Protocollo di dosing stepwise per aumentare la velocità effettiva nei dati GPCR basati su impeditto per etichetta

Questo protocollo consente la registrazione di una relazione completa di risposta alla concentrazione funzionale dell'agonista GPCR da una popolazione cellulare e fornisce una caratterizzazione agonista dettagliata anche per numeri di campione a celle basse. Il principale vantaggio del dosing seriale è l'aumento della produttività poiché un singolo pozzo è sufficiente per un'analisi completa della risposta alla concentrazione. Questa tecnica è adatta per studiare la trasduzione singola in modelli biologici rari e complessi, come i formati organ-on-chip in contenitori microfluidici chiusi.

Il protocollo non è difficile da eseguire, a condizione che sia disponibile l'attrezzatura appropriata. Preparare le varie soluzioni di ligando GPCR alla giusta concentrazione è la chiave del successo. Michael Skiba, una studentessa laureata, e Anne Mildner, una studentessa universitaria, del nostro laboratorio dimostreranno la procedura.

Per la semina cellulare sugli array di elettrodi, aggiungere la concentrazione appropriata di cellule ai pozzi di ogni array di elettrodi e consentire alle celle di depositarsi in modo omogeneo sui fondi del pozzo per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Dopo almeno 36 ore in un incubatore di coltura cellulare standard a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, ispezionare gli strati cellulari mediante microscopia a contrasto di fase per garantire una copertura completa di ogni elettrodo con cellule. Quindi sostituire il mezzo di coltura cellulare in ogni pozzo con il volume appropriato di mezzo pre-riscaldato e privo di siero.

Per avviare una registrazione di impedenza, posizionare l'array di elettrodi nel supporto dell'array di collegamento dell'analizzatore di impedenza e confermare un corretto contatto a bassa impedenza tra gli elettrodi e l'analizzatore di impedenza. Selezionare il tipo di elettrodo e/o il formato multi-pozzo nell'interfaccia utente del software. Se sono disponibili modalità di acquisizione dati a frequenza singola e multipla e il numero di pozzi da analizzare è basso o la risoluzione del tempo non è critica, selezionare registrazioni a più frequenze.

Per garantire una risoluzione del tempo massima, selezionare una singola frequenza di monitoraggio. Quindi iniziare l'acquisizione dei dati del corso di tempo e selezionare la cartella dei dati per dove salvare i dati. Le letture di impedenza verranno registrate al numero specificato di frequenze per ogni pozzo Per avviare il protocollo di addizione seriale in modalità agonista per un array di otto pozzi, aggiungere 30 microlitri della concentrazione più bassa dell'agonista di interesse alle celle.

Quindi lasciare che le cellule rispondano ed equilibrano per il periodo di tempo predefinito prima di aggiungere 30 microlitri della successiva concentrazione più alta fino a quando non è stata aggiunta ogni diluizione seriale dell'agonista. Per analizzare i dati, sottrarre l'impedenza dell'ultimo punto dati prima della prima aggiunta della soluzione agonista e impostare il tempo di aggiunta zero per normalizzare i valori di impedenza. Traccia il corso di tempo dell'impedenza normalizzata e traccia i singoli corsi di tempo per identificare i massimi in impedenza dopo ogni fase di addizione.

Comporre una scheda dati con questi valori e tracciare i valori della variazione di impedenza massima in funzione della concentrazione agonista. Utilizzare quindi una routine di adattamento dati per determinare le concentrazioni effettive semi-massime e la massima risposta utilizzando il modello logistico a quattro parametri. In questo esperimento rappresentativo, 10 soluzioni con concentrazioni crescenti di istamina sono state aggiunte sequenzialmente alle cellule ogni 15 minuti e il cambiamento di impedenza è stato misurato in ogni momento.

I cambiamenti di impedenza potrebbero quindi essere tracciati in funzione della concentrazione di istamina e della funzione di trasferimento di un modello logistico a quattro parametri montato sui punti dati sperimentali da sette pozzi. Per tenere conto di possibili downregolazioni del recettore dell'istamina, desensibilizzazione cellulare o sovrastimolazione, l'intervallo di dati per l'analisi può essere ridotto, come mostrato per questo singolo esperimento di dosing seriale. L'ottimizzazione a tre parametri può quindi essere applicata ai dati, fornendo una concentrazione effettiva semi-massima di 0,75 più o meno 0,12 micromolare per questa analisi.

L'aggiunta della difenidramina antagonista del recettore dell'istamina 20 minuti prima della prima istamina provoca un aumento ritardato dell'impedenza all'interno dello schema di dosazione seriale, corrispondente alla necessità per un agonista più alto di ottenere una risposta cellulare. Nella relazione di risposta alla dose, l'effetto dell'antagonista è espresso come uno spostamento verso destra delle curve, corrispondente ad un aumento della concentrazione effettiva semi-massima, a condizione che l'antagonista sia un ligando competitivo rispetto all'agonista. L'applicazione riuscita dello schema di dosing seriale è tecnicamente semplice, ma richiede una pianificazione ponderata, in quanto è difficile eseguire tutti i passaggi con la tempistica corretta.

Il dosing seriale ha spianato la strada all'esecuzione di studi di risposta alla concentrazione con altri sistemi di lettura limitati rispetto al numero di campioni monitorati in parallelo. I particolari vantaggi del dosing seriale consentono lo studio della trasduzione del segnale mediata dal recettore con letture completamente nuove che sono sensibili ad altri cambiamenti fenotipici, come la citomeccanica. Si prega di indossare guanti e occhiali quando si preparano le soluzioni stock dell'agonista del recettore, in quanto potrebbero essere pericolosi quando inalati o inghiottiti.