed etichettare le proteine bersaglio. Un tag genetico relativamente nuovo basato sulla perossidasi, APEX2, è un leader promettente nei tag eM-active clonabili. La preparazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è avanzata anche negli ultimi anni con l'avvento della criofissia mediante congelamento ad alta pressione (HPF) e disidratazione e colorazione a bassa temperatura tramite sostituzione del congelamento (FS). HPF e FS forniscono un'eccellente conservazione dell'ultrastruttura cellulare per l'imaging TEM, secondo solo per la crio-imaging diretto di campioni vitrei. Qui presentiamo un protocollo per il metodo cryoAPEX, che combina l'uso del tag APEX2 con HPF e FS. In questo protocollo, una proteina di interesse è contrassegnata con APEX2, seguita da fissazione chimica e reazione alla perossida. Al posto della colorazione tradizionale e della disidratazione dell'alcool a temperatura ambiente, il campione viene criofatto e subisce disidratazione e colorazione a bassa temperatura tramite FS. Utilizzando cryoAPEX, non solo è possibile identificare una proteina di interesse all'interno dei compartimenti subcellulari, ma anche informazioni aggiuntive possono essere risolte rispetto alla sua topologia all'interno di una membrana strutturalmente conservata. Dimostriamo che questo metodo può fornire una risoluzione sufficientemente elevata da decifrare i modelli di distribuzione delle proteine all'interno di un lume di organello e distinguere la compartimentazione di una proteina all'interno di un organello in prossimità di altri organelli non etichettati. Inoltre, crioAPEX è proceduralmente semplice e suscettibile alle cellule coltivate nella coltura tissutale. Non è più impegnativo dal punto di vista tecnico rispetto ai tipici metodi di criofissazione e sostituzione del congelamento. CryoAPEX è ampiamente applicabile per l'analisi TEM di qualsiasi proteina di membrana che può essere etichettata geneticamente.

Al fine di confrontare la conservazione ultrastrutturale utilizzando il metodo crioAPEX con la fissazione tradizionale e la disidratazione, abbiamo preparato campioni in cui una membrana del reticolo endolasmico (ERM; il peptide ER membrana) è stato etichettato con APEX2 e trasvenuto nelle cellule HEK-293T. ERM-APEX2 localizza la faccia citoplasmica del ER e rimodella la struttura ER in strutture morfologicamente distinte conosciute come organizzato liscio ER (OSER)34,...

Questo protocollo descrive il metodo cryoAPEX, in cui una proteina della membrana marcata APEX2 può essere localizzata mediante microscopia elettronica di trasmissione all'interno di ultrastruttura cellulare conservata in modo ottimale.

Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Questo metodo combina la capacità di macchiare una proteina di membrana preservando al contempo l'integrità della membrana e l'architettura subcellulare. Quindi è molto potente per localizzare con precisione una proteina associata alla membrana. Il principale vantaggio di questa tecnica è che combina l'uso di una robusta etichetta geneticamente clonabile, APEX2, con metodi all'avanguardia nella conservazione cellulare per la microscopia elettronica, inclusa la criofissazione e la sostituzione del congelamento.Insieme, questi consentono una localizzazione precisa delle proteine all'interno di una cellula ben conservata. Questo protocollo può essere utilizzato per sezionare meccanismi mediante i quali i virus si replicano all'interno della cella host. I virus spesso dirottano le proteine ospiti durante il loro schema di infezione.I virus sono i piccoli genomi, che usano per replicarsi all'interno di queste cellule ospiti. Recentemente, siamo stati in grado di etichettare queste proteine in dati inediti usando questa tecnologia per capire come i virus si replicano. Questa tecnica si è rivelata davvero critica in un recente studio collaborativo su una tossina batterica che causa la rot

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Fonte: Schönherr, S., et. al. Immunomarcatura combinata optogenetica e replica di frattura da congelamento per esaminare la disposizione specifica dell'input dei recettori del glutammato nell'amigdala di topo. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra l'immunomarcatura di repliche fratturate da congelamento di tessuto cerebrale di topo per la microscopia elettronica. Le repliche fratturate e rivestite vengono digerite per esporre i recettori. Gli anticorpi primari e secondari marcati con oro...

Immunomarcatura delle proteine della membrana neuronale in un campione di tessuto cerebrale di topo con frattura da congelamento

Per conservare processi neuronali per l'analisi ultrastrutturale, si descrive un protocollo per la placcatura di neuroni primari su Electron griglie microscopia seguite da congelamento flash, ottenendo campioni sospesi in uno strato di ghiaccio vitreo. Questi campioni possono essere esaminate con un microscopio crio-elettroni per visualizzare le strutture in scala nanometrica.

