Name: Analisi del consumo di ossigeno dellisola pancreatica del primate non umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Scopri come misurare il consumo di ossigeno nelle isole pancreatiche di primati non umani per valutare la funzione mitocondriale. Questo metodo consente analisi accurate con piccoli campioni biologici.

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Gli autori desiderano riconoscere il Vanderbilt High Throughput Screening Core per l'uso delle loro strutture, Agilent Biotechnologies, Dr. Paul Kievit (Oregon Health and Science University) per isolazioni di isolotti di primati non umani, e Eric Donahue (Vanderbilt University) per l'assistenza con Figura 1. J.M.E. è stato sostenuto dal NIGMS del National Institutes of Health con il numero di premio T32GM007347. M.G. è stato supportato dal NIH/NIDDK (R24DK090964-06) e dal Department of Veterans Affairs (BX003744).

1. Preparazione della cartuccia di micropiastra e sensore il giorno prima dell'esecuzione del saggio
Le isole sono state isolate dai macachi giapponesi di tre anni, come descritto in precedenza13. Questo metodo è molto simile a quello utilizzato per isolare le isole umane dai donatori di cadaveri, ma differisce dai topi, in cui la pancreata è spesso gonfiata con soluzione di collagenasi mentre l'animale è sotto sedazione e prima della rimozione dell'organo. Il recupero dell'Islet è stato condotto in conformità con le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Oregon National Primate Research Center (ONPRC) e dell'Oregon Health and Science University e sono stati approvati dall'ONPRC IACUC. L'ONPRC rispetta l'Animal Welfare Act e i regolamenti applicati dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) e dalla politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dai National Institutes of Health.
<ol><li>Preparazione della microplacca Spheroid<ol>
<li>Preparare 3 mL di una soluzione di 0,1 M di bicarbonato di sodio. Filtro sterilizzare la soluzione. Abbiamo utilizzato un filtro da 0,45 m (Tabella dei Materiali).</li>
		<li>In una cappa cellulare, aggiungere 200 - L di adesivo per cellule e tessuti (Tabella dei materiali) a 2,8 mL di bicarbonato di sodio 0,1M. Quindi, aggiungere 20 l di questa soluzione sul fondo di ogni pozzetto della micropiastra sferoide 96-well (Tabella dei materiali). Assicurarsi che le bolle d'aria vengano rimosse dalla punta del tubo e che solo il fondo della piastra sia coperto. Il rivestimento della micropiastra impedisce alle isole di spostarsi verso l'alto sui lati dei pozzetti quando i farmaci vengono aggiunti e mescolati nel pozzo durante il saggio. NOTA: È necessario rivestire solo come molti pozzi come verrà utilizzato per le isolotti quando il saggio è eseguito. Se verranno utilizzati solo pochi pozzi, la soluzione adesiva cellulare può essere ridimensionata in modo appropriato. L'adesivo cellulare utilizzato nel saggio è una soluzione proteica formulata estratta dalla cozza marina. In alternativa, i pozze a micropiastra possono essere rivestiti con 20 .L di 100 g/mL poli-D-lisina.</li>
		<li>Incubare la piastra in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, nonCO2, per un'ora.</li>
		<li>In un ambiente sterile, la soluzione adesiva a cellule aspirati dalla piastra. Lavare ogni pozzo due volte con 400 gradi l di 37 gradi centigradi di acqua sterile utilizzando un pipet multicanale. Lasciare asciugare all'aria.</li>
		<li>Dopo 30-40 minuti, coprire la piastra e conservare pernottamento a 4 gradi centigradi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Idratazione della cartuccia sensore<ol>
<li>In un ambiente sterile, aprire il pacchetto cartuccia sensore (Tabella dei materiali) e rimuovere il contenuto. Posizionare la cartuccia del sensore a testa in giù accanto alla piastra di utilità.</li>
		<li>Riempire ogni pozzetto della piastra di utilità con acqua sterile di 200 gradi e abbassare la cartuccia del sensore nella piastra di utilità. Posizionare la cartuccia e la piastra di utilità del sensore assemblate in un'incubatrice di 37 gradi centigradi e non CO2 durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di Calibrant<ol>
<li>Aliquota 25 mL di calibro (Tabella dei Materiali) in un tubo conico da 50 mL. Mettere il tubo in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, non CO2 durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Protocollo per la preparazione dei supporti, il caricamento delle isole e il caricamento della cartuccia sensore il giorno del saggio
<ol><li>Preparazione dei mezzi di comunicazione<ol>
<li>A 48,5 mL di supporti di base (DMEM minimo, vedere Tabella dei materiali),aggiungere 500 litri ciascuno di 1 mM di piradino di sodio e 2 mM di glutammina. Inoltre, aggiungere 496 l di 200 mg/ml di glucosio (concentrazione finale di glucosio nei media è 5,5 mM). NOTA: La concentrazione di glucosio al basale è stata mantenuta costante per questi esperimenti. Tuttavia, il glucosio può anche essere utilizzato per stimolare la respirazione in aggiunta alle manipolazioni farmacologiche descritte colpo10.</li>
		<li>Confermare che il pH è 7,4 s/- 0,1, regolando se necessario.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della cartuccia del sensore<ol>
<li>Estrarre la cartuccia del sensore dall'incubatrice, rimuovere il coperchio della cartuccia del sensore e scaricare l'acqua dai pozzetti. Inserire 200 mL di calibro preriscaldato in ogni pozzo e sostituire il coperchio della cartuccia del sensore.</li>
		<li>Posizionare la cartuccia del sensore nell'incubatrice per circa 1 ora (fino a quando necessario).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di farmaci per il saggio sullo stress mitocondriale<ol>
<li>Aprire il kit di stress test (Sommario dei materiali) e rimuovere il contenuto. Make up stock e soluzioni di lavoro per Oligomycin, Carboniyl cianide-4(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), e Rotenone/Antimycin A (AA) come segue.<ol>
<li>Oligomicina: aggiungere 630 l di supporti assemblati al tubo per fare un brodo di 100 M. Quindi, diluire a 45 M con i supporti per ottenere la concentrazione del porto (la concentrazione finale del pozzo dopo l'iniezione sarà 4,5 M)</li>
			<li>FCCP: aggiungere 720 l di supporti assemblati al tubo per fare un brodo di 100 M. Diluire a 10 M con supporti per ottenere la concentrazione del porto (la concentrazione finale del pozzo sarà di 1 M) NOTA: BSA e/o FBS non devono essere aggiunti ai supporti, in quanto ciò può influire sull'azione delle disaccoppiatori mitocondriali14.</li>
			<li>Rotenone/AA: aggiungere 540 -L di supporti assemblati al tubo per fare un brodo 50 M. Diluire a 25 M con supporti per ottenere la concentrazione del porto (la concentrazione finale del pozzo sarà di 2,5 M) NOTA: Le concentrazioni di cui sopra hanno prodotto risultati coerenti nelle nostre mani. Ulteriori FCCP non hanno portato a un ulteriore aumento della respirazione. Tuttavia, le concentrazioni di droga possono essere regolate a seconda delle dimensioni dell'isolotto, e soprattutto con isolotti di specie diverse o sferoidi non isolottidi. Per riferimento, il diametro medio di un'isolota di primati non umani è di circa 150 m15.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della piastra sferoide e trasferimento di isse<ol>
