Name: Mitrai NOG umanizzati per lesposizione allHIV intravaginale e il trattamento dellinfezione da HIV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Scopri come generare modelli murini NOG umanizzati per la ricerca preclinica sull'HIV. Questo protocollo permette di valutare ceppi virali e interventi terapeutici in vivo con precisione.

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Gli autori desiderano ringraziare il personale di Biomedicine Animal Facility dell'Università di Aarhus, in particolare la sig.ra Jani Kàr per la manutenzione delle cozioni e per il monitoraggio del peso dei topi. Gli autori desiderano ringraziare il professor Florian Klein per lo sviluppo di cART standard-of-care e per la guida. Il seguente reagente è stato ottenuto attraverso il NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat-11744) dal Dr. John Kappes e dalla dott.ssa Christina Ochsenbauer.

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<li>Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+HIV-1+Mucosal+Transmission+and+Prevention+in+Humanized+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice.</a> Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).</li>
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<li>Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+pre-exposure+prophylaxis+by+anti-retrovirals+raltegravir+and+maraviroc+protects+against+HIV-1+vaginal+transmission+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model.</a> PLoS ONE. 5 (12), 15257(2010).</li>
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<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+combinatorial+dsiRNAs+via+nanoparticles+efficiently+suppresses+HIV-1+infection+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice.</a> Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).</li>
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<li>Trecarichi, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+protective+effect+of+CCR5-Delta+32+heterozygosity+in+a+cohort+of+heterosexual+Italian+HIV-1+exposed+uninfected+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals.</a> AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).</li>
<li>Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geographic+spread+of+the+CCR5+%CE%9432+HIV-resistance+allele%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele.</a> PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).</li>
<li>Solloch, U. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequencies+of+gene+variant+CCR5-%CE%9432+in+87+countries+based+on+next-generation+sequencing+of+1.3+million+individuals+sampled+from+3+national+DKMS+donor+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers.</a> Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).</li>
<li>Ochsenbauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transmitted%2FFounder+HIV-1+Infectious+Molecular+Clones+and+Characterization+of+Their+Replication+Capacity+in+CD4+T+Lymphocytes+and+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages.</a> Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).</li>
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<li>Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+thermoregulatory+devices+used+during+anesthesia+of+C57BL%2F6+mice+and+correlations+between+body+temperature+and+physiologic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).</li>
<li>Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+engraftment+of+nonobese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficient+mice+with+human+CD34%2B+cells+transduced+by+a+self-inactivating+human+immunodeficiency+virus+type+1+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector.</a> Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).</li>
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<li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+function+of+human+innate+immune+cells+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interessi.

Lo sforzo murino gravemente immunocompromesso NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) è estremamente adatto per il trapianto di cellule e tessuti umani. Entrambe le vie immunitarie innate e adattativi in questi topi sono compromesse. I topi NOG e NSG ospitano una mutazionedi scied di Prkdc che si traduce nella funzione difettosa delle cellule T e B. Inoltre, questi topi non hanno un recettore funzionale dell'interleuchina-2 (catena gamma comune, IL2rg...

Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) è un'infezione cronica con più di 37 milioni di individui infetti in tutto il mondo1. La terapia antivirale combinata (cART) è una terapia salvavita, ma una cura è ancora giustificata. Pertanto, vi è la necessità di modelli animali che rispecchiano il sistema immunitario umano e le sue risposte al fine di facilitare la ricerca continua sull'HIV. Sono stati sviluppati diversi tipi di topi umanizzati che sono in grado di supportare l'innesto di cellule e tessuti trapiantando cellule umane in topi gravemente immunosensibili2. Tali topi umanizzati sono suscettibili all'infezione da HIV e forniscono un'importante alternativa ai modelli di virus immunodeficienza dei primati non umani, in quanto sono più economici e più semplici da usare rispetto ai primati non umani. I topi umanizzati hanno facilitato la ricerca sulla trasmissione virale dell'HIV, la patogenesi, la prevenzione e il trattamento3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Vi presentiamo un sistema modello umanizzato flessibile per la ricerca sull'HIV sviluppato trapiantando cellule staminali umane derivate dal sangue cordonale nei topi del NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) sfondo. Oltre ad essere di origine non fetale, la bioingegneria pratica di questi topi è meno tecnicamente impegnativa rispetto alle procedure microchirurgiche coinvolte nel trapianto del costrutto sangue-fegato-timo (BLT).
Mostriamo come stabilire l'infezione da HIV attraverso la trasmissione intravaginale e come monitorare il carico virale al plasma con una configurazione sensibile basata su PCR digitale (ddPCR) di goccia. Successivamente, descriviamo l'istituzione di cART standard somministrata come parte della dieta quotidiana del topo. L'obiettivo di questi metodi combinati è quello di ridurre lo stress per gli animali e facilitare esperimenti su larga scala in cui il tempo impiegato per la manipolazione di ogni animale è limitato a12.
Nell'uomo, un genotipo CCR5n. 32/wt o CCR5-32 provoca una ridotta suscettibilità all'infezione da HIV con virus del trasmettitore/fondatore13, e alcune precauzioni devono essere prese quando i topi bioingegnerizzati con cellule staminali ai fini degli studi sull'HIV. Ciò è particolarmente vero nella nostra regione perché le varianti naturali nel gene CCR5, in particolare le delezioni di 32 dollari, sono più diffuse nelle popolazioni indigene scandinave e baltiche rispetto al resto del mondo14,15. Pertanto, il nostro protocollo include un semplice test ad alto throughput per lo screening delle cellule staminali ematopoietiche dei donatori per le varianti CCR5 prima del trapianto.
Per l'esposizione intravaginale abbiamo scelto il virus R5 trasmettitore/fondatore RHPA4259, isolato da una donna in una fase precoce dell'infezione che è stata infettata intravaginalmente16. Abbiamo esposto i topi a una dose virale sufficiente a produrre una trasmissione di successo nella maggior parte dei topi, ma al di sotto di un tasso di trasmissione del 100%. La scelta di una dose di questo tipo consente una portata dinamica sufficiente nel tasso di trasmissione tale che gli effetti antivirali di un farmaco candidato possono provocare animali protetti negli esperimenti di prevenzione dell'HIV e una riduzione del carico virale per gli studi di trattamento.