Preparazione di primaria neuroni per visualizzare neuriti in uno Stato Frozen-idratata Utilizzo Cryo-Electron Positron

Qui descriviamo una procedura per studiare i tessuti vegetali fratturati da congelamento. I campioni di foglie congelate ad alta pressione sono fratturati a freddo e rivestiti a doppio strato, producendo campioni congelati e idrati ben conservati che vengono riprodotti utilizzando il microscopio elettronico a crioscansione ad alti ingrandimenti con danni minimi al fascio.

Studiando l&#39;organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all&#39;interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione

Questo manoscritto descrive un metodo facile da usare e cryofixation basso costo per la visualizzazione cellule in sospensione mediante microscopia elettronica a trasmissione.

Plunge congelamento: uno strumento per l&#39;ultrastrutturali e Immunolocalizzazione Studi di cellule in sospensione in microscopia elettronica a trasmissione

Qui, forniamo un semplice, a basso costo, e in tempi rapidi protocollo fissiamo chimicamente tessuto cerebrale dei primati con acroleina fissativo, consentendo per la conservazione a lungo termine che è compatibile con pre-embedding immunoistochimica per microscopia elettronica a trasmissione.

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di microscopia elettronica, "flash-e-congelamento" che permette la visualizzazione di dinamica della membrana con ms risoluzione temporale. Questa tecnica combina la stimolazione optogenetic di neuroni con alta pressione di congelamento. Qui, dimostriamo le procedure e descrivere i protocolli in dettaglio.

Flash-e-Freeze: una tecnica innovativa per l&#39;acquisizione di membrana Dynamics con microscopia elettronica

Un metodo di microscopia luce correlativa (CLEM) viene applicato alle strutture intracellulari indotte da virus immagine tramite microscopia elettronica (EM) in cellule che sono già stati scelti da microscopia chiara (LM). LM ed EM sono combinati in un approccio di imaging ibrido per ottenere una visione integrata delle interazioni virus-ospite.

Microscopia a luce correlativa (CLEM) per il monitoraggio e la proteina virale di Imaging strutture in cellule di Cryo-immobilizzata associate

Qui è presentato un protocollo per etichettare le proteine della membrana nelle cellule dei mammiferi e rivestire il campione con grafene per la microscopia elettronica a trasmissione a scansione in fase liquida. La stabilità dei campioni contro i danni causati dalle radiazioni può anche essere studiata con questo protocollo.

Involucro di grafene di cellule di mammiferi fissate chimicamente per la microscopia elettronica a fase liquida

Questo protocollo dimostra come immaginare campioni biologici crio-conservati utilizzando la microscopia a illuminazione criostrutto. Dimostriamo la metodologia mediante l'imaging del citoscheletro delle cellule U2OS.

Raccolta di dati microscopici di illuminazione criostruzionata da cellule conservate criogenicamente

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dirigere l'adesione e la crescita cellulare verso aree mirate di griglie per la crio-microscopia elettronica. Ciò si ottiene applicando uno strato antivegetativo che viene ablato in modelli specificati dall'utente seguito dalla deposizione di proteine della matrice extracellulare nelle aree modellate prima della semina cellulare.

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Griglie per dirigere il posizionamento delle cellule all'interno dei flussi di lavoro della tomografia crioelettronica a cellule intere

Questo flusso di lavoro consente la produzione di lamelle mirate a strutture biologiche marcate in fluorescenza che sono piccole (&lt;1 μm di estensione assiale) e rare (1 copia per cellula) utilizzando una piattaforma di imaging criogenica tri-coincidente. Questa piattaforma integra la microscopia a fluorescenza, la fresatura a fascio ionico focalizzato e la microscopia elettronica a scansione in un'unica posizione focale e consente la microscopia a fluorescenza simultanea durante la fresatura.

Flusso di lavoro con un microscopio criogenico a fluorescenza coincidente, a fascio di elettroni e ioni per la fresatura mirata delle cellule

Impara il metodo cryoAPEX per localizzare proteine di membrana con microscopia elettronica preservando l'ultrastruttura cellulare. Questa tecnica avanzata utilizza il tag APEX2 e cellule HEK293 per studiare i meccanismi di replicazione virale.

Il metodo CryoAPEX per lanalisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana allinterno delle cellule ultrastrutturalizzate (Video) | JoVE Journal

Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

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