<li>Isolottie pancreatici a selezione a mano in un piatto di coltura cellulare da 60 mm x 15 mm contenente supporti assemblati per ottenere una purezza vicina al 100%. NOTA: Le isole dovrebbero apparire arrotondate, con una periferia chiaramente definita, e apparire più dense dei contaminanti del tessuto esocrino. Evitare isolotti che appaiono danneggiati o sfilacciati. In questo esperimento, le dimensioni dell'isolotto non sono state misurate direttamente, anche se abbiamo tentato di raccogliere isole di dimensioni approssimativamente equivalenti per ogni pozzo e campione.</li>
		<li>Caricare ogni pozzetto di microplacca sferoide con 175 litri di supporti assemblati utilizzando una pipetta multicanale.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta P20 impostata su 15 l, aspirare 15 isolotti da piatto di coltura cellulare. Le isolotti devono essere visibili nella punta della pipetta ad occhio nudo.</li>
		<li>Trasferire le isoc in micropiastra sferoide, abbassare la punta della pipetta sul fondo del pozzo, sollevare a malapena e lentamente pipetta fuori un volume molto piccolo (5 dollari l). Verificare che tutti gli isolotti abbiano lasciato la punta della pipetta. Ogni pozzo dovrebbe ricevere 15 isolotti. Occasionalmente controllare la microplacca sferoide al microscopio per verificare che le isolette si trovino nella parte inferiore di ogni pozzo piuttosto che attaccate ai lati. NOTA: Evitare di caricare i pozzi d'angolo con isolotti. Il flusso di ossigeno e pH fuori dalla plastica può verificarsi durante il saggio, e questo è esacerbato nei quattro pozzi d'angolo.</li>
		<li>Una volta che tutte le isole sono state trasferite alla microplacca sferoide, incubare la microplacca in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, non CO2, mentre si completano le fasi riportate di seguito.</li>
	</ol></li>
	<li>Caricare la cartuccia del sensore ed eseguire il saggio<ol>
<li>Rimuovere la cartuccia del sensore dall'incubatrice. Le porte A-C per ogni pozzo devono essere caricate con farmaci o supporti. Pozzi contenenti isolotti e i quattro pozzi d'angolo dovrebbero essere caricati con droga. I pozzi non angolari senza isolotti devono essere caricati con supporti. La porta D può essere lasciata vuota. Porta di carico A (in alto a sinistra di ogni sensore) con 20 l di oligomycin o supporto. Porta di carico B (in alto a destra) con 22 - L di FCCP o supporto. Porta di carico C (in basso a sinistra) con 25 - L di Rotenone/AA o supporto.</li>
		<li>Programmare un test dell'analizzatore di flusso extracellulare per un periodo di respirazione di base di 30 minuti (5 cicli di mix 3 minuti, misura 3 minuti), 42 minuti di misurazione dell'oligomicina (7 cicli di mix di 3 minuti, misura 3 minuti), 30 minuti FCCP (5 cicli di mix 3 minuti, misura 3 minuti) e 30 minuti Rotenone/AA (5 cicli di mix 3 minuti, 3 minuti di misura).</li>
		<li>Eseguire il saggio e seguire le istruzioni sullo schermo per calibrare il sensore e inserire la micropiastra.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Mulder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribing+%CE%B2-cell+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcribing β-cell mitochondria in health and disease.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).</li>
<li>Maechler, P., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+signals+in+glucose-stimulated+insulin+secretion+in+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell.</a> The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).</li>
<li>Curry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Potentiation+of+Insulin+Secretion+by+the+Perfused+Rat+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas.</a> Diabetes. 19 (6), 420(1970).</li>
<li>Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Increases+Insulin+Levels+by+Stimulating+Insulin+Secretion+Without+Effect+on+Insulin+Clearance+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice.</a> Peptides. 88, 74-79 (2017).</li>
<li>Vergari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+inhibits+glucagon+release+by+SGLT2-induced+stimulation+of+somatostatin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion.</a> Nature Communications. 10 (1), 139(2019).</li>
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<li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+measurement+of+oxygen+consumption+by+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets.</a> Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).</li>
<li>Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).</li>
<li>Wikstrom, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+assay+for+islet+respiration+reveals+uncoupling+of+rodent+and+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets.</a> PLoS One. 7 (5), e33023(2012).</li>
<li>Taddeo, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+islet+respirometry+reveals+functional+diversity+within+the+islet+population+of+mice+and+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors.</a> Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).</li>
<li>Conrad, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAFB+transcription+factor+impacts+islet+alpha-cell+function+in+rodents+and+represents+a+unique+signature+of+primate+islet+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology--Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Elsakr, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Western-style+diet+affects+offspring+islet+composition+and+function+in+a+non-human+primate+model+of+maternal+over-nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition.</a> Molecular Metabolism. , (2019).</li>
<li>Soutar, M. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FBS%2FBSA+media+concentration+determines+CCCP%27s+ability+to+depolarize+mitochondria+and+activate+PINK1-PRKN+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy.</a> Autophagy. , 1-10 (2019).</li>
<li>Hirshberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Transplantation+Using+the+Nonhuman+Primate+%28Rhesus%29+Model+Predicts+That+the+Portal+Vein+Is+Superior+to+the+Celiac+Artery+as+the+Islet+Infusion+Site%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site.</a> Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Papas, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Oxygen+Consumption+Rate+%28OCR%29+Dose+Predicts+Insulin+Independence+in+Clinical+Islet+Autotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation.</a> PLoS One. 10 (8), e0134428(2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo studio del consumo di ossigeno alle isole è stato in precedenza ostacolato dalla forma sferica delle isole, dalla loro mancanza di aderenza alle superfici di coltura e dal numero di isolotti necessari per ogni pozzo. In questo protocollo, mettiamo in evidenza l'efficacia della micropiastra sferoide da 96 pozzetto per misurare il consumo di ossigeno nelle isole su un piccolo numero di isolotti e dimostriamo una tecnica per la movimentazione e il caricamento delle isole tecnicamente fattibile e che produce Risultati.</p...