<table><tbody><tr><td>Tampone blu</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td>Deve essere sterilizzato prima dell'uso</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7</td><td>BD Bioscience</td><td>557835</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (clone OKT3) FITC</td><td>Biolegend</td><td>317306</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (clone SK7) BUV395</td><td>BD Bioscience</td><td>564001</td><td></td></tr><tr><td>CD34 (clone AC136) FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-740</td><td></td></tr><tr><td>CD4 (clone SK3) BUV 496</td><td>BD Bioscience</td><td>564652/51</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (clone 2D1) APC</td><td>Biolegend</td><td>368511/12</td><td></td></tr><tr><td>CD8 (clone RPA-T8) BV421</td><td>BD Bioscience</td><td>562428</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix per sonde (no dUTP)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>10,02,95,21,000</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td>Per la miscela di tampone di sospensione</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbeccos (PBS)</td><td>Biowest</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Sangue del cordone ombelicale umano CD34 Kit di selezione positiva II</td><td>Stemcell</td><td>17896</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di lisi FACS 10X</td><td>BD</td><td>349202</td><td>Diluire 1:10 in dH20 immediatamente prima dell'uso</td></tr><tr><td>Provette FACS (Falcon 5 mL a fondo tondo)</td><td>Soluzione</td> di blocco del recettore Falcon <td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Fc (Human Trustain FcX)</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma</td><td>F8192-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v.10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Garza</td><td>Mesoft</td><td>157300</td><td>Deve essere sterilizzato prima dell'uso</td></tr><tr><td>Lampada</td><td></td><td></td> riscaldante <td></td></tr><tr><td>Ematocitometro su misura (B&uuml; rker-T&uuml; rk)</td><td>VWR</td><td>DOWC1597418</td><td></td></tr><tr><td>Gas isoflurano</td><td>Orion Pharma</td><td>9658</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20 citometro a flusso</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga, approvato PCR-PT</td><td>Sarstedt</td><td>72692405</td><td></td></tr><tr><td>Topo cART</td><td>sniff alimentare Spezialdi&auml; ten GmbH</td><td>Prodotto</td><td></td>su misura</tr><tr><td>Fermatore</td><td></td> per mouse <td>Prodotto</td><td></td>su misura</tr><tr><td>Ago, Microlancia 3, 30G &frac12; "</td><td>BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>NOG TOPI NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac</td><td>Taconic</td><td>NOG-F</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Sostanze chimiche VWR</td><td>436912C</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin 96 Kit di isolamento del DNA e dell'RNA del virus</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740691</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga approvate dalla PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.405</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina 100X</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II DNA polimerasi</td><td>Life Technologies</td><td>F549S</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, sterili, barriera ART 20P</td><td>ThermoScientific</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>proteinasi K</td><td>NEB 100005398</td><td></td><td></td></tr><tr><td>software QuantaSoft</td> Generatore <td>di gocce Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QX100 Lettore</td> di gocce <td>Bio-Rad</td><td>1886-3008</td><td></td></tr><tr><td>QX100</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di lisi dei globuli rossi</td><td>Biolegend 420301</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAsi privo di RNasi dimensione F + tampone di reazione</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740963</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Inibitore ribonucleasi ricombinante</td><td>ThermoScientific</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biowest</td><td>L0501-500</td><td>Dissolvere in H20</td></tr><tr><td>Softject 1 mL siringa</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010-200V0</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Trascrittasi inversa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>VWR</td><td>89370-910</td><td></td></tr><tr><td>Blu tripano</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapuro 0,5 EDTA, pH 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Virkon S (disinfettante virale)</td><td>Dupont</td><td>Codice: 7511</td><td></td></tr></tbody></table>

mitrai nog umanizzati per l'esposizione all'hiv intravaginale e il trattamento dell'infezione da hiv

Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection

I topi umanizzati forniscono una piattaforma sofisticata per studiare la virologia del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) e per testare i farmaci antivirali. Questo protocollo descrive la creazione di un sistema immunitario umano nei topi NOG adulti. Qui, spieghiamo tutti i passaggi pratici dall'isolamento delle cellule CD34 umane derivate dal sangue del cordone ombelicale e il loro successivo trapianto endovenoso nei topi, alla manipolazione del modello attraverso l'infezione da HIV, alla terapia antiretrovirale combinata ( cART), e il campionamento del sangue. Circa 75.000 cellule hCD34 vengono iniettate per via endovenosa nei topi e il livello di chimerismo umano, noto anche come umanizzazione, nel sangue periferico è stimato longitudinalmente per mesi dalla citometria di flusso. Un totale di 75.000 cellule hCD34 produce cellule CD45 per un totale di 75.000 hCD34 nel sangue periferico. I topi sono suscettibili all'infezione intravaginale da HIV e il sangue possono essere campionati una volta alla settimana per l'analisi e due volte al mese per periodi prolungati. Questo protocollo descrive un saggio per la quantificazione del carico virale al plasma utilizzando la PCR digitale delle goccionelline (ddPCR). Mostriamo come i topi possono essere trattati efficacemente con un regime cART standard-of-care nella dieta. La consegna di cART sotto forma di chow topo regolare è un significativo affinamento del modello sperimentale. Questo modello può essere utilizzato per l'analisi preclinica di composti di profilassi pre-esposizione sia sistemici che topici, nonché per testare nuovi trattamenti e strategie di cura dell'HIV.

La strategia di gating per l'analisi della purezza delle cellule staminali è illustrata nella Figura 1. Figura 1A-C mostra la popolazione PURificata CD34 e Figura 1D– F il CD34- flow-through utilizzato per illustrare che la quantità minima della popolazione CD34 è perso nel processo di isolamento. La purezza delle cellule staminali isolate CD34 è stata tra l'85%-95% con meno dell'1% di contaminazion...

