Rilevamento di specie di ossigeno reattive totali nelle cellule aderenti entro il 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate
23 giugno 2020
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare le specie di ossigeno reattivo totale (ROS) utilizzando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Questo metodo può visualizzare la localizzazione cellulare ROS in cellule aderenti con un microscopio a fluorescenza e quantificare l'intensità ROS con un lettore di lastre di fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente e conveniente.
Questo metodo può essere utilizzato per analizzare le specie di ossigeno reattivo cellulare nelle cellule aderenti con solo un microscopio a fluorescenza e quantificare l'intensità reattiva delle specie di ossigeno con il lettore di piastre a fluorescenza. Questo protocollo è semplice, efficiente ed economico. Inizia seminando due volte 10 alla quinta cellule tumorali colorettali HCT116 in DMEM in ogni pozzo di una piastra da 24 porri.
Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, sostituire il mezzo di coltura con 100 solfato ferroso micromolare, o 10 mezzo contenente doxorubicina micromolare, e incubare la piastra per altre 24 ore. Preparare la soluzione DCFH-DA sciogliendo 4,85 milligrammi di DCFH-DA in un millilitro di DMSO per fare una soluzione di 10 millimolare.
Poco prima di aggiungerlo ai pozzi, diluire il materiale con DMEM preri riscaldato per creare una soluzione di lavoro da 10 micromolari e vortice per 10 secondi. Per macchiare le cellule, rimuovere il mezzo contenente farmaci e lavarle una volta con DMEM. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lavoro DCFH-DA in ogni pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Dopo l'incubazione, rimuovere il DCFH-DA dai pozzi e lavarli due volte con DMEM e una volta con PBS. Quindi, aggiungere 500 microlitri di PBS ad ogni pozzo. Utilizzare il canale proteico fluorescente verde sul microscopio a fluorescenza per scattare immagini rappresentative delle cellule.
Quindi rimuovere il PBS e aggiungere 200 microlitri di tampone di dosaggio di radioimmunoprecipitazione a ciascun pozzo. Incubare la piastra sul ghiaccio per cinque minuti e raccogliere i liscivi cellulari in tubi da 1,5 millilitri. Centrifugare i tubi a 21, 130 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi trasferire 100 microlitri del supernatante su una piastra nera da 96 porri. Usa un lettore di micropiastrite ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nanometri, per misurare la fluorescenza in ogni pozzo. Successivamente, misurare la concentrazione proteica con il saggio di Bradford trasferendo un microlitro del supernatante in una piastra chiara da 96 pozzetti con 100 microlitri di soluzione di dosaggio proteico.
Utilizzare le concentrazioni proteiche per normalizzare le intensità di fluorescenza. Le cellule tumorali colorettali HCT116 sono state trattate con 100 solfati ferrosi micromolari, o 10 doxorubicina micromolare, per indurre stress ossidativo. Come previsto, la fluorescenza verde è stata drasticamente aumentata da entrambi i trattamenti.
Per quantificare i cambiamenti di intensità relativa, le cellule sono state lese e normalizzate con concentrazioni proteiche. L'intensità relativa della fluorescenza è stata significativamente aumentata dal solfato ferroso o dalla doxorubicina. Quando si esegue questa procedura, è importante rendere fresca la soluzione DCFH-DA ed evitare l'esposizione alla luce, nonché ridurre al minimo i disturbi dello stato delle cellule ed eseguire un ampio lavaggio PBS subito prima di scattare l'immagine.
Oltre al rilevamento del ROS totale da parte di questo protocollo, è possibile eseguire specificamente ROS come il perossido.
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Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) totali a livello cellulare mediante l'utilizzo di DCFH-DA. Il metodo consente la visualizzazione della localizzazione delle ROS in cellule aderenti e la quantificazione dell'intensità delle ROS.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Cellulare
- Analisi delle Specie Reattive dell'Ossigeno
- Microscopia a Fluorescenza
Sfondo
- Le specie reattive dell'ossigeno svolgono un ruolo fondamentale nella segnalazione cellulare.
- Comprendere la localizzazione delle ROS può fornire informazioni sui processi cellulari.