Al fine di mantenere i normali livelli di glucosio nel sangue, la cellula pancreatica deve rilevare le elevazioni nel glucosio e secernere insulina di conseguenza. L'accoppiamento della secrezione di insulina con i livelli di glucosio è direttamente collegato al metabolismo del glucosio e alla produzione di ATP attraverso il fosforonte ossidativo mitocondriale. Così, i mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nell'accoppiamento stimolo-secrezione1. La valutazione della funzione mitocondriale a cellule z può rivelare difetti che portano a una compromissione della secrezione di insulina. Anche la secrezione di cellule glucagoniche è strettamente legata alla funzione mitocondriale2. Anche se le linee cellulari isolate immortalate si sono dimostrate utili per alcuni tipi di saggi, la fisiologia di queste cellule non riassume con precisione la funzione dell'isolotto intero, come dimostra la potenziazione della secrezione di insulina da glucagon3,4 e l'inibizione della secrezione glucagona da parte di insulina / somatostatina5,6 in isolotti intatti. Questo dimostra la necessità di misurare il consumo di ossigeno utilizzando isolotti interi e intatti.
Le tecniche per la misurazione della respirometria delle cellule isolli si sono evolute nel tempo, dall'uso di coloranti fluorescenti sensibili all'ossigeno7 ai sensori allo stato solido che misurano direttamente il consumo di ossigeno8. Inizialmente progettati per monostrato, cellule aderenti, sistemi di piastra di coltura cellulare comunemente utilizzati hanno dimostrato di essere inefficaci per le isole pancreatiche. Poiché le isolotti non aderiscono naturalmente ai pozzi, sono inclini ad essere spinti alla periferia della coltura e con conseguente misurazione imprecisa del consumo di ossigeno9. Per combattere questo problema, sono state sviluppate piastre specializzate a 24 pozzetti con una depressione centrale che potrebbe contenere isolotti9. Tuttavia, il sistema a piastre 24 pozzi era limitato dal gran numero di isolotti richiesti (50-80 per pozzo) e dal numero di condizioni che potevano essere testate contemporaneamente10. Il recente sviluppo di microplacche da 96 pozzetti progettate specificamente per l'analisi del flusso extracellulare negli sferoidi ha superato queste barriere, consentendo la misurazione dell'iletmetria con 20 o meno isolotti per pozzo10.
Qui, dimostriamo l'uso di questo sistema per misurare il consumo di ossigeno in isolotti dal macaco giapponese (Macaca fuscata), un modello animale con biologia simile isolotto agli esseri umani11,12. In questo protocollo vengono analizzate 15 isole di macachi per pozzo. Nelle nostre mani, 15 isole per bene prodotto un maggiore consumo di ossigeno di base rispetto a meno isole, con robusta attivazione e repressione della respirazione in risposta alla manipolazione farmacologica. Mettiamo in evidenza i passaggi per preparare il saggio, un metodo efficace per un carico coerente di isolotti al centro di ogni pozzo e sfide comuni quando si esegue questo saggio.