Abbiamo sviluppato un protocollo per la generazione e la valutazione di un modello murino NOG infettato da virus dell'immunodeficienza umana e umile basato sul trapianto di cellule staminali, sull'esposizione al virus dell'immunodeficienza umana intravaginale e sull'RNA PCR digitale a goccia e droplet Quantificazione.

Mitrai NOG umanizzati per l'esposizione all'HIV intravaginale e il trattamento dell'infezione da HIV

Humanized mice provide a sophisticated platform to study human immunodeficiency virus (HIV) virology and to test antiviral drugs. This protocol describes ...

Stabilire questo modello di topo umanizzato può aiutare negli studi preclinici sulla ricerca sull'HIV. Ad esempio, è possibile valutare sia diversi ceppi virali che nuovi interventi sull'HIV. Questi protocolli possono essere utilizzati per valutare lo stato della variante CCR5 del donatore di cellule staminali e per infettare in modo efficiente i topi umanizzati con HIV e per quantificare i carichi virali del plasma di topo.Il protocollo di quantificazione dell'RNA può essere facilmente adattato per quantificare qualsiasi sequenza di RNA virale di scelta rilevabile nei campioni di plasma. Per lo screening genetico di campioni di sangue del cordone ombelicale per le varianti CCR5 delta 32, incubare 1,25 microlitri di flusso non pelletato con 11,25 microlitri di miscela PCR contenenti 200 mix di dNTP micromolare, 0,01 unità per microlitro di DNA polimerasi ad alta fedeltà e primer avanti e indietro come descritto nella tabella. Regolare il volume con acqua priva di nucleasi a circa 12,5 microlitri per ogni reazione PCR e amplificare i frammenti genomici con il programma di ciclismo PCR come indicato nella tabella.Al termine della reazione, separare i prodotti PCR su un gel di agarosio al 2%. I prodotti PCR degli alleli di tipo selvaggio e gli alleli delta 32 producono frammenti PCR rispettivamente di 196 coppie di basi e 164 coppie di basi, rendendo le bande facilmente distinguibili per elettroforesi in gel. Per l'esposizione all'HIV intravaginale, posizionare una lampada riscaldante focalizzata sul centro dello spazio di lavoro in cui si trova il mouse e posizionare punte sterili di pipetta da 20 microliter in una pipetta appropriata nel cofano.Posizionare un contenitore con disinfettante liquido nella cappa per l'inattivazione immediata di tutti i materiali e liquidi che sono stati a contatto con il virus. Posizionare il mouse anestetizzato su un cuscinetto blu sterile nella posizione supina sotto la lampada con la coda del mouse rivolta verso la parte posteriore del cappuccio e confermare la mancanza di risposta al riflesso del pedale nel mouse. Afferrare l'animale alla base della coda.Sollevando delicatamente il mouse dalla base della coda, sostenere l'animale in posizione verticale capovolta. Utilizzare una punta sterile per stimolare l'area genitale con un delicato accarezzare verso l'ano per indurre lo svuotamento del retto e alleviare la pressione sulla vagina. Per esporre l'apertura vaginale, avvolgere con cura la coda del mouse sulle dita, in modo che la vulva si apra naturalmente.Utilizzando una nuova punta di pipetta, posizionare la punta a livello dell'apertura vaginale e rilasciare atraumaticamente 20 microlitri del virus nella vagina, consentendo alla gravità di tirare la sospensione virale nella vagina. Una volta che tutto il virus è stato consegnato, conservare il mouse in questa posizione per cinque minuti per evitare perdite indotte dalla gravità del virus. Quindi, riportare con attenzione il mouse nella sua gabbia di casa in posizione supina e monitorare fino al completo recupero.Per isolare l'RNA dai campioni di plasma di topo scongelati, utilizzare un kit di isolamento dell'RNA virale secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere il campione che si lega alla colonna e aggiungere una fase di trattamento della DNasi su colonna per garantire