- Le tecniche di fluorescenza sono comunemente utilizzate per la rilevazione delle ROS.
- Questo protocollo è stato progettato per essere facile da usare ed economico.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) in cellule aderenti.
- Permettere la visualizzazione e la quantificazione delle ROS mediante microscopia a fluorescenza.
- Semplificare il procedimento per i ricercatori del settore.
Metodi Utilizzati
- Piastrellatura di cellule tumorali colorettali HCT116 in una piastra a 24 pozzetti.
- Incubazione delle cellule con solfato ferroso o doxorubicina.
- Preparazione della soluzione DCFH-DA per la rilevazione delle ROS.
- Utilizzo della microscopia a fluorescenza e del lettore di piastre per l'analisi.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita della localizzazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule.
- La quantificazione dell'intensità delle ROS ha dimostrato l'efficacia del metodo.
- Il protocollo si è rivelato semplice ed efficiente per i ricercatori.
- Approccio economico per l'analisi delle ROS nello studio cellulare.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un metodo semplice per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno.
- Può essere applicato a diversi tipi di cellule aderenti.
- Studi futuri possono basarsi su questo metodo per ottenere approfondimenti più dettagliati sui meccanismi cellulari.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il rilevamento quantitativo delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) totali in cellule aderenti mediante colorazione con DCFH-DA fornisce un parametro standardizzato dello stress ossidativo, un fattore chiave negli studi di modellizzazione delle malattie e di risposta ai farmaci. Questo metodo consente una valutazione affidabile dello stato redox cellulare a seguito di perturbazioni chimiche o genetiche, supportando l'identificazione dei meccanismi d'azione e la validazione dei bersagli nelle fasi iniziali della scoperta. La sua economicità e scalabilità lo rendono adatto all'integrazione in flussi di lavoro ad alto rendimento e traslazionali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi quantitativa dei percorsi dello stress ossidativo in modelli cellulari rilevanti per le malattie.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli che modulano l'equilibrio redox cellulare.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico collegando interventi farmacologici o genetici all'output di ROS.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un saggio riproducibile basato sulla fluorescenza per la quantificazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) in cellule aderenti.
- Permette la standardizzazione e la normalizzazione del saggio mediante la misurazione della concentrazione proteica.
- Consente una valutazione affidabile dello stress ossidativo indotto da composti chimici in campagne di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Correla i parametri dello stress ossidativo con modelli di malattia per lo sviluppo traslazionale di biomarcatori.
- Permette una continuità dalla scoperta in vitro alla validazione preclinica di agenti modulatori del redox.
- Offre un valore predittivo per la sicurezza e l'efficacia dei composti in relazione ai meccanismi ossidativi.
Pipeline e integrazione del flusso di lavoro
Questo protocollo di rilevamento delle ROS basato su DCFH-DA rientra nel percorso che va dalla scoperta iniziale all'identificazione del composto guida, fornendo un'uscita quantitativa per la modulazione dello stress ossidativo nei sistemi cellulari.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi su bersagli e percorsi legati al redox.
- Screening: Fornisce misurazioni quantitative standardizzate di ROS per il triage dei composti.
- Analisi: Integra la normalizzazione dell'intensità di fluorescenza per un confronto robusto dei dati.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati dello stress ossidativo in vitro alla validazione nei modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Offre un saggio ampiamente applicabile ed economico per diversi tipi cellulari e interventi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella biologia redox e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Ottimizza la quantificazione delle specie reattive dell'ossigeno con flussi di lavoro scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione collegando gli interventi agli esiti dello stress ossidativo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione adeguata al rischio di asset che modulano il redox.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a fluorescenza e nell'utilizzo di lettori di piastre.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture standard per la coltura cellulare e la quantificazione delle proteine.
- Richiede una manipolazione accurata del reagente DCFH-DA per evitare il degrado indotto dalla luce.
- La standardizzazione dei passaggi di lavaggio e di normalizzazione è fondamentale per la riproducibilità.
- Il protocollo è adattabile a diverse linee cellulari aderenti, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione per modelli specifici.