<table><tbody><tr><td>Piatto per colture cellulari, 60 mm X 15 mm Corning</td><td></td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo per cellule e tessuti Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica, 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td>Per soluzione di glucosio, 200 mg/ml, sterile filettato</td></tr><tr><td>Serbatoi monouso (sterili), 25 ML</td><td>Vistalab</td><td>3054-1033</td><td>per il caricamento di pipette multicanale</td></tr><tr><td>EZFlow Sterile 0,45 &; m Filtro per siringa PES, 13 mm</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>371-3115-OEM</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100x)</td></tr><tr><td>Puntali per pipette multicanale</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>94410810</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale, 15-1250 &mu; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4672100BT</td><td>Pipette</td></tr><tr><td>P20, P200 e P1000</td> consigliate <td>Eppendorf</td><td>2231000602</td><td></td></tr><tr><td>Sonda di pH</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2210-01</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 20 &; L, 200 &mu; L, 1000 &mu; L</td><td>Olympus</td><td>24-404, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Media</td><td>Agilent</td><td>103334-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>Include oligomicina, FCCP e Rotenone/Antimicina A</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analizzatore</td><td>Agilent</td><td>S7800B</td><td>Inclusa stazione di preparazione con 37 &deg; Incubatore C senza CO2</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Sferoide Fluxpak Mini</td><td>Agilent</td><td>102905-100</td><td>Include cartuccia sensore, micropiastra sferoidale e calibrante</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>100 mM (100x)</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus</td><td>SZX9</td><td></td></tr><tr><td>Siringa (sterile), 5 mL</td><td>BD</td><td>309603</td><td>Per filtrazione sterile</td></tr><tr><td>Acqua (sterile)</td><td>Sigma</td><td>W3500-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi del consumo di ossigeno dell'isola pancreatica del primate non umano