la rimozione di tutto il DNA all'interno del campione plasmatico. Quindi conservare i campioni di RNA a 80 gradi Celsius per almeno un'ora.Per sintetizzare il cDNA, utilizzare la transcriptasi inversa secondo i protocolli standard, inclusi 0,5 microlitri di un inibitore della RNasi all'interno della reazione cDNA per evitare la degradazione dell'RNA, quindi eseguire la sintesi cDNA come descritto nella tabella e conservare i campioni di cDNA a 80 gradi Celsius per almeno un'ora. Per preparare i campioni per ddPCR, mescolare 11 microlitri di miscela di reazione della sonda ddPCR contenente polimerasi e dNTP con 250 nanomolari di sonda legante a scanalatura minore e 900 nanomolari di ciascuno dei primer avanti e indietro, come indicato nella tabella. Aggiungere tre microlitri di ogni campione di cDNA e regolare i volumi totali di PCR a 22 microlitri con acqua priva di nucleasi.Utilizzare olio di generazione di goccioline per sonde su un generatore di goccioline secondo il protocollo del produttore per emulsionare le miscele PCR. Quindi eseguire il programma PCR come descritto nella tabella. Per il trattamento cART dopo l'infezione da HIV confermata, nutrire i topi con pellet preparati da un fornitore esterno contenente un regime cART standard, come indicato nella tabella.Usa una dieta cART di colore rosso per distinguerlo facilmente dal normale chow di topo e usa una dieta di controllo chow senza cART in un colore marrone standard. Per l'inizio del trattamento, posizionare la dieta chow contenente cART in gabbie sterili prima di trasferire i topi dalla vecchia gabbia alla nuova gabbia. Quindi monitorare i pesi dei topi e controllare il consumo di chow contenente cART ogni giorno per assicurarsi che i topi si adattino al cambiamento.Qui viene descritta la strategia di gating citometrica del flusso per l'analisi della purezza delle cellule staminali, con la purezza delle cellule staminali positive isolate CD34 che in genere vanno dall'85 al 95% con una contaminazione cellulare inferiore all'1%T. L'analisi PCR dimostra lo stato variante CCR5 delle cellule staminali donatrici purificate, rendendo facilmente identificabili i donatori eterozigoti CCR5 delta 32. La frequenza del genotipo mutante in un gruppo di 19 donatori era di circa il 15,8% in accordo con studi epidemiologici più grandi sulle popolazioni scandinave.Da tre a cinque mesi dopo il trasferimento adottivo di 7,5 volte 10 alla 4a cellule positive del CD45 umano nei topi riceventi, dal 20 al 50% dei globuli bianchi recuperati da campioni di sangue periferico animale ricevente sono cellule positive CD45 umane e i topi avranno sviluppato cellule B e T umane. Il 64% dei topi viene infettato dall'HIV a seguito dell'esposizione vaginale come dimostrato. Quattro settimane dopo il passaggio a una dieta di 40 giorni contenente cART standard, i carichi virali nei topi sieropositivi diminuiscono al di sotto del limite di rilevamento.Dopo la cessazione della dieta, il virus rimbalza, rispecchiando i dati clinici. È importante sottolineare che i topi su cART tollerano bene il cambiamento nella dieta. È fondamentale ricordare che questi animali sono immunodifesa e quindi vulnerabili all'ambiente.L'adesione alle tecniche asettiche aumenterà la salute generale degli animali e il successo del protocollo. Dopo l'istituzione della coorte di topi umanizzata per l'infezione da HIV, il protocollo può essere adattato per la quantificazione dell'RNA virale nei tessuti o per testare nuovi interventi in diversi ceppi virali. La flessibilità e l'accessibilità dei topi umanizzati per gli studi sulle infezioni da HIV hanno permesso progressi critici nella virologia, nell'immunologia e nella ricerca terapeutica dell'HIV.Prima di tentare protocolli riguardanti l'HIV infettivo, assicurarsi di ottenere l'approvazione dei funzionari locali dell'ambiente di lavoro e di aderire alle procedure di decontaminazione approvate.