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

La misurazione del consumo di ossigeno in gruppi di sferoidi di cellule, come le isole pancreatiche ex vivo, è stata storicamente impegnativa. Dimostriamo la misurazione del consumo di ossigeno alle irate utilizzando una micropiastra da 96 pozzetto progettata per la misurazione del consumo di ossigeno negli sferoidi. In questo analisi, le microplacche sferoidi sono rivestite con un adesivo per cellule e tessuti il giorno prima del saggio. Utilizziamo un piccolo volume di soluzione adesiva per incoraggiare l'aderenza alle alteienze solo sul fondo del pozzo. Il giorno del saggio, 15 isolotti vengono caricati direttamente nella base di ogni pozzo utilizzando una tecnica che garantisce un posizionamento ottimale delle isole e una misurazione accurata del consumo di ossigeno. Vari aspetti della respirazione mitocondriale sono sondati farmacologicamente in isolotti di primati non umani, tra cui la respirazione dipendente dall'ATP, la respirazione massima e la perdita di protoni. Questo metodo consente risultati coerenti e riproducibili utilizzando solo un piccolo numero di isolotti per pozzo. Teoricamente può essere applicato a qualsiasi sferoide coltivato di dimensioni simili.

Per caricare le isole in microplacca, 15 isolotti devono essere aspirati in 15 - L di supporto, come mostrato Figura 1A. Le isole si stabiliranno naturalmente verso il fondo della punta del tubo in pochi secondi. Quindi, la punta del pipet viene abbassata sul fondo del pozzo. La punta è molto leggermente sollevata, e un piccolo volume (circa 5 ) viene convogliato insieme alle isole. Questa tecnica si traduce in un posizionamento coerente dell...

Questo protocollo dimostra la misurazione accurata e riproducibile del consumo di ossigeno nelle isole pancreatiche dei primati non umani. Le tecniche di caricamento dell'isolotto e il rivestimento della micropiastra forniscono un quadro per la misurazione efficiente della respirazione in altri tipi di sferoidi coltivati.