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Immunologia e Infezioni

Questo video mostra un test per valutare l'efficacia della terapia antiretrovirale combinata orale (cART orale) in un modello murino umanizzato infetto da virus dell'immunodeficienza umana-1 (HIV-1). Una combinazione di farmaci che hanno come bersaglio l'HIV-1, tra cui gli inibitori nucleosidici della trascrittasi inversa e gli inibitori del trasferimento del filamento dell'integrasi, viene somministrata insieme a un integratore alimentare e antibiotici. A seguito del consumo di questa miscela...

Terapia antiretrovirale combinatoria orale per il trattamento dell'infezione da HIV-1 in un modello murino umanizzato

Il video dimostra una tecnica per generare un modello murino umanizzato con immunità ingegnerizzata basata su cellule staminali contro il virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Il tessuto del timo fetale umano e le cellule staminali ematopoietiche (HSC) ingegnerizzate vengono impiantate nella capsula renale di un topo gravemente immunocompromesso. Le HSC, che esprimono i recettori chimerici dell'antigene (CAR) contro l'HIV, sono mescolate in una miscela proteica gelatinosa che ne promuove la...

Costruzione di un modello murino umanizzato con immunità ingegnerizzata contro l'HIV

Questo protocollo descrive i metodi per costruire un modello murino umanizzato di midollo osseo/fegato/timo con immunità ingegnerizzata basata su cellule staminali contro l'infezione da HIV.

Cellule staminali base Immunità Engineered contro l&#39;infezione da HIV nel modello umanizzato mouse

Questo protocollo fornisce un metodo per stabilire topi umanizzati (hu-NSG) tramite iniezione intraepatica di cellule staminali ematopoietiche umane nella radiazione-condizionato topi NSG neonatali. Il mouse di hu-NSG è suscettibile di infezione da HIV e combinatorio antiretrovirale di combinazione (cART) e serve come un modello fisiopatologico adatto per le indagini di replica e la latenza di HIV.

Umanizzato NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) Mouse modello per studi di latenza e di replicazione dell'HIV

Questo protocollo fornisce un metodo affidabile per stabilire topi umanizzati sia con il sistema immunitario umano che con le cellule epatiche. I topi immunodeficienti contemporanei ricostituiti ottenuti tramite iniezione intrasplessica di epotociti umani e CD34- cellule staminali ematopoietiche sono suscettibili di infezione da virus immunodeficienza umana-1 e ricapitolano i danni al fegato osservati pazienti affetti da HIV.

Istituzione del modello murino TK-NOG dualizzato per la patogenesi del fegato associata all'HIV

Qui sono descritti tre approcci sperimentali per studiare la dinamica dell'infezione da HIV nei topi umanizzati. Il primo consente lo studio di eventi di infezione cronica, mentre i due ultimi consentono lo studio di eventi acuti dopo l'infezione primaria o la riattivazione virale.

Infezione da HIV cronica, acuta e riattivata in modelli di topo immunodeficienti umanizzati

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per somministrare farmaci antiretrovirali combinati orali che sopprimono con successo la replicazione dell'RNA dell'HIV-1 nei topi umanizzati.

Trattamento antiretrovirale combinato orale in topi umanizzati infetti da HIV-1

Questo protocollo descrive come la combinazione dell'infezione da EcoHIV con topi Tmem119-EGFP offra un prezioso sistema biologico per studiare le alterazioni microgliali e i serbatoi virali in modelli di roditori di disturbi neurocognitivi associati all'HIV.

Identificazione di cellule infette da EcoHIV in topi transgenici manipolati con microglia

Questo esperimento viene visualizzata una guida per l'utilizzo fluorescente un clone molecolare di HIV per vivere esperimenti di imaging confocale.

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

Tropismo dell'HIV può essere dedotta dalla regione V3 della busta virale. V3 è amplificato mediante PCR in triplice copia tramite nested RT-PCR, in sequenza, e interpretato utilizzando il software bioinformatico. I campioni con con sequenza di 1 o più (s) con punteggi bassi G2P sono classificati come non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Scopri come generare modelli murini NOG umanizzati per la ricerca preclinica sull'HIV. Questo protocollo permette di valutare ceppi virali e interventi terapeutici in vivo con precisione.

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