Analisi del consumo di ossigeno dell'isola pancreatica del primate non umano

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

Questo metodo consente la quantificazione del consumo di ossigeno da un piccolo numero di isolotti provenienti da specie rilevanti, come primati non umani e umani, consentendo la valutazione della funzione mitocondriale. Questa tecnica può essere eseguita con un piccolo numero di isolotti primari, aumentando le repliche tecniche, consentendo il test di più condizioni e migliorando il rigore e la riproducibilità del saggio. Questa tecnica valuta la salute mitocondriale, una delle principali determinazioni della funzione isolotto e della secrezione di insulina che è spesso compromessa nel diabete ed è un predittore significativo del trapianto di isolotto di successo.È essenziale assicurarsi che gli isolotti siano localizzati al centro dei pozzi dopo il trasferimento. In caso di incapacità, si vengono effettuate misurazioni incoerenti del consumo di ossigeno. A dimostrare questa procedura sarà Valerie Ricciardi, studentessa universitaria che lavora nel mio laboratorio.Il giorno prima del test, aggiungere 200 microlitri di adesivo cellulare e tissutale a 2,8 millilitri di soluzione di bicarbonato di sodio molare 0,1 e aggiungere 20 microlitri della soluzione risultante sul fondo di ogni pozzo di una micropiatta sferoide da 96 porri. Assicurarsi che eventuali bolle d'aria vengano rimosse dalla punta della pipetta. Quando tutti i pozzi sono stati caricati, posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica non di 37 gradi Celsius.Dopo un'ora, aspirare la soluzione adesiva cellulare dalla piastra all'interno di un ambiente sterile e lavare ogni bene due volte con 400 microlitri di acqua sterile di 37 gradi Celsius. Quindi lasciare asciugare i pozzi all'aria per 30-40 minuti prima di coprire la piastra per la conservazione notturna a quattro gradi Celsius. Per idratare la cartuccia del sensore, in un ambiente sterile aprire il pacchetto della cartuccia del sensore e rimuovere il contenuto.Posizionare la cartuccia del sensore capovolta accanto alla piastra di utilità e riempire ogni pozzo della piastra di utilità con 200 microlitri di acqua sterile. Una volta caricati tutti i pozzi, abbassare la cartuccia del sensore nella piastra di utilità e posizionare la cartuccia del sensore assemblata e la piastra di utilità nell'incubatore di anidride carbonica non di 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno del test, rimuovere il coperchio della cartuccia del sensore e decantare l'acqua dai pozzi della piastra di utilità.Aggiungere 200 millilitri di calibrant prebellici a ciascun pozzo e sostituire il coperchio della cartuccia del sensore. Quindi riposizionare la cartuccia del sensore nell'incubatore per circa un'ora. Per preparare gli isolotti per il trasferimento, raccogliere a mano gli isolotti in un piatto di coltura cellulare da 60 per 15 millimetri contenente mezzo assemblato fino a una purezza vicina al 100%.Una volta raccolti tutti gli isolotti, caricare ogni pozzo della micropiastrina sferoide preparata con 175 microlitri di mezzo assemblato e utilizzare una pipetta P20 impostata su 15 microlitri per aspirare 15 isolotti in 15 microlitri di mezzo dal piatto di coltura cellulare. Per seminare gli isolotti sulla micropiastrina dello sferoide, abbassare la punta della pipetta sul fondo del pozzo, sollevare a malapena la punta e erogare lentamente circa cinque microlitri di mezzo. Per caricare gli isolotti nei pozzi, lasciare che gli isolotti si sistemino nella punta della pipetta prima di rilasciarli delicatamente direttamente sopra il fondo del centro del pozzo in un piccolo volume di mezzo.Verificare che tutti gli isolotti abbiano lasciato la punta della pipetta, occasionalmente controllando la micropiastra sferoide al microscopio per verificare che gli isolotti siano seminati nella parte inferiore della piastra e non attaccati ai lati dei pozzi. Quando tutti gli isolotti sono stati trasferiti, posizionare la micropiastrina nell'incubatore di anidride carbonica non di 37 gradi Celsius. Prima di avviare la procedura di dosaggio, caricare la porta A della cartuccia del sensore con 20 microlitri di oligomicina micromolare appena preparata, la porta B con 22 microlitri di FCCP a 10 micromolari appena preparati e la porta C con 25 microlitri di rotenone AA a 25 micromolari appena preparati. Successivamente, programmare un test dell'analizzatore di flusso extracellulare per un periodo di respirazione di base di 30 minuti, un periodo di misurazione dell'oligomicina di 42 minuti, un periodo FCCP di 30 minuti e un periodo AA rotenone di 30 minuti.Quindi eseguire il saggio seguendo le istruzioni sullo schermo per calibrare il sensore e inserire la micropiatta. Per la consegna dell'isolotto alla piastra di dosaggio, 15 isolotti devono essere aspirati in 15 microlitri di mezzo come illustrato. Questa tecnica si tradurrà nel posizionamento coerente degli isolotti al centro inferiore di ogni micropiastrina, consentendo accurate misurazioni del consumo di ossigeno.In questo esperimento rappresentativo che mostra il consumo di ossigeno dei singoli pozzi, i pozzi sono stati caricati male, con il risultato di un livello di base molto basso di consumo di ossigeno e poca o nessuna risposta all'FCCP. In questo esperimento, la maggior parte dei pozzi ha dimostrato una significativa respirazione di base e una risposta ai farmaci. Tuttavia, due pozzi non mostravano alcuna risposta al rotenone, suggerendo che il farmaco non fosse stato correttamente rilasciato nel pozzo.Questi pozzi sono stati esclusi da ulteriori analisi. Qui, si possono osservare i risultati di un saggio di successo in cui i pozzi sono stati correttamente caricati con isolotti e correttamente iniettati con farmaci. È utile preparare i reagenti e le piastre il giorno prima di eseguire il saggio per consentire l'uso degli isolotti poco dopo essere stati isolati o ricevuti.Dopo il saggio, gli isolotti possono essere recuperati per l'estrazione di proteine o DNA per normalizzare i dati sul consumo di ossigeno o per quantificare il contenuto di DNA mitocondriale. La capacità di misurare la funzione mitocondriale in un piccolo numero di isolotti primati primari consente il test di più farmaci e altre manipolazioni in una singola replica biologica. Gli individui che lavorano con isolotti primati primari dovrebbero essere sicuri di essere addestrati nella manipolazione corretta e sicura con questi tessuti.In particolare, l'uso di adeguati dispositivi di protezione individuale e il corretto smaltimento di tali campioni.

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